Fabbricazione di micro-tessuti utilizzando i moduli di Collagene Gel cellule contenenti

L'obiettivo generale di questa procedura è produrre micro tessuti modulari che possono essere utilizzati per esperimenti di ingegneria tissutale. Questo viene realizzato innanzitutto aspirando la soluzione di collagene in un tubo di polietilene mediante una siringa e successivamente inducendo la gelificazione del collagene. Il secondo passaggio consiste nel tagliare il tubo di polietilene in segmenti di due millimetri per formare i moduli di micro tessuto.

Il terzo passaggio della procedura consiste nel separare i moduli dal tubo, e infine i moduli vengono rivestiti con cellule endoteliali. In definitiva, i micro tessuti ottenuti possono essere utilizzati per saggi cellulari in vitro allo scopo di studiare l'interazione tra cellule mediante una camera microfluidica. Inoltre, i micro tessuti possono essere impiantati per generare tessuti destinati allo studio dell'interazione e del rimodellamento dei micro tessuti in vivo.

Ciao, mi chiamo Brendan Long del laboratorio Sepan presso l'Università di Toronto. Uno degli ostacoli principali nella creazione di sostituti tessutali tridimensionali di grandi dimensioni è la mancanza di una rapida vascolarizzazione dopo l'impianto. In questo video, vi mostreremo come creare tessuti modulari rivestiti con cellule endoteliali per superare tale limitazione.

La procedura sarà dimostrata da deemed Chamberlain, un borsista post-dottorato del laboratorio Septin. La quantità di collagene da neutralizzare dipenderà dalla lunghezza del tubo di polietilene. In questa dimostrazione, utilizzeremo un tubo di polietilene lungo due metri con un diametro interno di 0,76 millimetri e un diametro esterno di 1,22 millimetri.

Per preparare il tubo, inserire un ago da 20 G in un'estremità del tubo, quindi posizionare il tubo in una busta autoclavabile con sistema di chiusura ermetica per la sterilizzazione gassosa. Poiché un millilitro di collagene riempie circa due metri di tubo in polietilene, neutralizzeremo un millilitro di collagene. Versare il collagene in un tubo conico da 15 millilitri e mantenere il tubo sul ghiaccio.

Aggiungere 128 microlitri di MEM alfa 10x per millilitro di collagene al tubo e mescolare ripetutamente aspirando e dispensando la soluzione con una pipetta. Avendo cura di minimizzare la formazione di bolle, la soluzione dovrebbe diventare gialla man mano che il MEM alfa si mescola con il collagene acidificato. Successivamente, neutralizzare il collagene aggiungendo bicarbonato di sodio 0,8 M. Per una stima generale del pH, aggiungere bicarbonato di sodio fino a quando la soluzione di collagene gialla diventa di un colore rosa chiaro.

Di solito sono necessari da 30 a 60 microlitri per millilitro di collagene per raggiungere un pH di 7,4. Per evitare che il collagene neutralizzato geli, mantenerlo sul ghiaccio fino al momento dell'uso. Per iniziare la procedura di gelificazione del collagene, portare il sacchetto contenente i tubi di polietilene sterilizzati all'interno di una cappa a sicurezza biologica e tagliare l'estremità sigillata del sacchetto, mantenendo i tubi all'interno del sacchetto.

Utilizzare pinze sterili per fissare una siringa da tre millilitri all'ago da 20 gauge precedentemente inserito in un'estremità del tubo. Inserire l'altra estremità del tubo nel collagene neutralizzato fino a quando la punta raggiunge il fondo del tubo conico, che deve essere mantenuto sul ghiaccio. Questo passaggio successivo va eseguito lentamente, altrimenti si introducono bolle d'aria nel collagene.

Ritrai lentamente lo stantuffo della siringa per aspirare il collagene nel tubo di polietilene. Quando il collagene è stato aspirato attraverso il tubo, rimuovi l'ago da 20 gauge e reinserisci entrambe le estremità del tubo all'interno della busta. Dopo aver sigillato la busta con del nastro adesivo, incuba a 37 gradi Celsius per 60 minuti.

Si utilizzerà un dispositivo di taglio preassemblato per tagliare il tubo. Per iniziare questa procedura, posizionare il tubo in un vassoio sterile davanti al dispositivo di taglio e inserire il tubo nel dispositivo di taglio all'uscita dello stesso; preparare un tubo conico da 50 millilitri contenente 25 millilitri di mezzo per cellule endoteliali. Per raccogliere i moduli tagliati, impostare il dispositivo di taglio in modo da tagliare spezzoni di tubo di due millimetri e quindi procedere al taglio del tubo.

Incubare i moduli tagliati nel tubo conico da 50 millilitri a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Per rimuovere i moduli di collagene dal tubo, vortexare il tubo conico da 50 litri contenente i moduli a velocità media. Lasciare sedimentare il modulo sul fondo del tubo per 10 secondi, operazione che richiede circa cinque minuti.

Un pellet allentato di moduli si formerà sul fondo del tubo, mentre il tubo formerà uno strato in superficie al mezzo. Dopo che i moduli si sono depositati, utilizzare una pipetta sierologica da 10 millilitri con bocca larga per trasferirli in un tubo conico da 15 millilitri. Vortexare il tubo conico da 15 millilitri, quindi lasciare depositare i moduli per altre due volte.

I moduli sedimentati dal secondo e terzo vortice vengono trasferiti anche essi nel tubo da 15 millilitri. Dopo che tutti i moduli sono stati rimossi dal tubo e raccolti insieme, portare il volume del mezzo nel tubo a cinque millilitri. I moduli sono ora pronti per essere rivestiti con cellule endoteliali, come verrà mostrato successivamente per preparare le cellule endoteliali al rivestimento dei moduli.

Prima di tutto, rimuovere il mezzo dalle cellule e lavare con PBS. Dopo aver rimosso il PBS, aggiungere tre millilitri di tripsina EDTA e incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, risospendere le cellule in sette millilitri di mezzo e trasferirle in un tubo da 15 millilitri.

Contare le cellule utilizzando un emocitometro; saranno necessarie cinque volte 10 alla sesta cellule endoteliali per millilitro di moduli compattati sul fondo del tubo conico. Centrifugare le cellule a 300 ×g per cinque minuti. Risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di mezzo per cellule endoteliali.

Ora aggiungere cinque millilitri di mezzo contenente cellule endoteliali ai moduli. I moduli vengono incubati con le cellule endoteliali, sia in condizioni statiche che dinamiche: per l'incubazione statica, mescolare i moduli con le cellule endoteliali mediante inversione, quindi posizionare il tubo in posizione verticale a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Dopo 15 minuti, invertire nuovamente il tubo e incubare a 37 gradi Celsius per altri 15 minuti.

Per incubare i moduli con le cellule endoteliali in modo dinamico, agitare delicatamente il tubo da 15 millilitri a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Al termine dell'incubazione con le cellule endoteliali, trasferire i moduli in una piastra non trattata per colture cellulari e incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius; il giorno successivo, posizionare i moduli in una nuova piastra non trattata per colture cellulari con mezzo fresco per rimuovere le cellule endoteliali non aderite. Incubare i moduli rivestiti con cellule endoteliali a 37 gradi Celsius fino a quando le cellule copriranno il 100% della superficie dei moduli.

Questo richiede solitamente circa sette giorni. I moduli appariranno cilindrici quando vengono rimossi per la prima volta dal tubo. Se sono ricoperti da cellule endoteliali, possono contrarsi fino al 50% del volume e assumere una forma ovale, oltre a diventare più densi e opachi quando osservati al microscopio ottico.

In queste immagini, il diametro e la lunghezza dei moduli sono indicati rispettivamente con d e l. Questa immagine successiva mostra cellule Hep G2 incorporate, uniformemente distribuite all'interno dei moduli al momento della fabbricazione. Le cellule hanno mantenuto un'elevata vitalità, indicata dal colore verde delle cellule vive.

Le cellule morte appariranno di colore rosso quando le cellule endoteliali sono confluenti. Sulla superficie dei moduli si forma una giunzione stretta, visibile mediante immunofluorescenza. La colorazione della cadherina VE nell'analisi del trasferimento di massa ha dimostrato che i moduli sono in grado di sostenere elevate densità cellulari senza sviluppare un nucleo necrotico a causa di un trasporto inadeguato di ossigeno, fenomeno spesso problematico nei tessuti di maggiori dimensioni.

In questo esempio, la colorazione con massen Tri chro di moduli piccoli tipici mostra che i moduli hanno mantenuto una distribuzione uniforme ed elevata di cellule vive sette giorni dopo la fabbricazione. Al contrario, un elevato numero di cellule morte si era formato nel nucleo dei moduli più grandi, lasciando soltanto un sottile strato di cellule vitali. Sono stati inoltre prodotti moduli con una miscela di collagene e un polimero ine oppure contenenti microsfere a rilascio controllato di farmaco.

Qui, quando le cellule EC hm sono seminate su moduli di collagene palin, i moduli mantengono la loro forma cilindrica e presentano proprietà di adesione cellulare limitate rispetto ai moduli di solo collagene. Viene mostrata un'immagine al microscopio ottico di un modulo di collagene contenente microsfere biodegradabili a base di PLGA. Diversi saggi in vitro si sono dimostrati compatibili con questi moduli.

Ad esempio, in un saggio di angiogenesi, formazioni simili a capillari su un modulo seminato con cellule endoteliali possono essere facilmente rilevate e quantificate dopo cinque giorni di incubazione con cellule staminali derivate dal tessuto adiposo. In un altro esempio, immagini al microscopio confocale di un saggio live/dead sui moduli mostrano le cellule vive colorate in verde e le cellule morte colorate in rosso. Infine, i moduli sono stati utilizzati anche in camere microfluidiche e impiantati in topi e ratti per studiare l'interazione tra diversi tipi cellulari e il modo in cui i microtessuti vengono rimodellati in risposta all'organismo ospite.

Al termine della procedura, i moduli possono essere coltivati in una piastra di Petri o in altri contenitori come un biorreattore o un dispositivo microfluidico. Questo metodo può essere inoltre adattato per creare diversi tipi di tessuto utilizzando varie combinazioni di tipi cellulari o tubi con diametro differente. Grazie per aver guardato.