Coltura rapida di melanociti murini primari e fibroblasti: isolamento di melanociti e fibroblasti da un campione di pelle intera murina

- La pelle è costituita da varie cellule che popolano i suoi diversi strati. I melanociti, le cellule produttrici di melanina, si localizzano alla giunzione epidermico-dermica, mentre i fibroblasti, le cellule che generano il tessuto connettivo, risiedono nel derma.

Per isolare rapidamente melanociti e fibroblasti, inizia prendendo la proboscide di un cucciolo di topo soppresso. Tagliare la pelle ventralmente per tutta la lunghezza del tronco. Staccare la pelle contenente lo strato epidermico e dermico e tritare il tessuto in piccoli pezzi.

Ora, trattare con un tampone digestivo contenente tripsina e collagenasi enzimi che degradano la matrice extracellulare, rilasciando le cellule in sospensione. Centrifugare per pellettizzare le celle e scartare il surnatante. Risospendere le cellule in un terreno melanocitario e trasferire la sospensione in una piastra multipozzetto.

Durante la coltura, la maggior parte dei fibroblasti aderisce al fondo del pozzetto, mentre i melanociti e le altre cellule epidermiche rimangono in sospensione. Aspirare le cellule sospese e aggiungere terreni specifici per i fibroblasti alla coltura dei fibroblasti per favorirne la crescita. Trasferire la sospensione aspirata in un pozzetto fresco rivestito di collagene per favorire la formazione di una coltura aderente.

Integrare con geneticina, un antibiotico, e aggiungere nuovi terreni di crescita dei melanociti. La geneticina elimina selettivamente tutti i fibroblasti rimanenti, mentre il terreno promuove la crescita dei melanociti rispetto ad altri tipi di cellule epidermiche. Nel seguente protocollo, isoleremo melanociti e fibroblasti dalla pelle del cucciolo murino.

- In una cappa a flusso laminare, arrotolare brevemente il tronco di ciascun topo soppresso in una capsula di Petri sterile contenente il 70% di etanolo. Togliete il topo dall'etanolo e mettetelo in una capsula di Petri sterile vuota. Successivamente, sterilizzare le forbici chirurgiche in etanolo al 70%. Usa queste forbici per praticare un'incisione nella pelle sul lato ventrale del tronco, partendo dal collo e proseguendo fino alla coda. Usando una pinza sterile, staccare la pelle dal tronco del topo e rimuovere il tessuto adiposo in eccesso dal lato dermico della pelle.

Mettere la pelle, con il derma rivolto verso il basso, in un piatto a 6 pozzetti contenente 3 millilitri di soluzione antibiotica/antimicotica 1x. Incubare a temperatura ambiente per 2 o 3 minuti. Quindi, accendi il tritatutto e regola le impostazioni su quelle mostrate qui.

- Prestare attenzione durante l'installazione della lama del tritatutto e durante il funzionamento della macchina.

- Trasferire la pelle, con il derma rivolto verso il basso, in un tritatutto sterile e passare la pelle completamente attraverso il tritafazzoletti tre volte. Successivamente, trasferire la pelle omogeneizzata in una provetta conica sterile da 15 millilitri contenente 3 millilitri di tampone per la digestione della pelle.

Utilizzando una micropipetta P1000, miscelare la sospensione risultante pipettando energicamente su e giù da dieci a quindici volte. Tappare la provetta conica e incubare il campione a bagnomaria a 37 gradi Celsius per 15 minuti, assicurandosi di capovolgere la provetta ogni 3-5 minuti.

Quindi, centrifugare la provetta in un rotore a secchiello oscillante a 750 x g a temperatura ambiente per 5 minuti per pellettare le cellule nell'omogeneizzato cutaneo. Utilizzare una micropipetta P1000 per rimuovere lentamente e completamente il tampone di digestione della pelle, facendo attenzione a non disturbare il pellet.

- Assicurati di aspirare tutto il tampone per il digestato della pelle. In caso di problemi, lavare il pellet cellulare con 2 o 3 millilitri di terreno melanocitario e ripetere la centrifugazione e rimuovere il tampone di digestione cutanea in eccesso.

- Quindi, risospendere accuratamente il pellet cellulare in 1 millilitro di terreno melanocitario pipettando su e giù da quindici a venti volte con una pipetta P1000. Trasferire la soluzione cellulare risultante goccia a goccia in un pozzetto non rivestito in un piatto a 6 pozzetti che contiene 1 millilitro di terreno melanocitario. Incubare l'omogeneizzato di pelle placcato in un incubatore di coltura tissutale a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 40 minuti.

Successivamente, trasferire il surnatante di coltura dal piatto non rivestito a un pozzetto di un piatto a 6 pozzetti rivestito di collagene prelavato. Aggiungere G418 al terreno in modo tale che la concentrazione finale sia di 100 nanogrammi per millilitro. Aggiungere 2 millilitri di terreno di coltura per fibroblasti in un pozzetto della piastra non rivestita, che ora contiene fibroblasti aderenti. Incubare entrambe le colture per una notte in un incubatore per colture tissutali a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.

Dopo 16-24 ore di incubazione, aspirare separatamente il terreno e gli eventuali detriti di ciascuna coltura. Lavare ogni piatto due volte, utilizzando 1 millilitro di PBS per ogni lavaggio. Quindi, aggiungere 2 millilitri di terreno di coltura di melanociti freschi alla coltura di melanociti e aggiungere 2 millilitri di terreno di coltura di fibroblasti freschi alla coltura di fibroblasti.