Knockout genico multiplo mediato da concatemero CRISPR: una tecnica per eliminare simultaneamente più geni mediante un percorso di giunzione terminale non omologo nelle cellule intestinali di topo

Iniziare questa procedura aggiungendo 9 millilitri di siero ridotto alla provetta da 15 millilitri contenente la sospensione cellulare e centrifugare a 400 G per 3 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere tutto il surnatante e risospendere il pellet in una soluzione di elettroporazione. Aggiungere una quantità totale di 10 microgrammi di DNA a due nuove provette. Quindi, aggiungere la soluzione di elettroporazione fino a un volume finale di 100 microlitri e mantenere la miscela cellula-DNA sul ghiaccio.

Trasferire la miscela cellula-DNA nella cuvetta di elettroporazione. Posizionare la cuvetta nella camera dell'elettroportatore. Misurare l'impedenza premendo l'apposito pulsante sull'elettroporatore e assicurarsi che sia compresa tra 0,030 e 0,055 ohm. Eseguire l'elettroporazione secondo le impostazioni indicate nel protocollo di testo. Aggiungere 400 microlitri di tampone per elettroporazione più l'inibitore ROCK alla cuvetta, quindi trasferire tutto il suo contenuto in una provetta da 1,5 millilitri.

Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti per consentire alle cellule di riprendersi. Dopo 30 minuti, centrifugare a 400 G per 3 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 20 microlitri per pozzetto di matrice basamentale. Seminare circa 1 x 10⁴ a 1 x 10⁵ cellule per pozzetto in una piastra a 48 pozzetti e aggiungere EGF più l'inibitore di Noggin GSK-3, l'inibitore ROCK e il terreno dimetilsolfossido all'1,25%. Incubare a 37 gradi Celsius.