Piattaforma di imaging ottico multimodale per lo studio del metabolismo cellulare

La nostra ricerca prevede l'utilizzo del nostro microscopio multimodale per misurare le differenze molecolari e metaboliche in diverse patologie e visualizzarne l'eterogeneità spaziale. L'approccio multimodale all'imaging ottico ci consente di identificare i cambiamenti fisiopatologici da una varietà di prospettive. L'approccio multimodale alla microscopia ottica sta espandendo continuamente le sue applicazioni, in particolare in ambito clinico, dove lo sviluppo di microendoscopi ha aperto una strada per l'imaging clinico.

Le attuali sfide sperimentali risiedono nella complessità di incorporare tutto l'hardware l'uno con l'altro, che è parte del motivo per cui utilizziamo un sistema di microscopio personalizzato. Attraverso l'uso della nostra piattaforma di imaging ottico multimodale, abbiamo fatto passi da gigante nello studio della malattia bioortogonale label-free, compresa la classificazione di diversi sottotipi di cancro al seno e l'analisi del metabolismo lipidico nel cervello di drosofila e di topo. Utilizzando il nostro imaging ottico multimodale senza marcatura, siamo in grado di visualizzare contemporaneamente il metabolismo, la morfologia e la composizione molecolare, il che è un potente strumento per studiare le malattie e il processo di invecchiamento.

Per iniziare, riscalda il laser e attendi circa 15-20 minuti. Accendere la scatola di controllo, seguita dal controller del pannello a sfioramento, dall'adattatore CA per il telecomando laser principale e dall'adattatore CA per il telecomando laser secondario, quindi accendere il rilevatore di fotodiodi al silicio e l'amplificatore di blocco. Configura il sistema laser con un raggio di pompa sintonizzabile da 780 nanometri a 990 nanometri, con un'ampiezza dell'impulso da cinque a sei picosecondi e una frequenza di ripetizione di 80 megahertz.

Il raggio laser di Stokes dovrebbe avere una lunghezza d'onda fissa di 1031 nanometri, con un impulso di sei picosecondi e una frequenza di ripetizione di 80 megahertz. Assicurarsi che sia la pompa che i raggi di alimentazione siano a bassa potenza, almeno 20 milliwatt visibili sulla piastra di allineamento. Applicare olio al condensatore dell'olio ad alta apertura numerica.

Montare il vetrino del microscopio sul condensatore dell'olio e posizionare una grossa goccia d'acqua sul vetrino del microscopio per l'obiettivo ad acqua 25X. Regolare lo stadio Z per regolare la messa a fuoco fino a quando l'immagine luminosa del campione biologico è visibile sotto l'obiettivo dell'acqua 25X. Iniziare il processo di imaging nella sequenza corretta per evitare il fotosbiancamento.

Per passare rapidamente da MPF a SHG, passare dal raggio della pompa al raggio di corsa fisso. Selezionare la risoluzione dell'immagine come 512 x 512 pixel. Impostate il tempo di permanenza su otto microsecondi per pixel per MPF e SHG, con una media di fotogrammi superiore a tre.

Utilizzare 40 microsecondi per pixel con un fotogramma medio di due per la modalità SRS. Per acquisire l'autofluorescenza con MPF, spegnere il raggio laser di Stokes. Sintonizzare il laser della pompa a 800 nanometri per eccitare NADH e flavina.

Acquisisci il segnale della fibra di collagene usando SHG. Spegnere il raggio laser della pompa e utilizzare solo il raggio laser Stokes a una potenza di 500 milliwatt. Ottenere la distribuzione spaziale di proteine e lipidi utilizzando SRS.

Mantieni accesi entrambi i raggi laser e regola la frequenza del raggio laser in modo che corrisponda alla modalità vibrazionale specifica per ciascuna molecola. Per acquisire i set di dati dell'immagine iperspettrale SRS, selezionare la modalità suite e impostare l'intervallo di lunghezze d'onda da 781,3 nanometri a 806,5 nanometri. Scegli un numero di stack di almeno 60 e acquisisci lo stack di immagini iperspettrali.

Salva tutte le immagini delle stesse regioni di interesse nella stessa cartella e assicurati che il formato dell'immagine sia il file OIR Olympus. L'autofluorescenza e l'imaging SRS hanno catturato con successo informazioni metaboliche e strutturali dal tessuto polmonare umano. L'analisi raziometrica del rapporto redox ottico e del rapporto di insaturazione lipidica ha fornito distribuzioni spaziali dell'attività metabolica e della composizione molecolare nel tessuto polmonare umano.

Il confronto quantitativo dello stress ossidativo e dell'insaturazione lipidica tra tessuto sano e tumorale rivela differenze negli stati metabolici.