Determinazione di strutture molecolari di glicoproteine ​​dell'HIV Busta con Cryo-Electron Positron e automatizzato Sub-tomogramma Averaging

Oltre 60 milioni di persone sono state infettate dall'HIV, il virus che causa l'AIDS. L'HIV E L'AIDS sono una crisi sanitaria globale e, sebbene gli intensi sforzi di ricerca abbiano notevolmente prestato loro la vita di individui infetti, un vero vaccino rimane sfuggente. Uno dei principali obiettivi della ricerca sui vaccini contro l'HIV è la glicoproteina dell'involucro, che l'HIV utilizza per entrare nelle cellule bersaglio.

In questo video, dimostriamo come otteniamo le strutture di questa importante proteina utilizzando una tecnica di imaging chiamata tomografia crioelettronica. A partire dall'HIV purificato, mostriamo le fasi della preparazione di campioni congelati, le fasi della registrazione di immagini al microscopio elettronico da questi campioni congelati e le fasi della conversione di queste immagini in modelli strutturali che potrebbero essere utili per la progettazione del vaccino contro l'HIV. Un aspetto unico di ciò che presentiamo in questo video è che il lavoro sarà dimostrato dai membri del suo laboratorio che abbracciano una vasta gamma di età, dagli studenti delle scuole medie e superiori agli studenti universitari e post-laurea, fino ai borsisti post-dottorato e agli scienziati senior.

La preparazione di campioni di virus vitrificati adatti alla tomografia crioelettronica si ottiene diffondendo una sospensione acquosa di virus attraverso piccoli fori in un film di carbonio supportato da una griglia di rame, e quindi congelando rapidamente i virus. L'obiettivo di questa fase è preparare un campione congelato di virus intatti catturati in uno stato quasi nativo. Per iniziare, le griglie sono posizionate all'interno di un'unità di scarica a incandescenza.

Questo dispositivo pulisce le griglie esponendole a gas ionizzato. Ora che le griglie sono pronte per l'uso, viene preparata una sospensione di virus mescolati con piccole particelle d'oro. Queste particelle sono essenziali per la raccolta e l'elaborazione dei dati.

Successivamente, una goccia di sospensione virale viene posta sulla griglia appena pulita al plasma. La griglia viene poi caricata in un robot, che la tampona con carta da filtro, riducendo la goccia a un sottile film di liquido. Il campione viene quindi immerso nell'etano liquido, che congela rapidamente i virus a una velocità superiore a 100.000 kelvin al secondo.

La griglia congelata a tuffo viene quindi trasferita in una scatola di stoccaggio per il trasporto al microscopio. Questa operazione viene ripetuta fino a quando non viene congelato il numero desiderato di griglie. Ora che le griglie dei campioni di virus sono pronte, il passo successivo è caricarle nel microscopio.

Per l'imaging, questo può essere fatto manualmente o con l'assistenza robotica. Quando le griglie dei campioni vengono caricate manualmente, l'utente si siede in una stazione specializzata dove i campioni possono essere manipolati con azoto liquido, i campioni vengono posti in una camera portatile raffreddata ad azoto che viene sigillata, evacuata e quindi collegata al microscopio. I microscopi più recenti sono in grado di caricare i campioni in modo più automatizzato.

In questo caso, in un microscopio Titan Cryos, i campioni congelati vengono consegnati al microscopio dall'utente e quindi caricati roboticamente con le griglie dei campioni caricate nel microscopio. Ogni griglia può essere esaminata dall'utente prima che l'imaging possa iniziare. I parametri del microscopio sono impostati per ogni area della griglia del campione che presenta caratteristiche di interesse.

In questo caso, le caratteristiche sono i virus dell'HIV. Man mano che viene definita ogni nuova area, il computer del microscopio memorizza i parametri di imaging specifici dell'area. Quando l'utente ha definito tutte le posizioni di interesse, il computer rivisita automaticamente ogni posizione e raccoglie un set di dati.

Ogni set di dati viene raccolto inclinando la griglia del campione rispetto al fascio di elettroni, assicurandosi al contempo che il fascio rimanga focalizzato nello stesso punto della griglia. La raccolta dei dati nella microscopia elettronica ha tradizionalmente richiesto agli utenti di sedersi al microscopio e interagire fisicamente con l'apparecchiatura. Questo stile di interazione al microscopio è mostrato qui durante una visita del presidente Obama a una fabbrica di informazioni.

I recenti progressi nelle interfacce dei computer per microscopi consentono ora agli utenti di monitorare e regolare la raccolta dei dati in tempo reale da un computer remoto in laboratorio o altrove. Per visualizzare le forme dell'involucro, i picchi glicoproteici devono calcolare la media delle informazioni provenienti da centinaia di singole immagini per aumentare il segnale. Si tratta di un processo ad alta intensità di calcolo, che viene realizzato utilizzando un cluster di computer chiamato Bio Wolf.

Situato presso il NIH, sono stati sviluppati metodi potenti per estrarre i singoli volumi e calcolare la media delle informazioni utilizzando algoritmi in grado di funzionare ad alti livelli di rumore. Intrinseche a questo tipo di dati, le mappe di densità ottenute sia da virus nativi che da virus complessi a molecole biologicamente importanti forniscono un ricco database di informazioni sulla biologia strutturale dell'HIV. Le mappe di densità prendono vita con dettagli molecolari quando i dati vengono combinati con le informazioni provenienti dalla cristallografia a raggi X delle singole subunità che compongono la spike della glicoproteina dell'involucro.

I dati che escono da questi tomo possono essere molto densi e difficili da interpret. 3D il software per l'industria dell'intrattenimento può essere utilizzato per visualizzare i modelli 3D aggiungendo colori, trame e illuminazione, rendendoli più facili da analizzare. I software di visualizzazione comunemente usati includono Mirror 3D Studio Max e Maya.

Abbiamo appena dimostrato le procedure passo dopo passo su come ottenere modelli molecolari per la struttura dell'involucro. Glicoproteina, a partire dall'HIV purificato. Utilizzando questo metodo, abbiamo anche determinato le strutture per la glicoproteina dell'involucro in complesso con una varietà di molecole che possono legare e utilizzare il virus.

Qui mostriamo un esempio per la struttura della glicoproteina dell'involucro in complesso con un anticorpo chiamato B12. Capire perché alcune molecole possono legarsi e utilizzare il virus mentre altre no è molto importante per la progettazione razionale di un vaccino. Determinare le strutture molecolari delle glicoproteine dell'involucro dell'HIV o di altri virus, come l'influenza e l'Ebola, è la chiave per comprendere l'ingresso e l'utilizzo virale.

Come avete visto, la tomografia crioelettronica sta emergendo come uno strumento potente per raggiungere questo obiettivo.