Modificazione genetica dei cheratinociti umani primari: un metodo per manipolare geneticamente i cheratinociti utilizzando retrovirus ricombinanti

- I cheratinociti sono il tipo di cellula prominente presente nell'epidermide o nello strato più esterno della pelle. Per modificare geneticamente i cheratinociti, inizia con una coltura di cellule fenice di imballaggio retrovirale. Successivamente, aggiungere una miscela contenente vettori retrovirali che trasportano il gene di interesse e un reagente di trasfezione. Incubare la piastra per il tempo desiderato.

Il reagente di trasfezione facilita la consegna di materiale genetico virale nelle cellule di confezionamento. Queste cellule specificamente progettate codificano le proteine necessarie per la produzione di capside retrovirale e promuovono l'impacchettamento dell'RNA vettore retrovirale che trasporta il gene di interesse. Dopo l'imballaggio, i virus maturi escono dalle cellule nel terreno. A questo punto, trasferire il terreno sospeso dal virus in una piastra di coltura fresca contenente cheratinociti primari. Aumentare la coltura con una soluzione polimerica cationica desiderata.

Il polimero cationico neutralizza le cariche negative sulle membrane virali e dei cheratinociti, aumentando l'efficienza della fusione virale con la superficie cellulare. Dopo la fusione, il virus rilascia il suo RNA nel citoplasma cellulare, che si trascrive inversamente in DNA a doppio filamento. Questo DNA virale entra nel nucleo e si integra con il genoma dei cheratinociti, portando ad alterazioni genetiche. Nel seguente protocollo, mostreremo la modificazione genetica dei cheratinociti umani primari mediante trasfezione retrovirale.

- Il giorno prima della trasfezione, seminare le cellule fenice in un terreno completo in una piastra a 6 pozzetti a una densità di 800.000 cellule per pozzetto. Il giorno della trasfezione, mescolare 6 microlitri di reagente di trasfezione con 100 microlitri di DMEM per ogni pozzetto da trasfettare e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Aggiungere la miscela in una provetta contenente 3 microgrammi di vettore retrovirale per ogni pozzetto da trasfettare e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Aggiungere l'intera miscela goccia a goccia in ciascun pozzetto delle cellule della fenice e incubare le cellule durante la notte.

Il giorno dopo la trasfezione, rimuovere il terreno dalle cellule phoenix e aggiungere 2 millilitri di terreno completo fresco. Lo stesso giorno, risospendere i cheratinociti umani primari in terreno privo di siero di cheratinociti con antibiotici e seminare in piastre a 6 pozzetti a una densità di 75.000 cellule per pozzetto.

Il giorno seguente, raccogli il terreno, che ora contiene particelle virali dalle cellule della fenice trasfettate. Passare il mezzo attraverso un filtro da 0,45 micron utilizzando una siringa per rimuovere eventuali cellule contaminanti. Aggiungere 5 microgrammi per millilitro di bromuro di esadimetrina al terreno filtrato contenente il virus per aiutare a mediare il processo di infezione.

Quindi, pipettare 2 millilitri di virus sui cheratinociti placcati il giorno precedente. Quindi, centrifugare le piastre a 6 pozzetti in una centrifuga a 200 x g per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo la centrifuga, rimuovere ed eliminare il supporto contenente il virus. Lavare le celle una volta con 1x PBS e poi aggiungere KCSFM fresco. Il giorno seguente, infettare lo stesso lotto di cheratinociti con il virus utilizzando la procedura appena mostrata.