Fabbricazione di micro-tessuti utilizzando i moduli di Collagene Gel cellule contenenti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre micro tessuti modulari che possono essere utilizzati per esperimenti di ingegneria tissutale. Ciò si ottiene estraendo prima la soluzione di collagene in un tubo di polietilene, utilizzando una siringa e quindi gelificando il collagene. Il secondo passo consiste nel tagliare il tubo di polietilene in lunghezze di due millimetri per formare i moduli di micro tessuto.

La terza fase della procedura consiste nel separare i moduli dal tubo e, infine, i moduli vengono rivestiti con cellule endoteliali. In definitiva, i microtessuti risultanti possono essere utilizzati per saggi cellulari in vitro per studiare l'interazione delle cellule attraverso una camera microfluidica. Inoltre, i micro tessuti possono essere impiantati per generare tessuti per studiare l'interazione e il rimodellamento dei micro tessuti in vivo.

Ciao, mi chiamo Brendan Long del Sepan Lab qui all'Università di Toronto. Uno dei principali ostacoli nella creazione di un grande sostituto tissutale 3D è la mancanza di una rapida vascolarizzazione dopo l'impianto. In questo video, ti mostreremo come creare un tessuto modulare rivestito con cellule endoteliali per aiutare a superare questa limitazione.

A dimostrare la procedura sarà considerato Chamberlain, un borsista post-operatorio del laboratorio Septin. La quantità di collagene da neutralizzare dipenderà dalla lunghezza del tubo in polietilene. In questa dimostrazione, utilizzeremo un tubo in polietilene da due metri con un diametro interno di 0,76 millimetri e un diametro esterno di 1,22 millimetri.

Per preparare il tubo, infilare un ago da 20 G in un'estremità del tubo, quindi posizionare il tubo in una sacca autorigenerante per convertitore per la sterilizzazione con gas. Poiché un millilitro di collagene riempie circa due metri di tubo di polietilene, neutralizzeremo un millilitro di collagene. Metti il collagene in un tubo conico da 15 millilitri e mantieni il tubo sul ghiaccio.

Aggiungere 128 microlitri di 10 x alfa, MEM per millilitro di collagene alla provetta e mescolare pipettando ripetutamente la soluzione. Facendo attenzione a ridurre al minimo la formazione di bolle, la soluzione dovrebbe ingiallire quando l'alfa MEM viene mescolato al collagene acidificato. Quindi, neutralizzare il collagene aggiungendo 0,8 molari di bicarbonato di sodio Per una stima generale del pH, aggiungere bicarbonato di sodio fino a quando la soluzione di collagene giallo non assume un colore rosa chiaro.

In genere sono necessari da 30 a 60 microlitri per millilitro di collagene per raggiungere un pH di 7,4. Per evitare che il collagene neutralizzato si gelifichi, tenerlo sul ghiaccio fino a quando non è pronto per essere utilizzato. Per iniziare la procedura di gelatina del collagene, portare la sacca contenente il tubo di polietilene sterilizzato in una cabina di sicurezza biologica e tagliare l'estremità sigillata della sacca mantenendo il tubo nella sacca.

Utilizzare una pinzetta sterilizzata per collegare una siringa da tre millilitri all'ago da 20 gauge precedentemente inserito in un'estremità del tubo. Inserire l'altra estremità del tubo nel collagene neutralizzato fino a quando la punta non si trova sul fondo del tubo conico, che viene mantenuto in ghiaccio. Questo passaggio successivo deve essere fatto lentamente, altrimenti si introducono bolle d'aria nel collagene.

Ritrarre lentamente lo stantuffo della siringa per tirare il collagene nel tubo di polietilene. Quando il collagene è stato tirato attraverso il tubo, estrarre l'ago calibro 20 e rimettere entrambe le estremità del tubo nella borsa. Dopo aver chiuso la sacca con nastro adesivo, incubare a 37 gradi Celsius per 60 minuti.

Per tagliare il tubo verrà utilizzato un dispositivo di taglio preassemblato. Per iniziare questa procedura, posizionare il tubo in un vassoio sterile davanti al dispositivo di taglio e caricare il tubo nel dispositivo di taglio all'uscita del dispositivo di taglio, impostare un tubo conico da 50 millilitri contenente 25 millilitri di terreno cellulare endoteliale. Per raccogliere i moduli tagliati, impostare il dispositivo di taglio in modo da tagliare due millimetri di tubo e quindi tagliare il tubo.

Incubare i moduli tagliati nella provetta conica da 50 millilitri a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Per rimuovere i moduli di collagene dal tubo, vortex, il tubo conico da 50 litri contenente i moduli a media velocità. Per 10 secondi, lasciare che il modulo si depositi sul fondo del tubo, il che richiede circa cinque minuti.

Un pellet sciolto di moduli si formerà sul fondo del tubo mentre il tubo formerà uno strato sopra il fluido. Dopo che i moduli si sono depositati, utilizzare una pipetta sierologica a bocca larga da 10 millilitri per trasferirli in una provetta conica da 15 millilitri. Vortex, il tubo conico da 15 millilitri, e poi lasciare che i moduli si depositino per altre due volte.

Anche i moduli sedimentati del secondo e del terzo vortice vengono trasferiti al tubo da 15 millilitri. Dopo che tutti i moduli sono stati rimossi dal tubo e raggruppati, portare il volume del fluido nel tubo a cinque millilitri. I moduli sono ora pronti per il rivestimento con cellule endoteliali, che verranno mostrate in seguito per preparare le cellule endoteliali per il rivestimento dei moduli.

Innanzitutto, rimuovere il terreno dalle celle e lavare con PBS. Dopo aver rimosso il PBS, aggiungere tre millilitri di tripsina EDTA e incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, risus, sospendere le cellule in sette millilitri di terreno e trasferirle in una provetta da 15 millilitri.

Conta le cellule usando un emocitometro, avrai bisogno di cinque volte 10 alla sesta cellula endoteliale per millilitro di moduli impaccati sul fondo del tubo conico. Pellettare le celle a 300 G per cinque minuti. Risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di terreno cellulare endoteliale.

Ora aggiungi cinque millilitri di terreno contenente cellule endoteliali ai moduli. I moduli vengono incubati con le cellule endoteliali, sia staticamente che dinamicamente per l'incubazione statica, mescolati con cellule endoteliali per inversione, quindi posizionati la provetta in posizione verticale a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Dopo 15 minuti, capovolgere nuovamente la provetta e incubare a 37 gradi Celsius per altri 15 minuti.

Per incubare dinamicamente i moduli con le cellule endoteliali, far oscillare delicatamente la provetta da 15 millilitri a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Una volta completata l'incubazione con le cellule endoteliali, trasferire i moduli su una piastra non trattata con coltura tissutale e incubare per una notte a 37 gradi Celsius del giorno successivo, posizionare i moduli in una nuova piastra non trattata con colture tissutali con terreni freschi per rimuovere le cellule endoteliali non attaccate. Incubare i moduli rivestiti con cellule endoteliali a 37 gradi Celsius fino a quando le cellule coprono il 100% della superficie dei moduli.

Questo di solito richiede circa sette giorni. I moduli appariranno cilindrici quando verranno rimossi per la prima volta dal tubo. Se sono rivestiti con cellule endoteliali, possono contrarsi fino al 50% in volume e sviluppare una forma ovale, oltre a diventare più densi e più opachi se osservati al microscopio ottico.

In queste immagini, il diametro e la lunghezza dei moduli sono indicati rispettivamente da d e l. L'immagine successiva mostra due celle Hep G incorporate distribuite uniformemente all'interno dei moduli al momento della fabbricazione. Le cellule hanno mantenuto un'elevata vitalità, come indicato dal colore verde delle cellule vive.

Le cellule morte sarebbero di colore rosso quando le cellule endoteliali sono confluenti. Sulla superficie dei moduli si formano giunzioni strette, che possono essere viste dall'immunofluorescenza. L'analisi del trasferimento di massa della caderina VE ha dimostrato che i moduli sono in grado di supportare alte densità cellulari senza sviluppare un nucleo necrotico a causa dell'inadeguato trasporto di ossigeno, che è spesso problematico nei tessuti più grandi.

In questo esempio, la colorazione massen Tri chro di piccoli moduli tipici mostra che i moduli hanno mantenuto una distribuzione uniforme ed elevata di cellule vive sette giorni dopo la fabbricazione. Al contrario, un gran numero di cellule morte si era formato all'interno del nucleo dei grandi moduli, lasciando solo un sottile bordo di cellule vitali. I moduli sono stati inoltre prodotti con una miscela di collagene e un polimero ine o contenenti microsfere a rilascio di farmaco.

Qui, quando le cellule di h hm EC one sono posizionate su moduli di collagene palin, i moduli mantengono la loro forma cilindrica e le proprietà di attacco cellulare sono limitate rispetto ai moduli di solo collagene. Di seguito è mostrata un'immagine al microscopio ottico di un modulo di collagene contenente microsfere biodegradabili a base di PLGA. Diversi saggi in vitro hanno dimostrato di essere compatibili con i moduli.

Ad esempio, in un test di angiogenesi, le formazioni capillari su un modulo posizionato con cellule endoteliali possono essere facilmente rilevate e quantificate dopo cinque giorni di incubazione con cellule staminali di derivazione adiposa. In un altro esempio, le immagini al microscopio confocale di un test morto vivo sui moduli mostrano cellule vive colorate di verde e cellule morte colorate di rosso. Infine, i moduli sono stati utilizzati anche in camere microfluidiche e impiantati in topi e ratti per studiare l'interazione tra diversi tipi di cellule e come i micro tessuti vengono rimodellati dalla risposta dell'ospite.

Dopo la procedura, i moduli possono essere coltivati in una capsula di Petri o in altri recipienti come un bioreattore o un dispositivo microfluidico. Questo metodo può anche essere adattato per creare tessuti diversi utilizzando varie combinazioni di tipi di cellule o utilizzando tubi con diametro diverso. Grazie per l'attenzione.