Imaging differenziale delle strutture biologiche con Doppiamente-risonanza coerente Anti-Stokes scattering Raman (CARS)

Una combinazione di tre singola lunghezza d'onda a breve impulsi laser viene utilizzato per generare coerente anti-Stokes scattering Raman (CARS) e doppiamente AUTO-risonante (DR-CARS). La differenza tra questi segnali fornisce maggiore sensibilità perché altrimenti difficili da individuare coerenti segnali Raman, che consente l'imaging di debole dispersori Raman.

Questo video mostra una procedura per condurre l'imaging differenziale di due risonanze di ramen associate a strutture biologiche con segnali coerenti di diffusione del ramen. I primi tre laser a impulsi corti sincronizzati sono sovrapposti nel tempo e nello spazio. Gli impulsi sovrapposti vengono quindi inviati a un microscopio invertito standard, che consente la generazione di segnali di ramen coerenti da oggetti microscopici.

I segnali vengono convertiti in immagini utilizzando software commerciali per confrontare i diversi segnali di ramen prodotti. I risultati indicano che la differenza tra le immagini ottenute da segnali di ramen doppiamente risonanti e singolarmente fornisce una maggiore sensibilità per i segnali deboli del ramen. Ciao, sono Tyler Weeks del Center for Bio Photonics dell'Università della California Davis.

Sono Thomas ER del Center for Bio Photonics e del Dipartimento di Medicina Interna dell'Università della California Davis. Oggi vi mostreremo una procedura per l'utilizzo dello scattering di ramen antis stokes a doppia risonanza coerente per produrre immagini chimicamente specifiche di cellule. Utilizziamo questa procedura per rilevare segnali da molecole che sono troppo deboli per essere rilevate direttamente dalla sola spettroscopia coerente antis Stokes Ramon.

Quindi iniziamo: per generare contemporaneamente il segnale delle auto e delle auto Dr, sono necessarie tre sorgenti laser a impulsi brevi sintonizzabili e sincronizzate per ottenere questi impulsi sincronizzati. Inizia con un singolo laser a impulsi brevi con una potenza di uscita di 10 watt. Una lunghezza d'onda fissa di 1064 nanometri, una lunghezza dell'impulso fissa di sette picosecondi e una frequenza di ripetizione fissa di 76 megahertz.

Utilizzando una serie di piastre a semionda e cubi divisori di fascio polarizzanti, il raggio viene diviso in tre parti. Una piastra intermedia combinata con un cubo divisore di fascio polarizzatore consente di regolare la quantità di potenza in ciascun componente del fascio senza cambiarne la direzione. In genere, due raggi vengono regolati a circa 4,5 watt ciascuno e il terzo raggio contiene il restante watt.

I due fasci ad alta potenza vengono quindi diretti in due oscillatori parametrici ottici indipendenti o OPO. Gli OPO utilizzano una diversa generazione di frequenze per convertire un fotone ad alta energia in due fotoni a bassa energia con lunghezze d'onda diverse. Controllando la temperatura del cristallo utilizzato per ottenere questo effetto, le lunghezze d'onda dei fotoni risultanti possono essere controllate con una precisione di 0,1 nanometri.

Raddoppiando la frequenza di questi segnali, un laser con una lunghezza d'onda fissa di 1064 nanometri può ora essere trasformato in un raggio laser che può essere sintonizzato ovunque tra 780 nanometri e 910 nanometri pompando due OPO separati con la stessa sorgente di 1064 nanometri. Si ottengono due sorgenti laser sintonizzabili in modo indipendente che vengono sincronizzate automaticamente con il nostro laser a pompa originale. Il terzo raggio del laser a pompa a 1064 nanometri è diretto attorno agli OPO da una combinazione di specchi dielettrici in modo che tutti e tre i raggi possano essere ricombinati in seguito.

Al fine di produrre in modo efficiente fotoni di segnale ramen coerenti, gli impulsi ricombinati devono essere sovrapposti sia temporalmente che spazialmente perché gli OPO contengono cavità ad anello che consentono a ciascun impulso laser di passare attraverso il cristallo più volte che il raggio inviato attraverso gli OPO percorre una distanza in più, con conseguente notevole ritardo rispetto al raggio della pompa originale. Questa distanza deve essere compensata con un terzo raggio introducendo specchi extra che costringono questo raggio a percorrere la stessa distanza degli altri due prima di essere ricombinati utilizzando specchi dicroici per fornire una regolazione fine della lunghezza del percorso. Ogni raggio viene inviato attraverso stadi di ritardo regolabili, che consentono la regolazione della sovrapposizione temporale dei diversi impulsi laser.

A ciascun raggio viene aggiunto un altro set di piastre intermedie e cubi divisori di fascio polarizzatori per consentire la regolazione della potenza laser di ciascun raggio in modo indipendente. Gli specchi dicroici vengono utilizzati per combinare prima i raggi dei due OPO, quindi è necessario prestare attenzione al fascio di 1064 nanometri per garantire che i raggi siano sovrapposti con precisione nello spazio. Ciò può essere verificato confrontando la sovrapposizione dei raggi entro pochi centimetri dallo specchio dicroico con quelli a circa un metro dallo specchio dicroico.

Poiché l'esposizione a raggi laser ad alta potenza media può danneggiare il campione, i tre fasci combinati vengono inviati attraverso un modulatore ottico elettrico che funge da selettore di impulsi, che consente di regolare la frequenza di ripetizione degli impulsi che arrivano al campione, e quindi la potenza media. I raggi laser combinati vengono quindi accoppiati in un microscopio invertito con una lente dell'obiettivo con un'elevata apertura numerica o na. La messa a fuoco compatta generata dall'obiettivo ad alta NA consente la generazione più efficiente di segnali ramen coerenti su scale di lunghezza microscopiche.

La lente dell'obiettivo del microscopio è montata su uno stadio pizo X, Y, Z, che consente di ottenere immagini mediante scansione raster dei fasci attraverso il campione, in modo simile ai microscopi confocali a scansione del fascio commerciale. Ora vediamo come generare i segnali delle auto e D-R-F-W-M: l'interazione di tre raggi laser a impulsi brevi sul campione si traduce nella generazione di diversi segnali di miscelazione a quattro onde come le automobili dalle varie combinazioni di due laser, così come i segnali delle auto a tre colori e delle auto DR dalla combinazione di tutti e tre i laser. Quando i segnali sono relativamente vicini in lunghezza d'onda, può essere difficile separarli per l'analisi.

Per questo motivo, i segnali vengono passati in uno spettrometro di imaging che funge anche da monocromatore o filtro passa-banda per separare spazialmente i segnali a diverse lunghezze d'onda. Uno specchio ribaltabile azionato elettronicamente all'interno dello spettrometro in posizione abbassata invia il segnale a un dispositivo accoppiato di carica a svuotamento profondo retroilluminato o a una telecamera CCD, che fornisce informazioni spettroscopiche sull'intera gamma del segnale e ci consente di identificare e ottimizzare i vari segnali robin coerenti per selezionare il segnale da riprendere. È sufficiente ruotare la gradazione all'interno dello spettrometro utilizzando il software di controllo e acquisizione dati fornito dal fornitore per centrare il picco di interesse sulla telecamera CCD.

Quindi modificare la posizione dello specchio ribaltabile per reindirizzare il segnale a una seconda porta di uscita a cui è collegato un DDE DDE o un PD con un singolo fotone che conta fotoni. Raster. Scansiona la lente dell'obiettivo e quindi utilizza i segnali registrati sull'A PD per generare un'immagine visualizzando la velocità di conteggio dei fotoni per ciascun pixel con il software di acquisizione dati. Ripetere questa procedura di imaging per ogni segnale di ramen coerente desiderato in modo che i segnali possano essere confrontati durante la post-elaborazione.

Vediamo ora come preparare correttamente un campione in modo da ottenere immagini chiare e riproducibili. È necessario prestare una certa attenzione nella preparazione dei campioni. I campioni vengono generalmente preparati su vetrini di vetro spessi circa 150 micron.

Questi vetrini coprioggetti sono abbastanza sottili da consentire l'imaging ad alta risoluzione con le lenti dell'obiettivo ad immersione in acqua o olio ad alta NA utilizzate in questi esperimenti. Per dimostrare la preparazione di un campione tipico, prepariamo sezioni spesse circa 20 micron di tessuto muscolare di topo che vengono fissate a un vetrino da microscopio. Al campione viene aggiunta una gocciolina da 20 microlitri di soluzione di glucosio deuterato a cinque molari.

La soluzione di glucosio deuterato fornisce una firma di fondo ramen unica e forte. Un vetrino coprioggetto viene posizionato sopra il campione e fissato in posizione con smalto per unghie per cellule e coltura. È possibile utilizzare piastre di coltura con fondo in vetro che consentono l'imaging senza la necessità di staccare le cellule dalle piastre di crescita cellulare.

Ora vediamo come determinare il rum e i picchi corretti per le auto Dr. Per sfruttare correttamente l'effetto di potenziamento doppiamente risonante, è necessario conoscere gli spettri del ramen di entrambe le sostanze risonanti del ramen. Tipicamente, questi sono 2.845 centimetri inversi associati ai lipidi e 2.121 centimetri inversi per la modalità di allungamento CD associata al glucosio deuterato.

La diffusione coerente del ramen si ottiene quando la differenza di frequenza tra due laser corrisponde alla frequenza di una vibrazione molecolare. Sintonizzando un OPO a 817 nanometri, sonderà la modalità C a 2.845 centimetri inversi se combinata con il raggio laser a 1064 nanometri, e sintonizzando l'altro OPO a 868 nanometri, sonderà il centimetro inverso a 2.121 se combinato con il raggio a 1064 nanometri. In modalità spettroscopica, il microscopio dell'auto ci consente di osservare tre segnali coerenti di ramen di interesse, un segnale dell'auto che sonda la vibrazione di allungamento CH, un segnale dell'auto che sonda la modalità di allungamento del CD e un segnale dell'auto DR che sonda entrambi nel diagramma mostrato qui, le frecce tratteggiate indicano i fotoni del laser negli OPO e le frecce piene indicano il segnale risultante.

Le linee orizzontali continue indicano l'energia della vibrazione del ramen e danno una rappresentazione visiva che nelle auto DR mescolando gli stessi tre fotoni in ingresso sonda contemporaneamente due diverse vibrazioni del ramen. La potenza del segnale per ogni picco dovrà essere ottimizzata sintonizzandosi a passi fini intorno a queste posizioni di picco. Qui selezioniamo ogni picco e scattiamo immagini di vermi elgani di mare in una soluzione di glucosio declassato, l'estrazione di informazioni aggiuntive basate su queste tre immagini ottenute individualmente richiede un'elaborazione delle immagini abbastanza semplice.

Innanzitutto, le immagini devono essere normalizzate. Un metodo pratico per la normalizzazione si basa sul fatto che i lipidi sono idrofobici. Ciò significa che nelle regioni di lipidi ad alta densità, la risonanza CD del glucosio dovrebbe contribuire molto poco al segnale di doppia risonanza.

Al contrario, nelle regioni di soluzione di glucosio puro, anche le risonanze CH dei lipidi dovrebbero contribuire molto poco. Con questo in mente, normalizzare l'immagine dell'auto DR e l'immagine dell'auto ottenuta sulla risonanza CD della soluzione di glucosio deuterato in una regione ben al di fuori del verme di CL egan che non dovrebbe mostrare risonanza CH. Quindi, identifica una regione all'interno del verme nell'immagine dell'auto risonante CH che è ricca di lipidi e normalizzala nella regione corrispondente all'interno dell'immagine normalizzata dell'auto DR.

Affinché questo metodo funzioni correttamente, si supponga che in profondità all'interno di questa regione non sia presente glucosio deuterato. Questa è un'ipotesi sicura poiché i lipidi sono idrofobici e non si mescolano con la soluzione. Ora, sottraendo l'immagine normalizzata dell'auto risonante CH dall'immagine normalizzata dell'auto DR, solo il segnale risonante CD amplificato rimane in modo simile sottraendo l'immagine normalizzata dell'auto risonante CD dall'immagine normalizzata Dr.FWM.

Qui viene mostrato solo il segnale di risonanza ch amplificato che è lo spettro ramen per un acido oleico modificato che include una modifica alchina, le forti risonanze CH a 2, 845 centimetri inversi e la risonanza alpina a 2, 121 centimetri inversi sono entrambe ben isolate dalla regione dell'impronta digitale, che è la regione dei picchi densamente impacchettati, rendendoli marcatori ideali per l'imaging coerente del ramen. Questo è uno spettro tipico di segnali di ramen coerenti generati quando tre laser a impulsi brevi vengono sovrapposti all'interno del campione. Le frecce puntano ai processi responsabili di ciascun segnale come rappresentato dai diagrammi energetici.

Questi sono i risultati tipici dell'imaging dei vermi di C Elgin utilizzando auto e auto DR. La riga superiore utilizzava i tre segnali appena mostrati per visualizzare un verme in una soluzione di glucosio declassato. Nella seconda riga, le immagini sono state opportunamente normalizzate e nella terza riga sono state prodotte le immagini delle differenze Sottraendo ciascuna delle immagini dell'auto dall'immagine dell'auto DR, ti abbiamo appena mostrato come eseguire l'imaging delle differenze Raman basato sulla microscopia antis Raman coerente a doppia risonanza.

Quando si esegue questa procedura, ricorda, è importante assicurarsi che le travi siano sovrapposte e sincronizzate correttamente. Inoltre, quando si passa da un segnale coerente all'altro, assicurarsi di non urtare o spostare il campione in quanto ciò influirà sull'analisi. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.