Sistema regolabile Tet-Off inducibile: un metodo in vitro per modulare l'espressione genica in cellule in coltura utilizzando il sistema Tetracycline-Off

Iniziare prendendo una sospensione di cellule riceventi in coltura in una provetta. Integrare la provetta con plasmidi inducibili contenenti il gene di interesse. L'espressione di questo gene è sotto il controllo di una sequenza di promotori a monte fusa con un operatore di tetraciclina o TetO, formando un elemento responsivo alla tetraciclina o TRE.

Inoltre, aggiungere vettori regolatori tetraciclina-off, ciascuno contenente un gene che codifica per la proteina transattivatrice della tetraciclina ricombinante o tTA. Elettroporare la miscela cellula-DNA per utilizzare impulsi elettrici per facilitare l'assorbimento dei plasmidi da parte della cellula.

Dopo l'elettroporazione, piastrate le cellule e incubatele per la durata desiderata. Entrando nel nucleo, il vettore tetraciclina-off esprime la proteina tTA. Il tTA è una proteina ibrida contenente un repressore Tet o la porzione TetR e un dominio transattivatore di trascrizione virale VP16.

porzione TetR lega la sequenza TetO dell'elemento TRE, mentre il dominio VP16 consente alla RNA polimerasi di sintetizzare l'mRNA dal DNA a valle, portando infine all'espressione genica. Sostituire i terreni di coltura nella piastra di coltura con terreni contenenti doxiciclina e incubare.

La doxiciclina, un analogo sintetico della tetraciclina, si lega alla proteina TetR e ne modifica la conformazione. Questo cambiamento interrompe l'interazione della proteina TetR con la sequenza TetO, inibendo l'espressione genica bersaglio.