Isolamento e Profiling di MicroRNA contenenti Esosomi da bile umana

L'obiettivo generale di questo metodo è isolare gli esosomi dalla bile umana per analisi successive, inclusa la profilazione del microRNA. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle malattie epatiche, come il rilevamento di un marcatore biliare specifico per i colangiocarcinomi o altre malattie biliari. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è solida e ripetibile.

Per eseguire una colangiopancreatografia retrograda endoscopica, o ERCP, iniziare posizionando il paziente in posizione supina. Dopo l'intubazione e il passaggio di un duodenoscopio attraverso la bocca del paziente, inserirlo nella seconda porzione del duodeno e identificare la papilla maggiore. Cannulare selettivamente il coledoco inserendo un colangiostoma a triplice lume precaricato con un filo guida idrofilo da 0,35 pollici o da 0,9 millimetri.

Sotto guida fluoroscopica, avanzare il filo guida nel dotto epatico sinistro, quindi avanzare lo sfinterotomo di cinque centimetri nel dotto biliare per ottenere una posizione stabile. Dopo aver rimosso il filo guida, collegare una siringa da 10 millimetri al portello del filo guida attraverso il blocco inferiore e utilizzare una pressione negativa di 10 millilitri per aspirare la bile. Rimuovere la siringa contenente la bile e, dopo aver reinserito il filo guida, iniettare mezzo di contrasto attraverso il portello di iniezione per opacizzare l'albero biliare.

Quindi, trasferire la bile raccolta in un tubo da 15 millilitri posto sul ghiaccio; se si desidera conservarla per un uso successivo, centrifugare il campione a 500 ×g e 4 °C per 10 minuti prima di congelarlo a -80 °C. Per procedere immediatamente all'isolamento degli esosomi, trasferire 400 microlitri di bile in un tubo da microcentrifuga e centrifugare a 300 ×g e 4 °C per 10 minuti al fine di raccogliere le cellule e i detriti cellulari. Per ulteriore chiarificazione del sopranatante, trasferire la soluzione in nuovi tubi da microcentrifuga e centrifugare i campioni a 16.500 ×g e 4 °C per 20 minuti.

Quindi, all'interno di una cappa a sicurezza biologica, raccogliere il soprannatante in una siringa e filtrarlo attraverso un filtro in membrana di polietersolfone da 0,2 micrometri per rimuovere eventuali particelle residue di dimensioni superiori a 200 nanometri. Trasferire il soprannatante filtrato in provette per ultracentrifuga e utilizzare il PBS per portare il volume delle provette a almeno due terzi della capacità massima, al fine di prevenire il collasso delle stesse durante la centrifugazione. Pellettizzare gli esosomi mediante ultracentrifugazione a 120.000 ×g e a quattro gradi Celsius per 70 minuti.

Un piccolo pellet giallo conterrà gli esosomi. Scartare il soprannatante versandolo con attenzione e disinfettare i rifiuti aggiungendo candeggina fino a una concentrazione finale del 10% volume su volume. Lasciare quindi in posa per 20 minuti.

Per esperimenti successivi, elaborare i pellet in un piccolo volume di soluzione appropriata oppure risospendere in 50-100 microlitri di PBS e conservare a meno 80 gradi Celsius per utilizzi futuri. Dopo aver preparato le griglie con le vescicole extracellulari, o EV, colorate a contrasto secondo il protocollo descritto, acquisire le immagini con un microscopio elettronico utilizzando una tensione di accelerazione di 80 kilovolt, partendo da ingrandimenti di 20.000 X e aumentando fino a 100.000 X, al fine di determinare la dimensione delle particelle. Gli esosomi sono troppo piccoli per essere rilevati mediante microscopia convenzionale o citometria a flusso; tuttavia, questa figura mostra i risultati di un'analisi tipica di tracciamento di nanoparticelle, o NTA, di esosomi, che misura la concentrazione e la distribuzione dimensionale, con una media di 97 nanometri in questo campione di bile umana isolato.

La microscopia elettronica può essere utilizzata anche per confermare le dimensioni delle particelle isolate nella bile umana e questa immagine mostra un tipico risultato di microscopia elettronica a trasmissione. Questi immunoblotting sono stati sottoposti a sonda per proteine arricchite negli esosomi, come la tetraspanina CD63 e Tsg101. Questo grafico di amplificazione in tempo reale mostra una varietà di specie di microRNA estratte da esosomi della bile umana.

Poiché gli esosomi non presentano standard affidabili come l'RNA ribosomiale 18S o 28S o geni di controllo, l'aggiunta di un microRNA sintetico è fondamentale per la normalizzazione. La tecnica di isolamento degli esosomi può essere eseguita in tre ore se effettuata correttamente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come ottenere ed elaborare la bile da pazienti o animali per isolare e analizzare le vescicole extracellulari.

Quando si ripete questa procedura, è importante ricordare di centrifugare il campione a 500 G e a quattro gradi prima del congelamento a meno 80, qualora non fosse possibile procedere con l'ultracentrifugazione. Seguendo questa procedura, altri metodi come studi sui microRNA possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive, ad esempio sui profili di microRNA. Non dimenticare che lavorare con la bile può essere estremamente pericoloso poiché potrebbe contenere epatite, e pertanto precauzioni come l'uso di guanti e occhiali di sicurezza devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

Dopo il suo sviluppo, la tecnica ha aperto la strada alla ricerca nel campo del colangiocarcinoma, permettendo di esplorare le vescicole extracellulari come possibili biomarcatori nella bile di pazienti con problemi biliari, come l'occlusione del PSA.