Estrazione di vescicole extracellulari: una tecnica per isolare le vescicole extracellulari da campioni di tessuto intero utilizzando la centrifugazione differenziale

Nei tessuti interi, le vescicole extracellulari o vescicole extracellulari vengono rilasciate dalle cellule nel liquido interstiziale. Questi includono corpi apoptotici, microvescicole ed esosomi. Le vescicole extracellulari svolgono un ruolo importante nel mantenimento della comunicazione da cellula a cellula.

Per estrarre le vescicole extracellulari, iniziare prelevando un intero campione di tessuto.

Trattare il tessuto con un tampone di dissociazione appropriato. I componenti del tampone di dissociazione disintegrano la matrice extracellulare presente nel tessuto, allentando infine le cellule.

Trasferire la sospensione in un omogeneizzatore e disgregare meccanicamente ulteriormente il tessuto per dissociarlo e rilasciare le cellule.

Successivamente, centrifugare l'omogenato a bassa velocità per pellettizzare le cellule e i frammenti di tessuto mentre le vescicole extracellulari rimangono nel surnatante.

Assumere il surnatante in un tubo nuovo. Centrifugare ad alta velocità per pellettizzare la maggior parte dei corpi apoptotici di dimensioni maggiori, lasciando le vescicole extracellulari di dimensioni più piccole nel surnatante.

Raccogliere il surnatante contenente EV in una siringa. Filtra i componenti per rimuovere eventuali corpi apoptotici rimanenti e raccogliere la popolazione di EV di piccole dimensioni.

Centrifugare il filtrato per ottenere le EV nel pellet. Scartare il tampone rimanente e risospendere il pellet EV in una soluzione di saccarosio. Questa soluzione crea un ambiente isotonico in cui le vescicole extracellulari possono mantenere la loro morfologia.

Ora, conserva le sospensioni EV a quattro gradi Celsius fino a nuovo utilizzo.

Per iniziare, preparare 10 millilitri di tampone di dissociazione in Hibernate-E Medium per ogni 0,4-1,0 grammi di tessuto. Aggiungere il tessuto intero, fresco o congelato, al tampone in una provetta da 50 millilitri e incubare in un bagno di acqua calda a 37 gradi Celsius per 20 minuti.

Successivamente, aggiungere gli inibitori della proteasi e della fosfatasi per una concentrazione finale di 1x nel tampone di dissociazione. Versare la soluzione con il fazzoletto in un omogeneizzatore Dounce largo. Utilizzare circa 30 colpi lenti per campione per dissociare delicatamente il tessuto.

Quindi, trasferire il tessuto dissociato e la soluzione tampone in una provetta conica da 50 millilitri. Centrifugare a 500 x g e a 4 gradi Celsius per 5 minuti per pellettare le cellule e i frammenti di tessuto fibroso o coesivo rimanenti.

Trasferire i surnatanti in una provetta conica pulita da 50 millilitri e centrifugare a 2.000 x g e a 4 gradi Celsius per 10 minuti per pellettare e scartare i detriti cellulari di grandi dimensioni.

Trasferire questo surnatante in una provetta conica pulita da 50 millilitri e centrifugare a 10.000 x g e a 4 gradi Celsius per 40 minuti per pellettare eventuali vescicole più grandi indesiderate o piccoli corpi apoptotici. Decantare il surnatante attraverso un filtro da 0,45 micrometri in una provetta per ultracentrifugazione pulita da 12 millilitri.

Successivamente, ultracentrifugare il campione a 100.000 x g e a 4 gradi Celsius per 2 ore per pellettare piccole EV. Decantare il surnatante e lasciare le provette per ultracentrifugazione capovolte per 5-10 minuti, picchiettando frequentemente per rimuovere eventuali residui di liquido sui lati delle provette.

Quindi, risospendere il pellet EV in 1,5 millilitri di tampone di saccarosio 0,25 molari. Coprire i tubi con parafilm e poi far vorticare le vescicole extracellulari in soluzione. Far oscillare le provette dell'ultracentrifuga per 15-20 minuti a temperatura ambiente e poi agitare ancora una volta.

Centrifugare brevemente le provette a una velocità inferiore a 1.000 x g per recuperare la sospensione liquida sul fondo della provetta. Se necessario, conservare la sospensione a 4 gradi Celsius durante la notte.