Isolamento e caratterizzazione di RNA contenenti esosomi

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare se le cellule e il fluido biologico di interesse rilasciano o contengono esosomi contenenti RNA. Il primo passo per isolare gli esosomi è rimuovere le cellule e i detriti cellulari. Successivamente, il supernat viene filtrato per rimuovere le particelle più grandi.

Gli esosomi vengono quindi pellettati attraverso l'ultracentrifugazione come seconda fase. Gli esosomi sono caratterizzati mediante microscopia elettronica, citometria a flusso e analisi del sangue occidentale per dimostrare che le vescicole isolate hanno la morfologia, le dimensioni e la composizione proteica degli esosomi. Successivamente, l'RNA viene isolato dagli esosomi purificati.

Al fine di determinare quale RNA, gli esosomi contengono i risultati ottenuti con questi metodi consolidati per la purificazione, il rilevamento e la caratterizzazione degli esosomi possono facilitare ulteriori studi sugli esosomi, come le loro funzioni biologiche. Quindi questa presentazione vi mostrerà come gli esosomi possono essere isolati con mezzi diversi, e le due persone che lo presenteranno sono le mie due studentesse di dottorato, Maria, El e Cecelia. Ehm.Buona fortuna.

La linea cellulare di massa umana, HC one, viene utilizzata per questa dimostrazione di isolamento degli esosomi per iniziare la procedura di isolamento degli esosomi. Innanzitutto, fai crescere le cellule in terreno con siero libero da esosomi. Quindi trasferire la sospensione cellulare in provette coniche e centrifugare a 300 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Per pellettare le cellule, trasferire il nome del super in provette da ultra centrifuga e centrifugare il campione a 16, 500 volte G per 20 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere ulteriormente le cellule e i detriti cellulari. Quindi, filtrare il SANE attraverso un filtro da 0,2 micron per rimuovere ulteriormente le particelle più grandi di 200 nanometri. Infine, le provette per ultracentrifuga contenenti il sano filtrato vengono sigillate in un'ultracentrifuga a 120.000 volte G per 70 minuti a quattro gradi Celsius per pellettare gli esosomi.

Gli esosomi vengono recuperati aprendo la provetta dell'ultracentrifuga, scartando la trappola e sospendendo il pellet arricchito con esosomi. Per il recupero massimo degli esosomi. Resus sospendere ripetutamente il pellet arricchito con esosoma in un piccolo volume di un tampone appropriato in un tubo di orph eend.

Risciacquare due volte con un tampone aggiuntivo dello stesso volume del precedente. Il tampone dipende dal tipo di esperimenti che seguono l'esosoma. Isolamento. Per la microscopia elettronica utilizzare circa 10 microgrammi di proteina esosomiale dagli esosomi intatti.

Risospeso in PBS eseguito. La nostra microscopia elettronica con griglia di nichel rivestita di carbonio può essere eseguita senza immunocolorazione, poiché gli esosomi possono essere identificati esclusivamente in base alla morfologia delle dimensioni. Tuttavia, si raccomanda di utilizzare un anticorpo primario come anti CD 63 o anti MHC Classe due, seguito da anticorpi secondari marcati con oro a 10 nanometri.

Poiché gli esosomi sono troppo piccoli per essere rilevati dalle attuali apparecchiature di citometria a flusso, è necessario legare prima gli esosomi alle perle rivestite di anticorpi. A seconda dell'origine cellulare esosomiale, diversi anticorpi sono accoppiati a perle magnetiche o in lattice. In questa dimostrazione, per ogni campione verranno utilizzate le perle di lattice rivestite anti CD 63.

Utilizzare un volume pari a 30-40 microgrammi di proteina esosomiale dell'esosoma intatto. Sospesi in PBS, incubare gli esosomi in perle durante la notte a quattro gradi Celsius con un movimento delicato. Il giorno successivo bloccato aggiungendo 300 microlitri di glicina 200 millimolare e incubare per 30 minuti.

Lavare il complesso di perle di esosoma due volte e lavare il tampone, incubare i complessi di perle di esosomi con 50 microlitri di anticorpi IgG a quattro gradi Celsius. Lavare due volte i complessi di perle di esosomi, aggiungere 90 microlitri, lavare il tampone e 10 microlitri di anticorpi a scelta ai complessi di perle dell'esoma e incubare per 40 minuti al buio. Con un movimento delicato, lavare due volte i complessi di perline dell'esoma, aggiungere 300 microlitri di tampone di lavaggio e trasferire i campioni nelle provette per citometria a flusso e acquisire i dati utilizzando la citometria a flusso.

Questa dimostrazione di western blot si concentrerà sull'importanza di un isolamento proteico adeguato prima del Western blot e sui diversi anticorpi utilizzati. Sciogliere il pellet di esosoma nel soffio di lisi proteica di scelta e pipettare accuratamente, seguito da una miscelazione a vortice per ulteriormente gli esosomi, sonicare il campione in un bagno d'acqua, centrifugare il campione 13.000 volte G per cinque minuti e trasferire il SANE in una nuova provetta einor. Misurare le proteine totali con un metodo a scelta e caricare le proteine sul gel.

Quindi separare e trasferire le proteine mediante elettroforesi su gel ed elettroblotting, bloccare e lavare la membrana prima di eseguire l'immunocolorazione contro le proteine arricchite negli esosomi poiché non esistono marcatori specifici per gli esosomi. Le proteine arricchite negli esosomi di tutte le diverse origini cellulari sono comunemente utilizzate per la rilevazione degli esosomi. Si tratta di proteine come le tetraspanine, ad esempio CD nine, CD 63 e CD 81.

Le proteine associate al citoscheletro, come l'ezrina e le proteine coinvolte nella biogenesi multivescicolare, come TSG 1, 0, 1 e LY, come controllo negativo, controllano le proteine contaminanti che si trovano comunemente nelle vescicole di altri compartimenti, come la kesina e la GRP 78 del reticolo endoplasmatico. A seconda degli esperimenti pianificati, è possibile utilizzare diversi kit di isolamento dell'RNA. In questa dimostrazione, verrà utilizzato un metodo basato su colonne per eseguire l'isolamento dell'RNA.

È importante utilizzare puntali per pipette privi di acido nucleico e nucleasi e pulire sia il banco che l'apparecchiatura da contaminanti e RNA. Sciogliere il pellet di esosoma in 350 microlitri di soluzione di lisi e agitare il campione. Aggiungere 200 microlitri di etanolo al 95% e mescolare con un vortice.

Posizionare una colonna in una provetta di raccolta e trasferire gli esosomi lisati nella colonna e centrifugare Lavare tre volte in 400 microlitri di soluzione di lavaggio per assicurarsi che la colonna sia asciutta. Centrifugare per due minuti a 14.000 volte G dopo l'ultimo lavaggio e posizionare la colonna asciutta in una provetta di eluizione di RNA free eend rph. L'RNA in 50 microlitri di tampone eluciano per la rilevazione e l'analisi dell'eso somico totale estratto, RNA.

Un bioanalizzatore Agilent 2100 può essere utilizzato con il kit RNA 6, 000 nano o RNA 6, 000 pico poiché gli esosomi sono troppo piccoli per essere rilevati dai metodi di citometria a flusso disponibili. Vengono attaccati a perle rivestite di anticorpi prima di essere analizzati. Poiché questi complessi di perle di esosomi possono aggregare una citometria a flusso, il grafico a dispersione può contenere diverse popolazioni di complessi di perle di esosomi singoli, doppi e tripli.

Come mostrato qui, la freccia indica la popolazione di singoli complessi di perline di esosomi, che è la popolazione che viene ulteriormente analizzata. Un istogramma di citometria a flusso mostra una singola popolazione di perle di esosomi positiva per la proteina CD 63. Più a destra è la curva aperta, più positivo è il campione per il CD 63.

A causa delle piccole dimensioni degli esosomi, possono essere visualizzati solo con la microscopia elettronica. Le caratteristiche morfologiche tipiche degli esosomi includono vescicole di forma rotonda da 30 a 100 nanometri. Una colorazione immuno esosomica con anticorpo liberale all'oro per CD 63 è indicata dall'Arrow Western blot.

I risultati mostrano l'assenza della proteina del reticolo endoplasmatico calnexina nel campione esoomiale, ma mostrano la presenza del tetraspan in CD 81, che è una proteina comunemente arricchita negli esosomi. L'RNA cellulare contiene principalmente RNA ribosomiale, visto come i due picchi per la subunità dell'RNA ribosomiale 18 s vista a sinistra e la subunità 28 s vista a destra in questa analisi del bioanalizzatore. Gli RNA esosomiali, tuttavia, differiscono nei loro profili in quanto contengono poco o nessun RNA ribosomiale e sono arricchiti in breve, RNA come messaggero, RNA e micro RNA Una volta padroneggiati.

L'isolamento di può essere eseguito in circa tre ore se eseguito correttamente. Durante l'utilizzo di questo metodo, è importante eseguire tutti i passaggi, incluso il non deposito per evitare la contaminazione di circuiti integrati più grandi. Dopo lo sviluppo di questa tecnica, è diventato molto più facile caratterizzare gli esosomi, sia biochimicamente che biologicamente.

Inoltre, abbiamo imparato molto di più sulla comunicazione cellula-cellula mediata dall'esosoma in diversi sistemi. Inoltre, la tecnica ha permesso di sviluppare esosomi come biomarcatori per diverse malattie. Grazie mille per l'attenzione.