Dot blot quantitativo per stimare le proteine bersaglio in un lisato tissutale

Il dot blot quantitativo, o QDB, è una tecnica utile per quantificare la concentrazione di proteine bersaglio in un campione. Una volta che il campione è immobilizzato su una membrana polimerica, le proteine possono essere rilevate tramite immunoblotting.

Per iniziare, prendi una piastra QDB, una piastra multipozzetto con una membrana di nitrocellulosa attaccata al fondo di ciascun pozzetto. Aggiungere il campione, un lisato tissutale contenente la proteina bersaglio, al centro della membrana all'interno del pozzetto.

Lasciare asciugare il campione. La proteina bersaglio si lega alla membrana tramite interazioni non covalenti.

Aggiungere una soluzione di blocco. Le proteine nella soluzione si attaccano ai siti non legati sulla membrana, impedendo il legame non specifico dei reagenti di rilevamento.

Quindi, aggiungere una soluzione contenente anticorpi primari che si legano alla proteina bersaglio nel campione. Lavare per rimuovere gli anticorpi non legati.

Quindi, aggiungere una soluzione di anticorpi secondari. Queste molecole, marcate con un enzima perossidasi, si legano agli anticorpi primari legati alle proteine. Lavare per rimuovere gli anticorpi non legati.

Infine, aggiungere una soluzione contenente un substrato chemiluminescente e perossido di idrogeno. Utilizzando il perossido di idrogeno, la perossidasi legata all'anticorpo ossida il substrato ed emette luce. Utilizzando un lettore di piastre, misurare l'intensità di luminescenza del campione.

Generare una curva di luminescenza standard utilizzando una diluizione seriale con concentrazioni note della proteina bersaglio. Tracciare il valore di luminescenza misurato del campione sulla curva per determinare la concentrazione proteica target.