Rilevazione immunofluorescenza di due analoghi della timidina (CldU e IDU) in tessuto primario
7 dicembre 2010
Abbiamo derivato una strategia per rilevare incorporazione sequenziale di analoghi della timidina (CldU e IDU) nei tessuti di topi adulti per quantificare due turni successivi di divisione cellulare. Questa strategia è utile per rilevare il ricambio cellulare del longevo tessuti, la trasformazione oncogena, o di transito amplificazione cellule.
Salve e benvenuti al protocollo di colorazione Calor D-U-I-D-U. Oggi il nostro video inizierà con il passaggio tre: reidratazione, permeabilizzazione e recupero dell'antigene. Iniziate caricando i vetrini nel portapreparati.
Una volta caricati i vetrini, immergerli in un bagno di xilene per cinque minuti. Seguirà un secondo bagno in xilene, nuovamente per cinque minuti.
Continuare a reidratare i vostri vetrini spostandoli nella soluzione di etanolo, iniziando con la soluzione al 100% e terminando al 50%. Completare quindi la reidratazione dei vetrini posizionando i vetrini per cinque minuti in una soluzione di XPBS per permeabilizzare le membrane cellulari. Immergere i vetrini in una soluzione di Triton X al 0,2% per cinque minuti. Preparare i vetrini per il recupero degli antigeni tessutali mediante microonde posizionandoli in un contenitore di vetro con un volume sufficiente di tampone citrato di sodio 0,01 molare in modo che la soluzione copra cinque centimetri sopra la parte superiore dei vetrini.
Per compensare la perdita dovuta all'evaporazione, riscaldare le vetrate al microonde finché la soluzione non inizia a bollire. Questo processo dovrebbe richiedere circa da tre a dieci minuti alla potenza massima. Verificare che le vetrate stiano bollendo.
Ridurre la potenza del microonde tra il 10 e l'80% e continuare a far bollire lentamente i vetrini per ulteriori 20 minuti. Dopo l'ebollizione, posizionare il becher contenente i vetrini su un piano di lavoro per permettere loro di raffreddarsi lentamente per circa due ore, fino a quando non avranno raggiunto la temperatura ambiente. Verificare che i vetrini siano a temperatura ambiente.
Immergere i vetrini in acido cloridrico naturale 1,5 per 40 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere i vetrini dall'acido cloridrico e collocarli per cinque minuti in un lavaggio con XPBS. Seguirà un secondo lavaggio con XPBS.
Rimuovere le preparazioni dalla soluzione di PBS 1x utilizzando una penna con cera liquida bloccante. Delimitare ogni sezione di tessuto con un cerchio e reinserire la preparazione nel PBS. Preparare una camera di incubazione umida posizionando un tovagliolo di carta bagnato sul fondo di un contenitore ermetico.
Preparare una soluzione di blocco costituita da 10% di siero di blocco diluito in 1x PBS. È importante coprire completamente ogni sezione di tessuto con la soluzione, per sezioni di tessuto tipiche di circa 1 per 1,5 centimetri. Un volume di 50 microlitri di soluzione di blocco è sufficiente.
Preparare l'anticorpo primario IDU diluendo gli antisieri anti-BRDU di topo nel 5% di siero di asino. Aggiungere una concentrazione da uno a 250. Pipettare la soluzione primaria su ciascuna sezione del vetrino.
Collocare i vetrini in un refrigeratore a quattro gradi Celsius. Per un'incubazione notturna, preparare un lavaggio ad alta stringenza. Il TBST funziona bene.
Posizionare i vetrini a faccia a faccia. Collocare i vetrini in circa 35-40 millilitri di soluzione TBST. Mettere i tubi in un incubatore per colture batteriche agitato a 37 gradi Celsius.
Lasciarli agitare per 20 minuti a 25 RPM. Inserire ora i vetrini in un portavetrini. Posizionare i vetrini in un XPBS per un lavaggio con PBS di cinque minuti.
Si procederà con un secondo lavaggio con XPBS per cinque minuti. Preparare la soluzione dell'anticorpo primario CLDU diluendo l'anticorpo rat anti BRDU in siero di asino al 5%. Aggiungere una concentrazione da uno a 250 sui vetrini appoggiati su un tovagliolo di carta e quindi delimitare con una penna al paraffina.
Utilizzare una pipetta per coprire ciascun taglio di tessuto con la soluzione primaria di CLDU. Usare circa 50 microlitri di soluzione per assicurarsi che ogni sezione di tessuto sia completamente coperta. Posizionare i vetrini in un refrigeratore a quattro gradi Celsius per un'incubazione notturna.
Posizionare i vetrini in un portavetrini e quindi immergerli in un primo bagno di PBS 1X per cinque minuti. Posizionare i vetrini in un secondo bagno di PBS 1X per cinque minuti. Preparare gli anticorpi secondari diluendo gli anticorpi donkey anti-RAD CY2 e donkey anti-muse PS5 in siero di donkey al 5%. DPI verrà utilizzato anche per la colorazione nucleare; coprire completamente le sezioni di tessuto con gli anticorpi secondari.
50 microlitri di soluzione dovrebbero essere sufficienti per coprire completamente il tessuto. Posizionare la camera di reidratazione al buio a temperatura ambiente per un'incubazione di un'ora. Posizionare i vetrini in un portavetrini e quindi immergerli in un lavaggio con PBS 1X per cinque minuti.
Posizionare i vetrini in un secondo lavaggio con XPBS per cinque minuti. Rimuovere l'eccesso di soluzione PBS tamponando delicatamente su un tovagliolo di carta. Quindi prendere il mezzo di montaggio antiossidante con prolungata durata dorata e posizionare una piccola goccia su ciascuna sezione di tessuto.
Prendere un'oggettino e posizionarlo delicatamente sopra le sezioni del vetrino. Utilizzare il fazzoletto di carta come pressa per eliminare eventuali bolle d'aria in eccesso che potrebbero essersi intrappolate tra le sezioni del vetrino e l'oggettino. Infine, utilizzare la punta di una pipetta per rimuovere eventuali bolle d'aria residue. Acquisire l'immagine del tessuto di interesse mediante un microscopio a fluorescenza dotato di una sorgente luminosa ad alta energia e di canali fluorescenti multipli per quantificare i risultati.
Iniziare contando il numero di cellule positive a Dabi. Contare il numero di cellule positive a CLDU utilizzando l'immagine a due canali SI. Contare il numero di cellule positive a IDU utilizzando l'immagine a cinque canali SCI.
Infine, conta le cellule doppio positivamente marcate passando tra il file immagine del canale SCI due e quello del canale SCI cinque.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per rilevare l'incorporazione sequenziale di analoghi della timidina (CldU e IdU) in tessuti di topo adulti, consentendo la quantificazione di due cicli successivi di divisione cellulare. Questa tecnica è utile per lo studio del ricambio cellulare in tessuti a lunga vita, della trasformazione oncogenica e delle cellule amplificatrici transitorie.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cellulare
- Neuroscienze
- OnCOlogia
Sfondo
- Gli analoghi della timidina vengono utilizzati per etichettare le cellule in divisione.
- Comprendere la divisione cellulare è fondamentale per lo studio della rigenerazione dei tessuti.
- Il ricambio cellulare è importante sia nella fisiologia normale che nelle condizioni patologiche.
- L'etichettatura sequenziale può fornire informazioni sulle dinamiche delle popolazioni cellulari.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per quantificare la divisione cellulare nei tessuti.
- Valutare le implicazioni del ricambio cellulare in diversi contesti biologici.
- Migliorare la comprensione dei processi oncogenici attraverso l'analisi della divisione cellulare.
Metodi Utilizzati
- Incorporazione sequenziale di CldU e IdU nei tessuti di topo.
- Microscopia fluorescente per la visualizzazione delle cellule marcate.
- Quantificazione delle cellule positive a DAB, CldU e IdU.
- Uso di anticorpi specifici per il rilevamento degli analoghi della timidina.
Risultati principali
- Rilevamento con successo della divisione cellulare sequenziale in campioni di tessuto.
- Analisi quantitativa dei tassi di ricambio cellulare.
- Identificazione di potenziali marcatori di trasformazione oncogenica.
- Informazioni sul comportamento delle cellule amplificatrici di transito.
Conclusioni
- Il metodo sviluppato fornisce un approccio robusto per lo studio della divisione cellulare.
- I risultati contribuiscono alla comprensione della dinamica dei tessuti in condizioni fisiologiche e patologiche.
- Questa tecnica può essere applicata a diverse aree di ricerca, tra cui oncologia e medicina rigenerativa.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La quantificazione accurata della divisione cellulare sequenziale consente una riduzione del rischio meccanicistica nella validazione degli obiettivi, chiarificando la dinamica proliferativa in sistemi rilevanti per la malattia. Questo approccio sostiene la previsione affidabile nei modelli preclinici distinguendo risposte proliferative transitorie da quelle sostenute, fornendo informazioni utili per l'identificazione dei composti promettenti e la selezione del portafoglio. L'applicabilità del metodo a tessuti a lunga vita migliora la scoperta di biomarcatori traslazionali in oncologia e medicina rigenerativa.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche misurando due cicli successivi di divisione cellulare in tessuti primari.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale del bersaglio mediante la visualizzazione diretta della cinetica proliferativa in modelli di malattia.
- Valore predittivo: Favorisce la riduzione del rischio meccanicistico quantificando i tassi di turnover cellulare che informano sulla fiducia nel bersaglio e sulla modulazione del percorso.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per la valutazione di composti successivi mediante protocolli standardizzati di immunomarcatura.
- Output quantitativo: Genera conteggi misurabili di cellule positive a DAB, CldU e IdU per endpoint di screening riproducibili.
- Scalabilità: Ottimizzato per la somministrazione a bassa dose di analoghi della timidina tramite acqua potabile, consentendo studi con dosaggio cronico in modelli preclinici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Applicato per identificare la trasformazione oncogenica e valutare il contributo delle cellule amplificanti di transito alla crescita dei tessuti.
- Continuità traslazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica fornendo dati quantitativi sulla proliferazione in diversi tipi di tessuto.
- Decisioni basate sul rischio: Guida le strategie di sviluppo chiarificando se la crescita osservata derivi dall'attività delle cellule staminali o dall'espansione delle cellule amplificanti di transito.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto attivo fino all'efficacia preclinica, fornendo metriche di proliferazione che supportano le decisioni di avanzamento o interruzione a ogni fase.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi quantificando la sintesi sequenziale del DNA in risposta a perturbazioni farmacologiche o genetiche.
- Screening: Fornisce sezioni di tessuto pronte per il saggio con una rilevazione standardizzata dell'incorporazione dell'analoghi della timidina per lo screening di composti.
- Analisi: Permette il confronto tra indici proliferativi in diverse condizioni mediante la separazione dei canali fluorescenti e la quantificazione di cellule doppio-positivi.
- Ricerca Translazionale: Collega la fase iniziale della scoperta alla validazione preclinica monitorando la dinamica della linea cellulare in tessuti rilevanti per le malattie umane.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per studi longitudinali sulla proliferazione in diversi ambiti terapeutici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi fornendo evidenze dirette della storia delle divisioni cellulari.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso protocolli standardizzati di permeabilizzazione, recupero dell'antigene e immunomarcatura multiplex.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo una riduzione precoce dei rischi associati agli obiettivi sulla base della loro responsabilità proliferativa.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta per rischio distinguendo gli effetti terapeutici sui compartimenti delle cellule staminali rispetto a quelle progenitrici.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in immunohistochimica e microscopia fluorescente per la rilevazione multiplex.
- È subordinato all'accesso a infrastrutture per il recupero dell'antigene (microonde, tampone citrato) e alla capacità di incubazione sequenziale degli anticorpi.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le procedure di bloccaggio, lavaggio e montaggio, al fine di ridurre al minimo gli effetti di lotto.
- L'adattamento a diversi sistemi modello richiede la validazione della specificità degli anticorpi e della permeabilità dei tessuti in ciascun contesto.
- I limiti pratici includono il potenziale mascheramento dell'epitopo e la necessità di ottimizzare i regimi di somministrazione degli analoghi per evitare tossicità.
