Determinazione della mitocondriale Oxygen Species potenziale di membrana e reattiva in neuroni corticali di ratto dal vivo

L'obiettivo di questa procedura è determinare il potenziale di membrana mitocondriale e i livelli di specie reattive dell'ossigeno nei neuroni corticali primari utilizzando rispettivamente le sonde fluorescenti, TMRM e H 2D CFD. Ciò si ottiene preparando prima le concentrazioni di stock e di lavoro del TMRM e dell'H 2D CFDA. Il secondo passo consiste nell'incubare i neuroni corticali con TMRM e H 2D CFDA a temperatura ambiente per 45 minuti in tampone stradale thailandese.

Il terzo passo consiste nell'visualizzare l'intensità di fluorescenza di TMRM e DCF nei neuroni corticali vivi utilizzando rispettivamente l'emissione di eccitazione di 5, 15, 5, 17 nanometri e 4, 88, 5, 15 nanometri. Le variazioni della TMR in fluorescenza saranno monitorate in presenza dell'unco FCCP mitocondriale, mentre le variazioni della fluorescenza del DCF saranno monitorate in presenza di perossido di idrogeno. Il passaggio finale di questa procedura è la raccolta, la normalizzazione e l'analisi dei dati.

In definitiva, i risultati si ottengono tracciando un grafico che mostra i livelli relativi di intensità di fluorescenza TMRM e DCF prima e dopo il trattamento con FCCP e perossido di idrogeno, rispettivamente. Ciao, sono Joanna Koska. Benvenuti nel mio laboratorio alla Loyola University di Chicago.

Oggi vi mostreremo come misurare il potenziale di membrana mitocondriale e le specie reattive dell'ossigeno nei neuroni corticali di ratto. La procedura sarà dimostrata da dhi. Ciao, sono de Denise Jossi.

Utilizzando questa procedura, il potenziale di membrana mitocondriale può essere misurato a singola etichetta mitocondriale e le specie reattive dell'ossigeno a singola etichetta cellulare. Quindi iniziamo. Preparare una scorta da 10 millimolari di TMRM sciogliendo cinque milligrammi di TMRM in un millilitro di vortice di ossido di dimetilsolfo anidro per un minuto.

Quindi fai in modo che le aliquote memorizzino le aliquote a meno 20 gradi Celsius. Proteggere dalla luce e utilizzare entro un mese. Successivamente, preparare un ceppo da 10 millimolari di H 2D CFDA sciogliendo 4,87 milligrammi di H 2D CFDA in un millilitro di ossido di dimetilsolfo anidro.

Allo stesso modo, agitare per un minuto, quindi fare aliquote e conservarle a meno 20 gradi Celsius. Proteggere dalla luce e utilizzare entro una settimana per caricare prima i neuroni corticali del ratto con TMRM. Lavare i neuroni coltivati tre volte con il tampone di tiro.

Quindi preparare 20 nanomolari TMRM diluendo il 10 millimolare TMRM 1000 volte in tb. Quindi aggiungere due microlitri di TMRM diluito per un millilitro di tb. Incubare i neuroni con TMRM per 45 minuti al buio a temperatura ambiente.

Dopo 45 minuti, montare il piatto di coltura sul tavolino del microscopio e avviare l'imaging per caricare i neuroni corticali di ratto con H 2D CFDA, lavare i neuroni coltivati tre volte con tb. Successivamente, preparare due micromolari di H 2D CFDA diluendo il campione di CFDA H 2D da 10 millimolari 10 volte in tb. E poi aggiungere due microlitri di H 2D CFDA diluito per un millilitro di tb.

Quindi incubare i neuroni con H 2D CFDA per 45 minuti al buio a temperatura ambiente dopo 45 minuti. Lavare i neuroni quattro volte con TB per rimuovere l'indicatore fluorescente in eccesso prima di ottenere immagini per eseguire l'imaging dal vivo dei neuroni incubati con la microscopia a scansione laser confocale TMRM con l'applicazione del programma di serie temporali dal vivo. Applicare una bassa risoluzione e una potenza laser attenuata per ridurre al minimo il tempo necessario per ottenere le immagini ed evitare lo sbiancamento delle foto.

Quindi, regola la messa a fuoco dei neuroni montati caricati con TMRM utilizzando la luce riflessa. Esaminare la fluorescenza TMRM mediante illuminazione a cinque 14 nanometri e rilevamento a cinque 70 nanometri. Impostare il guadagno di rilevamento della fotocamera appena al di sotto del livello di saturazione una volta impostati tutti i parametri, che includono la risoluzione, il rilevamento della potenza laser, il guadagno della fotocamera e l'intervallo di time-lapse per ottenere le immagini.

Non modificare queste impostazioni tra un esperimento e l'altro. Quindi, cambia il campo. Inizia a raccogliere immagini per testare i cambiamenti nello stimolo delta PSY M, come ad esempio un micromolare di FCCP o due microgrammi per millilitro di oligomicina, che depolarizzeranno o iperpolarizzeranno significativamente il potenziale della membrana mitocondriale rispettivamente.

Questi cambiamenti si rifletteranno in una diminuzione dell'intensità di fluorescenza TMRM rispetto all'intensità di fluorescenza basale nel caso di FCCP o in un aumento dell'intensità di fluorescenza TMRM. Nel caso di un LIGA myin sin per eseguire l'imaging dal vivo di neuroni incubati con H 2D CFDA, montare prima il piatto di coltura sul tavolino di un microscopio, regolare la messa a fuoco delle cellule utilizzando la luce riflessa. Esaminare la fluorescenza DCF per eccitazione a 4 88 nanometri ed emissione a cinque 15 nanometri.

Quindi, regolare la potenza del laser da cinque a 7% di rilevamento di un guadagno e una risoluzione di 2 56 per 2 56. Non modificare queste impostazioni tra un esperimento e l'altro. Quindi impostare la frequenza per ottenere immagini dal vivo.

Utilizzando il programma Time series, selezionare un nuovo campo e iniziare ad acquisire immagini per rilevare le variazioni dei livelli di R os. Trattare le cellule con 100-200 micromolari di perossido di idrogeno. Ciò si rifletterà in un aumento dell'intensità della fluorescenza DCF rispetto al livello basale.

Utilizzare lo strumento regione di interesse del programma LSM per selezionare le aree. Quindi seleziona le ROI dalle regioni mitocondriali o le ROI dall'intero corpo cellulare nelle celle immagine. Per misurare le intensità di fluorescenza rispettivamente di TMRM o ROS.

Seleziona le regioni accanto alle celle. Per calcolare l'intensità della fluorescenza di fondo, eseguire diverse misurazioni e per calcolare l'intensità media del fondo, sottrarre l'intensità media della fluorescenza di fondo dalle intensità medie di fluorescenza delle regioni di interesse in ciascuna cella per ogni punto temporale utilizzando Microsoft Excel. Dopo aver sottratto l'intensità di fondo, normalizzare l'intensità di fluorescenza TMRM o DCF alla fluorescenza di base.

Utilizzando questa formula, utilizzare il programma di grafici Sigma per generare il grafico che mostra le variazioni dell'intensità della fluorescenza nel tempo. Ecco un esempio di un'immagine a fluorescenza di neuroni corticali di ratto incubati con TMRM. L'aggiunta di unco mitocondriale F-C-C-P-A porta alla depolarizzazione mitocondriale e alla perdita dell'intensità della fluorescenza TMRM.

Il livello di fluorescenza del TMRM al basale rimane stabile prima dell'aggiunta di FCCP. L'analisi quantitativa delle variazioni della fluorescenza TMRM nel tempo mostra una diminuzione significativa della fluorescenza TMRM dopo l'aggiunta di FCCP. Ecco un esempio di un'immagine a fluorescenza di neuroni corticali di ratto caricati con DCF.

Il livello di fluorescenza del DCF al basale rimane invariato nei primi 120 secondi prima dell'applicazione del perossido di idrogeno. L'aggiunta di perossido di idrogeno determina un aumento dell'intensità della fluorescenza del DCF nei corpi cellulari. Le misurazioni time-lapse della fluorescenza DCF mostrano i suoi livelli costanti che sono aumentati dopo i trattamenti con perossido di idrogeno.

In questa procedura, è importante ricordare di utilizzare una bassa potenza del laser e un'elevata velocità di scansione per evitare gli artefatti dovuti allo sbiancamento delle foto e alla fototossicità. Buona fortuna con il tuo esperimento.