Name: Isolamento e caratterizzazione di RNA contenenti esosomi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Scopri l'isolamento e la caratterizzazione di esosomi contenenti RNA da colture cellulari e fluidi biologici. Questo metodo utilizza ultracentrifugazione, microscopia elettronica e citometria a flusso per analizzare il contenuto molecolare.

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Questo studio è stato finanziato dal Consiglio svedese della ricerca (K2008-57x-20 676-01-3).

1. Isolamento Exosome <ol><li> Crescere le cellule in mezzo con exosome senza siero. Pertanto, qualsiasi siero aggiunti al mezzo di coltura cellulare dovrebbe essere impoverito di esosomi da ultracentrifugazione a 120 000 xg per tutta la notte a 4 ° C prima dell'uso. </li><li> Trasferire la sospensione di cellule di tubi conici. </li><li> Centrifugare a 300 xg per 10 minuti a 4 ° C per agglomerare le cellule. </li><li> Trasferire il surnatante per ultracentrifuga tubi e se non completamente pieno aggiungere PBS. </li><li> Centrifugare il campione a 16 500 xg per 20 minuti a 4 ° C per rimuovere ulteriori cellule e detriti cellulari. </li><li> Filtrare il surnatante con un filtro 0,2 micron per rimuovere le particelle più grandi di 200 nm. </li><li> Trasferire il surnatante filtrato per tubi ultracentrifuga nuove e sigillare i tubi prima ultracentrifuga a 120 000 xg per 70 minuti a 4 ° C per far sedimentare il esosomi. </li><li> Scartare il surnatante. </li><li> Per massimo recupero exosome, risospendere il exosome arricchireed pellet ripetutamente in un piccolo volume (circa 3 x 50 ml) di un buffer adeguato. Questo buffer dipende dal esperimenti previsti a valle dopo l'isolamento exosome. Per esempio, tampone di lisi viene utilizzato per l'isolamento delle proteine ​​e RNA, PBS viene utilizzato per la microscopia elettronica e di citometria a flusso e funzionale per gli studi medi possono essere preferiti. </li></ol> Nota; esosomi possono anche essere isolate da fluidi corporei diversi, come il plasma, utilizzando la stessa procedura per i terreni di coltura delle cellule. Per fluidi viscosi, può essere necessario diluire il campione con PBS prima della centrifugazione e dalla filtrazione passo. In relazione alla velocità di centrifugazione per il punto 5 di cui sopra, può essere aumentato a 29 500 xg, e il ultracentrifugazione al punto 7 può essere esteso a 90 minuti 18. Se il campione deve essere ulteriormente purificato il exosome pellet può essere quotata in un gradiente di saccarosio e il esosomi sarà principalmente si trovano nella frazione representing una densità di 1,13-1,19 g / ml 2. 2. Identificazione Exosome al microscopio elettronico <ol><li> Per ulteriori eliminare proteine ​​contaminanti, risospendere il pellet exosome arricchito in PBS e ultracentrifuga a 120 000 xg per 70 minuti a 4 ° C a ri-pellet il esosomi. </li><li> Prendete una piccola aliquota del campione per l'isolamento delle proteine ​​e la misurazione delle proteine ​​totali. Assicurarsi che solo una piccola parte del campione è lisati e utilizzato per la misurazione delle proteine ​​e mantenere intatto il esosomi, risolto in PBS, separati o su ghiaccio a -80 ° C per ulteriori esperimenti. </li><li> Mettere una goccia, circa 10 mg di proteina exosomal del esosomi intatto risospeso in PBS, su un Parafilm. Poi, con una pinza, delicatamente la posizione di una griglia di carbonio rivestito formvar nichel sopra ogni goccia per 30-60 minuti. Assicurarsi che la griglia è posizionato con il lato di fronte al calo rivestimento contenente esosomi. </li><li> Luogo tre gocce, ogni microlitri 30, di PBS su tha Parafilm e lavare la griglia di posizionamento in sequenza la griglia sopra delle gocce di PBS, e utilizzare una carta assorbente in mezzo. Utilizzare la carta assorbente con delicatezza solo tenendolo vicino al lato della griglia, senza contatto con la superficie rivestita. </li><li> Fissare il campione mediante deposito un calo del 2% paraformaldeide sul Parafilm e posizionare la griglia nella parte superiore della goccia per 10 minuti. </li><li> Ripetere la fase di lavaggio di cui al punto 4, prima di immunostaining con un anticorpo appropriato. Gli anticorpi utilizzati sono anti-CD63 e anti-MHC di classe II. Microscopia elettronica può essere eseguita anche senza immunocolorazione come esosomi possono essere identificati esclusivamente in base alle dimensioni e morfologia. Tuttavia, si consiglia di valutare l', morfologia dimensioni e la presenza di una proteina di membrana per una convalida più conclusivo. </li><li> Trasferire la griglia per un calo del 30 microlitri della anticorpo primario di scelta e incubare per 40 minuti. Lavare, ripetendo il punto 4, ma usare lo 0,1% di BSA in PBS invece di PBS solo. </li><li> Ripetete il punto 7, ma con la nm-oro 10 anticorpo marcato secondario e lavare con PBS solo. </li><li> Post-fissare il campione con l'aggiunta di un calo del 2,5% glutaraldeide al Parafilm e incubare la griglia nella parte superiore della goccia per 10 minuti. Ripetere il lavaggio al punto 4, ma utilizzano cinque gocce di acqua deionizzata invece di tre gocce di PBS. </li><li> Contrasto con il campione con l'aggiunta di una goccia di acetato di uranile al 2% al Parafilm e incubare la griglia nella parte superiore della goccia per 15 minuti. </li><li> Incorpora il campione con l'aggiunta di una goccia di metilcellulosa 0,13% e acetato di uranile 0,4% al Parafilm e incubare la griglia nella parte superiore della goccia per 10 minuti. </li><li> Rimuovere il liquido in eccesso con delicatezza usando una carta assorbente, prima di posizionare la griglia su un foglio con il lato rivestito e lasciare asciugare per 5 minuti. </li><li> Esaminare i preparativi con un microscopio elettronico o conservare le griglie in una scatola di griglia per il lavoro futuro. </li></ol> 3.Caratterizzazione Exosome mediante citometria di flusso Come esosomi sono troppo piccoli per essere rilevato da apparecchiature con corrente di citometria a flusso, è necessario legare il primo esosomi di perle legate agli anticorpi (Figura 1). Queste sfere possono essere acquistati come un prodotto già pronto o fatto in laboratorio con l'anticorpo di scelta. A seconda della provenienza exosomal cellulari, gli anticorpi diversi possono essere accoppiati a perle che può essere sia di carattere magnetico o lattice. Al momento stiamo utilizzando anti-MHC di classe II o perle di rivestimento anti-CD63 per questa analisi. <ol><li> Per l'uso di "fatti in casa" perle legate agli anticorpi, usiamo 4 sfere di lattice micron rivestita con anticorpi anti-CD63. Lavare 25 microlitri 4 sfere di lattice micron (30 x 10 6 perline) due volte in 100 l MES buffer, 3 000 xg per 15-20 minuti e ridisciogliere il pellet in 100 microlitri di buffer MES. Preparare la miscela di anticorpi che contiene un volume uguale di 12,5 mcg anticorpi con lo stesso volume di tampone MES. Aggiungere ilperline alla miscela di anticorpi ed incubare in agitazione tutta la notte a temperatura ambiente. Lavare le perline anticorpi per tre volte con PBS (3 000 xg per 20 minuti) e sciogliere il precipitato in 100 ml di buffer di memoria (con una concentrazione finale di 300 000 perline / mL). </li><li> Per ogni campione (ogni anticorpo), continuare con un volume pari a un minimo di 30 mg di proteina exosomal (del esosomi intatto risolto in PBS) per ~ 100 000 perle legate agli anticorpi. </li><li> Incubare esosomi e perline, in un volume totale di 300 ml PBS, durante la notte a 4 ° C sotto movimento dolce. </li><li> Blocco con l'aggiunta di 300 ml di 200 mM glicina e incubare per 30 minuti. </li><li> Lavare i exosome-tallone complessi due volte in tampone di lavaggio (siero 1-3% in PBS), 600 xg per 10 minuti. </li><li> Incubare la exosome-tallone complessi con 50 microlitri di anticorpi IgG a 4 ° C. Lavare i exosome-tallone complessi due volte in tampone di lavaggio come descritto al punto 5. </li><li> Aggiungere 90 microlitri di buffer di lavaggio e 10 microlitrianticorpi di scelta (idealmente anti-CD9, anti-CD63 o anti-CD81) al exosome-tallone complessi e incubare per 40 minuti in movimento dolce. Lavare i exosome-tallone complessi due volte in tampone di lavaggio come descritto al punto 5. </li><li> Aggiungere 300 microlitri di buffer di lavaggio e acquisire dati in citometria a flusso. </li></ol> Come discusso in precedenza, perline diversi possono essere utilizzati, come sfere di lattice, come descritto nel protocollo o sfere magnetiche. Se grani magnetici sono utilizzati al posto, si prega di notare, che il protocollo è leggermente diverso. Il passo di blocco (punto 4) non è richiesto e il lavaggio viene effettuato inserendo il tubo in un supporto magnetico al posto di una centrifugazione. Il buffer di memoria usato per la "casa" perle legate agli anticorpi, contengono glicina 0,1% e 0,1% di sodio azid in PBS, con un pH di 7,2. Importante, assicurarsi di utilizzare il siero exosome impoverito per il tampone di lavaggio citometria a flusso (1-3% di siero in PBS), per evitare qualsiasiesosomi siero contaminare l'analisi. Nota: durante l'esecuzione di caratterizzazione exosome utilizzando anticorpi perline accoppiate, è importante riconoscere che è solo una sottopopolazione specifica, specifico per l'anticorpo utilizzato, che è isolato e caratterizzato. 4. Rilevamento Exosome da Western Blot Western Blot è un metodo ben definito e noi non entreremo nei dettagli per quanto riguarda il metodo stesso, ma attenzione sull'importanza di un isolamento delle proteine ​​adatto prima della Western Blot e gli anticorpi diversi utilizzati. <ol><li> Sciogliere il exosome pellet nel buffer di lisi di proteine ​​di scelta e di pipettaggio a fondo, seguito da vortice di miscelazione. Per ulteriori lisare il esosomi, sonicare il campione in un bagno d'acqua da 3 x 5 minuti con vortice di miscelazione in mezzo. Infine centrifuga il campione, 13 000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente, e trasferire il surnatante in una nuova provetta Eppendorf. </li><li> Misure le proteine ​​totali con un metodo di scelta e carico di 20-50 mg di proteine ​​per bene. </li><li> Separino e trasferire le proteine ​​con elettroforesi su gel e elettroblotting. </li><li> Blocco e lavare la membrana prima di eseguire immunocolorazione contro le proteine ​​arricchito in esosomi. </li><li> Rilevare la proteina specifica chemiluminescenza, sistema di imaging digitale e software di analisi. </li></ol> Poiché non vi sono marcatori exosome specifico, le proteine ​​che si arricchiscono in esosomi, da tutte le diverse origini cellulari, sono comunemente usati per il rilevamento exosome. Si tratta di proteine ​​come tetraspanins (ad esempio CD9, CD63 e CD81), citoscheletro proteina associata (ad es Ezrin) e le proteine ​​coinvolte nella biogenesi multivescicolari (ad esempio Tsg101 e Alix). Altre proteine ​​che sono comunemente rilevati in esosomi sono Flotillin, Hsc70 e proteine ​​rab diversi, ecc Tuttavia, ci sono anche proteine ​​specifiche delle cellule si trovano in esosomi come A33 (cellule epiteliali intestinali), CD3(Cellule T) e MHC di classe II (cellule presentanti l'antigene). Così, a seconda del tipo di cellula da quello che il esosomi vengono rilasciati dai marcatori per la rilevazione può variare. Come altri compartimenti della cellula anche in grado di produrre vescicole, si raccomanda inoltre di determinare la presenza di proteine ​​di questi compartimenti, come reticolo endoplasmatico (ad esempio calnexin e Grp78) e l'apparato di Golgi (ad esempio GM130). Così, la mancanza di queste proteine ​​indica contaminazione scarse o nulle vescicole di altri compartimenti nel campione studiato. 5. Isolamento di exosomal RNA e l'RNA analisi <ol><li> Sciogliere il exosome pellet in tampone di lisi RNA di scelta e di eseguire l'estrazione dell'RNA. Diversi kit di isolamento dell'RNA può essere utilizzato a seconda esperimenti a valle, ma i metodi basati colonna fornisce campioni con uno spettro più ampio di RNA. Attualmente stiamo utilizzando miRCURY RNA Isolation Kit da Exiqon, ma altri kit può essere adatto a seconda della scdomanda ientific a portata di mano. </li><li> Quando si esegue l'isolamento di RNA è importante lavorare in un ambiente privo di RNasi. Pertanto l'uso di acidi nucleici e priva di nucleasi puntali e pulire sia da banco e attrezzature esenti da inquinanti ed RNasi. </li><li> Per l'isolamento di RNA, utilizzando miRCURY kit di purificazione dell'RNA, sciogliere il exosome pellet in 350 ml di soluzione di lisi ed eseguire vortice di miscelazione per 15 secondi. </li><li> Aggiungere 200 ml di etanolo al 95% e vortice di miscelazione per 10 secondi. </li><li> Inserire una colonna in un tubo di raccolta e trasferimento dei esosomi lisato alla colonna e centrifugare 1 minuto a 14 000 x g. </li><li> Lavare tre volte con l'aggiunta di 400 ml di Wash Solution alla colonna contenente l'RNA exosomal e centrifugare per 1 minuto a 14 000 x g. </li><li> Centrifugare la colonna per 2 minuti a 14 000 xg per assicurarsi che la colonna sia asciutta e collocare la colonna a secco in un RNasi-free provetta Eppendorf. </li><li> Aggiungere 50 microlitri Elution Buffer alla colonna e centrifugare per 2 minuti a 200 xg, seguito da 1 minuto a 14 000 x g. </li><li> Continuare con la isolato RNA o conservata in -80 ° C. </li></ol> Per il rilevamento e l'analisi del RNA totale estratto exosomal, utilizzare un Agilent 2100 Bioanalyzer con l'RNA 6000 Nano Kit o RNA 6000 Pico. L'analisi mostra il rendimento exosomal RNA e distribuzione delle dimensioni. 6. Rappresentante Risultati Esosomi sono troppo piccole per essere rilevate con i metodi disponibili citometria a flusso, e sono quindi collegato legate agli anticorpi perle prima di essere analizzati (Figura 1). Come exosome-tallone complessi in grado di aggregare la citometria a flusso scatter plot può contenere diverse popolazioni di singole, doppie e triple perline (Figura 2A). La freccia indica il singolo perle che vengono ulteriormente analizzate. Un CD63 positivo solo perline exosome popolazione rispetto al suo controllo isotipo è mostrato in Figura 2B. e_content "&gt; A causa delle piccole dimensioni delle esosomi, possono solo essere visualizzati direttamente con il microscopio elettronico, e non al microscopio ottico. tipiche caratteristiche morfologiche di esosomi hanno una forma rotonda e 30-100 nm vescicole membrana dimensioni. Nella Figura 3, microscopia elettronica fotografie mostrano esosomi immunostained (A) con oro-anticorpo marcato per CD63 (indicata dalla freccia) e non immunostained esosomi (B). Per determinare che le vescicole isolate sono davvero esosomi e per caratterizzare ulteriormente le proteine ​​exosomal, Western Blot è comunemente usato. Figura 4 mostra l'assenza di calnexin, un marcatore reticolo endoplasmatico. Questo indica la contaminazione 'di vescicole dal reticolo endoplasmatico. Inoltre, la Figura 4 mostra la presenza di CD81 in esosomi, che è un tetraspanin comunemente arricchito in esosomi. RNA cellulare sono presenti soprattuttos RNA ribosomiale (rRNA), visto come i due picchi importanti per la subunità 18S e 28S rRNA in un'analisi Bioanalyzer (Figura 5A). Tuttavia, l'RNA exosomal differiscono nella loro profilo come esosomi mancano i due picchi rRNA (18S e 28S) e sono arricchiti in RNA breve come mRNA e miRNA (Figura 5B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. A causa delle piccole dimensioni del esosomi (30-100 nm), non si può distinguere dal rumore di fondo e, quando analizzati con citometria a flusso. Pertanto, è necessario allegare a sfere legate agli anticorpi prima della esosomi vengono analizzati, che poi possono essere visualizzate dal laser. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Il exosome-perle complesso può aggregare con perline doppie e triple a vicenda e formano (A). La freccia sta dimostrando l'unico tallone-exo alcuni popolazione che è recintato e utilizzato per ulteriori analisi. Questa popolazione sarà direttamente a fronte di un controllo isotipico (grigio pieno di picco) per determinare la presenza di molecole di membrana delle esosomi. Esosomi CD63 positivo (nero punta aperta) sono mostrate nella figura B. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Microscopio elettronico di esosomi con la tipica morfologia e le dimensioni (40-80 nm) (A e B). La freccia in figura A indica la particella d'oro della anticorpo secondario, controllare che questo exosome hanno CD63 sulla superficie della membrana. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Risultati Western blot che mostra l'assenza della proteina reticolo endoplasmatico calnexin ma la presenza della proteina comunemente arricchito in esosomi, tetraspanin CD81. ve_content "&gt; <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Bioanalyzer risultati mostrano la presenza di RNA nelle cellule (A) e esosomi (B). Le frecce indicano la subunità 18S e 28S rRNA presenti nelle cellule. Come exosomal RNA virile contenere piccoli RNA rRNA poca o nessuna è identificata in esosomi.

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JL è un co-proprietario di un brevetto relativo all&#39;utilizzo di esosomi come vettori per il trasferimento di RNA nelle cellule.

Quando si studia il contenuto molecolare e / o funzione di esosomi, è fondamentale utilizzare un metodo di isolamento di alta qualità che fornisce un rendimento adeguato e il grado più basso possibile di contaminazione. La metodologia descritta nel presente documento è un approccio ben definito esosomi per isolare e studiare il loro contenuto di RNA e la funzione biologica. Inoltre, l&#39;importanza della caratterizzazione del esosomi isolato, da una combinazione di diversi metodi, tra cui la microscopia elettronica, citofluorimetria, e Western Blot, viene evidenziato. Quando si isola esosomi, la prima fase di centrifugazione (300 xg) è usato per le celle a pellet che potrebbero essere presenti nella sospensione cellulare o il fluido biologico studiato. La centrifugazione secondo a 16 500 xg deve essere sufficientemente forte per pellet di cellule morte, più grandi detriti, corpi apoptotici e altri organuli. Dopo questo centrifugazione, alcuni protocolli includono una nano-filtrazione passo, ma alcuni investigators hanno escluso questo passaggio. Tuttavia, sottolineiamo l&#39;importanza di frammenti di sradicare e vescicole più grandi di 200 nm e, pertanto consigliamo vivamente tra cui una fase di filtrazione. Se un isolamento più severi è necessario, a 100 nm, i filtri possono essere usati, ma è da notare che se i liquidi viscosi sono utilizzati, questi filtri possono facilmente ostruirsi e materiale exosomal è perduto. Inoltre, a 100 nm di filtrazione possono influenzare la morfologia del esosomi e inoltre se esosomi sono in larga scala potrebbero essere persi. Così, la 200 filtri nm sembra opportuno per l&#39;isolamento exosome. Dopo la filtrazione, l&#39;ultracentrifugazione obbligatoria a 120.000 xg viene utilizzato per far sedimentare il esosomi. Il esosomi può essere ulteriormente lavate con PBS, legati a microsfere legate agli anticorpi e lavata, o posta su un gradiente di saccarosio per rimuovere le proteine ​​contaminazione. Tuttavia, questo può essere un processo risorsa molto lunghi che sostengono di non essere necessaria, soprattutto se il volume del campione di partenza è di piccole dimensioni e / o il contenuto di RNA of il esosomi è bassa, come misure supplementari in modo sostanziale diminuire la ulteriore materiale. Tuttavia, ancora una volta, la natura delle vescicole isolate dovrebbero essere provata dalla presenza e assenza di alcune proteine. Fino ad oggi, nessun marcatore proteico assolutamente unica per esosomi è stato identificato per verificare che il campione contiene esosomi e nient&#39;altro. Di conseguenza, una combinazione di metodi sono necessari per caratterizzare la esosomi, compresa la determinazione della dimensione e morfologia del esosomi al microscopio elettronico. Inoltre, la purezza del campione può essere determinata mediante microscopia elettronica, in quanto questo metodo in grado di fornire una panoramica del livello di contaminazione del campione, per esempio con vescicole più grandi, come microparticelle, corpi apoptotici o detriti cellulari. Inoltre, il contenuto proteico del esosomi può essere determinata mediante citometria di flusso e Western Blot, e la combinazione di questi due metodi si ottiene un&#39;analisi sia della membrana legati (es. CD63 eCD81) e interiorizzato le proteine ​​(ad esempio Tsg101 e Alix) del esosomi. Rilevamento di proteine ​​arricchiti in esosomi, come CD63, Tsg101 e Alix, e l&#39;assenza di proteine ​​come la proteina calnexin reticolo endoplasmatico, è un&#39;indicazione che il exosome arricchito pellet è davvero esosomi e vescicole non contaminare da altri compartimenti della cellula. Il profilo del RNA che viene rilevato in esosomi è fondamentalmente diversa da quella del RNA presenti nelle cellule intatte. Così, l&#39;RNA exosomal analizzato da Bioanalyzer o in gel a base di approcci di analisi di RNA non hanno le due cime per la subunità 18S e 28S rRNA, che sono importanti nell&#39;analisi di RNA cellulare. Abbiamo quindi sostenere che l&#39;accertamento di eventuali quantità significative di rRNA in un campione indica che l&#39;RNA totale estratto non è di origine exosomal da solo, e quindi che il metodo di isolamento deve essere migliorata e di qualità assicurata.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Isolamento Exosome </td></tr><tr><td> Optima L-90K Ultracentrifuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> 65670 </td><td></td></tr><tr><td> Quick-sigillo ultracentrifuga tubi </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td> A seconda del rotore utilizzati tubi diversi sono necessari. Ti70 (342.414), Ti45 (345776) </td></tr><tr><td> Quick-Seal tubo cordless Topper kit </td><td> Beckman Coulter </td><td> 358312 </td><td></td></tr><tr><td> Filtropur Filtro siringa, 0.20μm </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1826.001 </td><td> Per fluidi viscosi e / o grandi volumi, un sistema di filtrazione a vuoto, 0,2 micron, da VWR International può essere utilizzato al posto (514-0600). </td></tr><tr><td> Microscopia elettronica a </td></tr><tr><td> Formvar / griglie di carbonio rivestiti in nichel </td><td> Ted Pella Inc </td><td> 1GN200 </td><td></td></tr><tr><td> Mouse-anti-CD63 umano </td><td> BD Bioscience </td><td> 556019 </td><td> Finale conc: 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> Isotipo di controllo; IgG1κ (MOPC 21) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9269 </td><td> Finale conc: 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> IgG anti-topo coniugato oro, a 10 nm </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7777 </td><td> Conc finale: 1% </td></tr><tr><td> LEO 912AB Omega microscopio elettronico </td><td> Carl Zeiss NTS </td><td></td><td> O apparecchiature equivalenti. </td></tr><tr><td> Citometria a flusso </td></tr><tr><td> 4 _m aldehyd / solfato di lattice perline </td><td> Dinamica interfacciale </td><td> 12-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpi per il rivestimento delle sfere di lattice </td><td></td><td></td><td> Per esempio anti-CD63 da Bioscience BD (556019) </td></tr><tr><td> Intelli-Mixer RM-2L </td><td> ELMI </td><td></td><td> O apparecchiature equivalenti. </td></tr><tr><td> IgG da siero umano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I4506 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpi per il rilevamento </td><td> BD Bioscience </td><td></td><td> Per esempio: PE anti-CD63 (556.020) PE anti-CD9 (555.372) Isotipo PE anti-CD81 (555.676) di controllo (555.749) </td></tr><tr><td> BD FACSAria </td><td> BD Bioscience </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Western Blot </td></tr><tr><td> Transsonic T 490 DH </td><td> ELMA </td><td></td><td> O apparecchiature equivalenti. </td></tr><tr><td> Isolamento di exosomal RNA e l&#39;RNA analisi </td></tr><tr><td> miRCURY RNA Isolation Kit </td><td> Exiqon A / S </td><td> 300110 </td><td></td></tr><tr><td> Agilent 2100 Bioanalyzer </td><td> Agilent Technologies </td><td> G2939A </td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e caratterizzazione di rna contenenti esosomi

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

Il campo di ricerca exosome è in rapida espansione, con un drammatico aumento in pubblicazioni negli ultimi anni. Queste piccole vescicole (30-100 nm) di origine endocitico sono stati proposti per funzionare come un modo per reticolociti per sradicare il recettore della transferrina, mentre maturando negli eritrociti 1, e sono stati in seguito chiamato esosomi. Esosomi si formano per gemmazione interna del tardo endosomi, producendo corpi multivescicolari (MVBs), e vengono rilasciati nell&#39;ambiente da parte del MVBs fusione con la membrana plasmatica 2. Dal momento che la prima scoperta di esosomi, una vasta gamma di cellule hanno dimostrato di rilasciare queste vescicole. Esosomi sono state rilevate anche in diversi liquidi biologici, tra cui plasma, liquido di lavaggio nasale, nella saliva e nel latte materno 3-6. Inoltre, è stato dimostrato che il contenuto e la funzione di esosomi dipende dalla cellula di origine e le condizioni in cui sono prodotti. Una varietà di funzioni sono state demoniconcentrati per esosomi, come l&#39;induzione di tolleranza nei confronti degli allergeni 7,8, l&#39;eradicazione di tumori nei topi stabilita 9, l&#39;inibizione e l&#39;attivazione delle cellule natural killer 10-12, la promozione della differenziazione in cellule T regolatorie 13, la stimolazione della proliferazione delle cellule T 14 e induzione di apoptosi delle cellule T 15. Anno 2007 abbiamo dimostrato che esosomi rilasciati dai mastociti contengono RNA messaggero (mRNA) e microRNA (miRNA), e che l&#39;RNA possono essere trasportati da una cellula all&#39;altra attraverso esosomi. Nelle cellule del destinatario, l&#39;mRNA spola da esosomi ha dimostrato di essere tradotta in proteine, il che suggerisce una funzione di regolamentazione del trasferimento RNA 16. Inoltre, abbiamo anche dimostrato che esosomi derivate da cellule cresciute in condizioni di stress ossidativo può indurre tolleranza contro lo stress ulteriore cellule riceventi e, quindi, suggerire una funzione biologica della navetta exosomal RNA 17. Terreni di coltura delle cellule e fluidi biologici contain una miscela di vescicole e sparso frammenti. Un metodo di isolamento di alta qualità per esosomi, seguita dalla caratterizzazione e identificazione dei esosomi e il loro contenuto, è dunque cruciale distinguere esosomi da vescicole e altre particelle. Qui vi presentiamo un metodo per l&#39;isolamento di esosomi da entrambi terreno di coltura cellulare e fluidi corporei. Questo metodo di isolamento si basa sulla centrifugazione e ripetuti passaggi di filtrazione, seguito da un passo ultracentrifugazione finale in cui il esosomi sono pellet. Importanti metodi per identificare il esosomi e caratterizzano la morfologia exosomal e del contenuto proteico sono evidenziati, tra cui la microscopia elettronica, citometria a flusso e Western Blot. La purificazione del RNA totale exosomal si basa sulla cromatografia su colonna e la resa exosomal RNA e distribuzione delle dimensioni viene analizzato con un Bioanalyzer.

In questo documento vengono utilizzati dei metodi per la purificazione isolamento, e la rilevazione di esosomi, nonché le tecniche per l&#39;analisi del loro contenuto molecolare. Questi metodi sono adattabili per l&#39;isolamento exosome da supporti sia la cultura di cellule e fluidi biologici, e può al di là di analisi del contenuto molecolare essere utile anche per studi funzionali.

Isolamento e caratterizzazione di RNA contenenti esosomi

Il campo della ricerca sugli esosomi è in rapida espansione, con un drastico aumento delle pubblicazioni negli ultimi anni. Queste piccole vescicole (30-100 nm) di ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare se le cellule e il fluido biologico di interesse rilascino o contengano RNA contenuto in esosomi. Il primo passaggio per isolare gli esosomi consiste nel rimuovere le cellule e i detriti cellulari. Successivamente, il sopranatante viene filtrato per eliminare le particelle più grandi.In seguito, gli esosomi vengono pelletizzati mediante ultracentrifugazione come secondo passaggio. Gli esosomi vengono caratterizzati mediante microscopia elettronica, citometria a flusso e analisi del western blot per dimostrare che le vescicole isolate presentano la morfologia, le dimensioni e la composizione proteica tipiche degli esosomi. Successivamente, l'RNA viene isolato dagli esosomi purificati.Al fine di determinare quale RNA contengono gli esosomi, i risultati ottenuti mediante questi metodi ben consolidati per la purificazione, il rilevamento e la caratterizzazione degli esosomi possono facilitare ulteriori studi sugli esosomi, come ad esempio le loro funzioni biologiche. Pertanto, questa presentazione illustrerà come gli esosomi possono essere isolati attraverso diversi metodi, e le due persone che presenteranno tali metodi sono le mie due studentesse di dottorato, Maria, El e Cecelia. Ecco. Buona fortuna.La linea cellulare umana di mastociti, HC one, viene utilizzata per questa dimostrazione di isolamento di esosomi per iniziare la procedura di isolamento degli esosomi. Prima, coltivare le cellule in mezzo con siero privo di esosomi. Successivamente, trasferire la sospensione cellulare in provette coniche e centrifugare a 300 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Per formare il pellet delle cellule, trasferire il sopranatante in provette per ultracentrifuga e centrifugare il campione a 16.500 ×g per 20 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere ulteriormente le cellule e i detriti cellulari. Successivamente, filtrare il SANE attraverso un filtro da 0,2 micron per eliminare ulteriormente le particelle di dimensioni superiori a 200 nanometri. Infine, sigillare le provette per ultracentrifuga contenenti il SANE filtrato ed eseguire l'ultracentrifugazione a 120.000 ×g per 70 minuti a quattro gradi Celsius al fine di ottenere il pellet degli esosomi.Gli esosomi vengono recuperati tagliando il tubo dell'ultracentrifuga, scartando il soprannatante e risospendendo il pellet arricchito in esosomi. Per un recupero massimale degli esosomi, risospendere ripetutamente il pellet arricchito in esosomi in un piccolo volume di un tampone appropriato in un tubo eppendorf.Sciacquare due volte con un ulteriore volume di tampone pari a quello precedente. Il tampone dipende dal tipo di esperimento successivo all'isolamento degli esosomi. Per la microscopia elettronica, utilizzare circa 10 microgrammi di proteina esosomiale proveniente da esosomi integri.Risospeso in PBS. La nostra microscopia elettronica con griglie al nichel rivestite di carbonio può essere eseguita senza immunomarcatura, poiché gli esosomi possono essere identificati esclusivamente in base alla morfologia e alle dimensioni. Tuttavia, si raccomanda l'uso di un anticorpo primario, come anti-CD63 o anti-MHC classe II, seguito da anticorpi secondari marcati con oro da 10 nanometri.Poiché gli esosomi sono troppo piccoli per essere rilevati dagli attuali strumenti di citometria a flusso, è necessario innanzitutto legare gli esosomi a microsferette rivestite con anticorpi. A seconda dell'origine cellulare degli esosomi, diversi anticorpi vengono accoppiati a microsferette magnetiche o in lattice. In questa dimostrazione, verranno utilizzate microsferette in lattice rivestite con anticorpo anti-CD63 per ogni campione.Utilizzare un volume pari a 30-40 microgrammi di proteina esosomale dell'esosoma integro. Sospendere gli esosomi in PBS e incubarli con le perle durante la notte a quattro gradi Celsius sotto leggera agitazione. Il giorno successivo, bloccare aggiungendo 300 microlitri di glicina 200 millimolare e incubare per 30 minuti.Lavare il complesso di microsferette con esosomi due volte e incubare i complessi di microsferette con esosomi con 50 microlitri di anticorpo IgG a quattro gradi Celsius. Lavare i complessi di microsferette con esosomi due volte, aggiungere 90 microlitri di buffer di lavaggio e 10 microlitri di anticorpo a scelta ai complessi di microsferette con esosomi e incubare per 40 minuti al buio. Lavare i complessi di microsferette con esosomi due volte sotto movimento delicato, aggiungere 300 microlitri di buffer di lavaggio e trasferire i campioni in provette per citometria a flusso ed acquisire i dati mediante citometria a flusso.Questa dimostrazione di Western blot si concentrerà sull'importanza di un'adeguata isolazione delle proteine prima del Western blot e sui diversi anticorpi utilizzati. Sciogliere il pellet di esosomi nel tampone di lisi proteico scelto e pipettare accuratamente, seguito da mescolamento con vortex per lisare ulteriormente gli esosomi, sottoporre il campione a sonica in bagno d'acqua, centrifugare il campione a 13.000 ×g per cinque minuti e trasferire il SANE in una nuova provetta eppendorf. Misurare la quantità totale di proteina con un metodo a scelta e caricare la proteina sul gel.Quindi separare e trasferire le proteine mediante elettroforesi su gel e trasferimento elettroforetico, quindi bloccare e lavare la membrana prima di eseguire l'immunostaining contro le proteine arricchite negli esosomi, poiché non esistono marcatori specifici per gli esosomi. Le proteine arricchite negli esosomi provenienti da diverse origini cellulari vengono comunemente utilizzate per il rilevamento degli esosomi. Queste includono proteine come le tetraspanine, ad esempio CD9, CD63 e CD81.Proteine associate al citoscheletro come ezrina e proteine coinvolte nella biogenesi di multivescicolari come TSG 1 0 1 e LY come controllo negativo per verificare la presenza di proteine contaminanti comunemente riscontrate nelle vescicole di altri compartimenti, come kexina e GRP 78 dal reticolo endoplasmatico. A seconda degli esperimenti previsti, possono essere utilizzati diversi kit per l'isolamento dell'RNA. In questa dimostrazione, verrà impiegato un metodo basato su colonne durante l'isolamento dell'RNA.È importante utilizzare punte di pipetta libere da acidi nucleici e nucleasi e pulire sia il banco di lavoro che l'equipaggiamento da contaminanti e RNA. Sciogliere il pellet di esosomi in 350 microlitri di soluzione di lisi e vortexare il campione. Aggiungere 200 microlitri di etanolo al 95% e mescolare utilizzando un vortex.Posizionare una colonna in una provetta di raccolta e trasferire gli esosomi lisati sulla colonna, quindi centrifugare. Lavare tre volte con 400 microlitri di soluzione di lavaggio per assicurarsi che la colonna sia completamente asciutta. Centrifugare per due minuti a 14.000 × g dopo l'ultimo lavaggio e posizionare la colonna asciutta in una provetta eppendorf priva di RNAsi. Eluire l'RNA in 50 microlitri di tampone eluente per la successiva rilevazione e analisi dell'RNA totale estratto dagli esosomi.Un bioanalizzatore Agilent 2100 può essere utilizzato con il kit RNA 6,000 nano o RNA 6,000 pico poiché gli esosomi sono troppo piccoli per essere rilevati mediante i metodi disponibili di citometria a flusso. Vengono legati a microsferette rivestite con anticorpi prima dell'analisi. Poiché questi complessi di esosomi e microsferette possono aggregarsi, un diagramma di dispersione di citometria a flusso può contenere diverse popolazioni di complessi di microsferette con un singolo, doppio o triplo esosoma.Come mostrato qui, la freccia indica la popolazione di complessi singoli tra microsfera ed esosoma, ovvero la popolazione che viene ulteriormente analizzata. Un istogramma di citometria a flusso mostra una popolazione singola di microsfere con esosoma positiva per la proteina CD63. Più a destra si trova la curva aperta, maggiore è la positività del campione per CD63.A causa delle piccole dimensioni degli esosomi, questi possono essere visualizzati solo mediante microscopia elettronica. Le caratteristiche morfologiche tipiche degli esosomi comprendono vescicole di forma rotondeggiante con dimensioni comprese tra 30 e 100 nanometri. Viene mostrata una colorazione immunoistochimica per esosomi con anticorpo marcato con oro colloidale anti-CD63, indicata dalla freccia nel Western blot.I risultati mostrano l'assenza della proteina del reticolo endoplasmatico calnexina nel campione esosomale, ma rivelano la presenza della tetraspanina CD81, una proteina comunemente arricchita negli esosomi. L'RNA cellulare contiene principalmente RNA ribosomiale, visibile come due picchi corrispondenti alla subunità 18S dell'RNA ribosomiale a sinistra e alla subunità 28S a destra in questa analisi con il bioanalizzatore. Tuttavia, gli RNA esosomali differiscono nei loro profili poiché contengono poca o nessuna quantità di RNA ribosomiale ed sono arricchiti in RNA brevi, come l'RNA messaggero e l'RNA micro. Una volta padroneggiato.L'isolamento può essere eseguito in circa tre ore se effettuato correttamente. Durante l'utilizzo di questo metodo, è importante eseguire tutti i passaggi, inclusa la non compilazione, per evitare la contaminazione di ics più grandi. Dopo lo sviluppo di questa tecnica, è diventato molto più semplice caratterizzare gli esosomi, sia dal punto di vista biochimico che biologico.Inoltre, abbiamo acquisito molte più conoscenze sulla comunicazione mediata dagli esosomi tra cellula e cellula in diversi sistemi. Inoltre, la tecnica ha reso possibile lo sviluppo degli esosomi come biomarcatori per diverse malattie. Grazie mille per la vostra attenzione.

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La presenza di microRNA stabili (miRNA) in exosomes ha generato enorme interesse come un romanzo modalità di comunicazione intercellulare, per la loro potenziale utilità come biomarcatori e come via per l'intervento terapeutico. Qui mostriamo purificazione exosome dal sangue e cultura mediatica seguita da PCR quantitativa per identificare miRNA trasportati.

Purificazione e microRNA profiling di Exosomes derivati ​​dal sangue e cultura dei media

Vengono descritte le tecniche che descrivono una procedura a gradiente per separare gli esosomi dalle particelle del virus dell'immunodeficienza umana (HIV). Questa procedura è stata utilizzata per isolare gli esosomi dalle particelle di HIV nel plasma umano da individui infetti da HIV. Gli esosomi isolati sono stati analizzati per il contenuto di citochine/chemochine.

Isolamento di esosomi dal plasma di HIV-1 individui positivi

Il fluido biliare è una preziosa fonte di vescicole/esosomi extracellulari che contengono biomarcatori potenzialmente importanti. Questo protocollo rappresenta un metodo robusto per isolare gli esosomi dalla bile umana per ulteriori analisi, tra cui la profilazione dei miRNA.

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Una procedura di isolamento del RNA basati su Oligonucleotide Tandem recuperare mRNA-proteina eucariotica complessi

Qui, descriviamo due protocolli di isolamento delle vescicole extracellulari, centrifugazione di ultrafiltrazione e ultracentrifugazione con centrifugazione su gradiente densità, per isolare le vescicole extracellulari da campioni di liquido di lavaggio broncoalveolare murino. Le vescicole extracellulari derivate dal fluido di lavaggio broncoalveolare murino con entrambi i metodi sono quantificate e caratterizzate.

Isolamento delle vescicole extracellulari dal fluido di lavaggio broncoalveolare murino usando una tecnica di centrifugazione di ultrafiltrazione

Questo protocollo viene illustrato come purificare i microRNA extracellulari da terreni di coltura cellulare per piccoli RNA libreria costruzione e sequenziamento di nuova generazione. Vari punti di controllo di controllo di qualità sono descritti per permettere ai lettori di capire cosa aspettarsi quando si lavora con campioni di ingresso bassi come exRNAs.

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