Piattaforma di imaging ottico multimodale per lo studio del metabolismo cellulare
6 giugno 2025
Utilizzando una piattaforma multimodale che combina modalità di imaging ottico label-free, abbiamo sviluppato un protocollo per la visualizzazione e la quantificazione delle dinamiche cellulari e del metabolismo. Attraverso l'imaging tramite fluorescenza multifotone, generazione di seconda armonica e microscopia a scattering Raman stimolato, possiamo generare una panoramica olistica dell'ambiente cellulare e molecolare.
La nostra ricerca prevede l'utilizzo del nostro microscopio multimodale per misurare le differenze molecolari e metaboliche in diverse patologie e visualizzarne l'eterogeneità spaziale. L'approccio multimodale all'imaging ottico ci consente di identificare i cambiamenti fisiopatologici da una varietà di prospettive. L'approccio multimodale alla microscopia ottica sta espandendo continuamente le sue applicazioni, in particolare in ambito clinico, dove lo sviluppo di microendoscopi ha aperto una strada per l'imaging clinico.
Le attuali sfide sperimentali risiedono nella complessità di incorporare tutto l'hardware l'uno con l'altro, che è parte del motivo per cui utilizziamo un sistema di microscopio personalizzato. Attraverso l'uso della nostra piattaforma di imaging ottico multimodale, abbiamo fatto passi da gigante nello studio della malattia bioortogonale label-free, compresa la classificazione di diversi sottotipi di cancro al seno e l'analisi del metabolismo lipidico nel cervello di drosofila e di topo. Utilizzando il nostro imaging ottico multimodale senza marcatura, siamo in grado di visualizzare contemporaneamente il metabolismo, la morfologia e la composizione molecolare, il che è un potente strumento per studiare le malattie e il processo di invecchiamento.
Per iniziare, riscalda il laser e attendi circa 15-20 minuti. Accendere la scatola di controllo, seguita dal controller del pannello a sfioramento, dall'adattatore CA per il telecomando laser principale e dall'adattatore CA per il telecomando laser secondario, quindi accendere il rilevatore di fotodiodi al silicio e l'amplificatore di blocco. Configura il sistema laser con un raggio di pompa sintonizzabile da 780 nanometri a 990 nanometri, con un'ampiezza dell'impulso da cinque a sei picosecondi e una frequenza di ripetizione di 80 megahertz.
Il raggio laser di Stokes dovrebbe avere una lunghezza d'onda fissa di 1031 nanometri, con un impulso di sei picosecondi e una frequenza di ripetizione di 80 megahertz. Assicurarsi che sia la pompa che i raggi di alimentazione siano a bassa potenza, almeno 20 milliwatt visibili sulla piastra di allineamento. Applicare olio al condensatore dell'olio ad alta apertura numerica.
Montare il vetrino del microscopio sul condensatore dell'olio e posizionare una grossa goccia d'acqua sul vetrino del microscopio per l'obiettivo ad acqua 25X. Regolare lo stadio Z per regolare la messa a fuoco fino a quando l'immagine luminosa del campione biologico è visibile sotto l'obiettivo dell'acqua 25X. Iniziare il processo di imaging nella sequenza corretta per evitare il fotosbiancamento.
Per passare rapidamente da MPF a SHG, passare dal raggio della pompa al raggio di corsa fisso. Selezionare la risoluzione dell'immagine come 512 x 512 pixel. Impostate il tempo di permanenza su otto microsecondi per pixel per MPF e SHG, con una media di fotogrammi superiore a tre.
Utilizzare 40 microsecondi per pixel con un fotogramma medio di due per la modalità SRS. Per acquisire l'autofluorescenza con MPF, spegnere il raggio laser di Stokes. Sintonizzare il laser della pompa a 800 nanometri per eccitare NADH e flavina.
Acquisisci il segnale della fibra di collagene usando SHG. Spegnere il raggio laser della pompa e utilizzare solo il raggio laser Stokes a una potenza di 500 milliwatt. Ottenere la distribuzione spaziale di proteine e lipidi utilizzando SRS.
Mantieni accesi entrambi i raggi laser e regola la frequenza del raggio laser in modo che corrisponda alla modalità vibrazionale specifica per ciascuna molecola. Per acquisire i set di dati dell'immagine iperspettrale SRS, selezionare la modalità suite e impostare l'intervallo di lunghezze d'onda da 781,3 nanometri a 806,5 nanometri. Scegli un numero di stack di almeno 60 e acquisisci lo stack di immagini iperspettrali.
Salva tutte le immagini delle stesse regioni di interesse nella stessa cartella e assicurati che il formato dell'immagine sia il file OIR Olympus. L'autofluorescenza e l'imaging SRS hanno catturato con successo informazioni metaboliche e strutturali dal tessuto polmonare umano. L'analisi raziometrica del rapporto redox ottico e del rapporto di insaturazione lipidica ha fornito distribuzioni spaziali dell'attività metabolica e della composizione molecolare nel tessuto polmonare umano.
Il confronto quantitativo dello stress ossidativo e dell'insaturazione lipidica tra tessuto sano e tumorale rivela differenze negli stati metabolici.
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Panoramica
Questo studio presenta una piattaforma di imaging ottico multimodale che consente la visualizzazione e la quantificazione della dinamica cellulare e del metabolismo. Utilizzando varie tecniche di imaging, possiamo ottenere informazioni sull'ambiente cellulare e molecolare in diverse patologie.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienza
- Biologia cellulare
- Imaging ottico
Contesto
- La microscopia multimodale consente la misurazione delle differenze molecolari e metaboliche.
- Fornisce una visione olistica dei cambiamenti fisiopatologici.
- Le applicazioni si stanno espandendo in ambito clinico, in particolare con i micro endoscopi.
- I sistemi microscopici personalizzati affrontano le sfide sperimentali.
Obiettivo dello studio
- Visualizzare contemporaneamente il metabolismo, la morfologia e la composizione molecolare.
- Indagare su malattie e il processo di invecchiamento.
- Classificare i diversi sottotipi di cancro al seno.
Metodi utilizzati
- Microscopia a fluorescenza multifotonica
- Microscopia a generazione di armoniche di secondo ordine
- Microscopia a dispersione Raman stimolata
- Tecniche di imaging bioortogonale senza etichetta
Risultati principali
- Progressi significativi nella comprensione del metabolismo dei lipidi in organismi modello.
- Identificazione dell'eterogeneità spaziale nella dinamica cellulare.
- Classificazione dei sottotipi di cancro al seno utilizzando tecniche di imaging.
- Migliore visualizzazione dei processi metabolici nel cervello.
Conclusioni
- L'approccio multimodale è uno strumento potente per l'indagine delle malattie.
- Le tecniche di imaging senza etichetta forniscono informazioni complete sugli ambienti cellulari.
- Le future applicazioni potrebbero migliorare ulteriormente le capacità di imaging clinico.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Multimodal optical imaging platforms that integrate MPF, SHG, and SRS modalities enable simultaneous, label-free quantification of cellular metabolism, morphology, and molecular composition at subcellular resolution. This capability addresses a critical need for high-content, spatially resolved metabolic and structural data in early discovery and translational research, supporting predictive confidence in disease modeling and mechanistic de-risking. The platform's ability to coregister multiple functional readouts from the same biological region enhances portfolio decision-making and risk-adjusted advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization and quantification of metabolic activity and molecular heterogeneity in disease-relevant systems.
- Supports mechanistic de-risking by correlating metabolic states with structural and compositional features.
- Facilitates functional target validation through label-free, multiplexed imaging of live cells and tissues.
Screening & Assay Development
- Provides validated, reproducible imaging outputs for quantitative assessment of metabolic and structural biomarkers.
- Supports assay standardization by enabling simultaneous acquisition of multiple modalities from the same sample region.
- Accelerates screening readiness by reducing the need for exogenous labels and minimizing sample perturbation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns metabolic and molecular imaging outputs with disease progression and therapeutic response in preclinical models.
- Enables spatial mapping of metabolic heterogeneity relevant to tumor biology and neurodegeneration.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by providing in situ, label-free readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This multimodal imaging platform bridges early discovery, lead identification, and preclinical research by delivering multiplexed, quantitative data from intact biological systems.
- Discovery Biology: Integrates hypothesis testing and pathway clarification by correlating metabolic, structural, and compositional data.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs suitable for comparative analysis across conditions.
- Analytics: Provides ratiometric and spatially resolved measurements of oxidative stress and lipid unsaturation for robust statistical analysis.
- Translational Research: Enables alignment of imaging biomarkers with disease states and therapeutic outcomes in model systems.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, label-free imaging capability adaptable across diverse biological models and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target and pathway validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing high-content, multiplexed data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and preclinical programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced optical imaging and multimodal hardware integration.
- Demands specialized instrumentation, including tunable lasers and synchronized detection systems.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis pipelines.
- Adaptation across model systems may require optimization of imaging parameters and sample preparation.
- Complexity of hardware integration and data management may limit throughput in some settings.
