Isolamento e Profiling di MicroRNA contenenti Esosomi da bile umana

L'obiettivo generale di questo metodo è isolare gli esosomi dalla bile umana per ulteriori analisi, tra cui la profilazione dei microRNA. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle malattie del fegato, come il rilevamento di un particolare marcatore biliare per colangiocarcinomi o altre malattie biliari. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è robusta e ripetibile.

Per eseguire la colangiopancreatografia retrograda endoscopica, o ERCP, iniziare mettendo il paziente in posizione supina. Dopo aver intubato e fatto passare un duodenoscopio attraverso la bocca del paziente, inserirlo nella seconda parte del duodeno e identificare la papilla maggiore. Incannulare selettivamente il dotto biliare comune inserendo uno sfinterterotoma a triplo lume precaricato con un filo guida idrofilo da 0,35 pollici o 0,9 millimetri.

Sotto guida fluoroscopica, far avanzare il filo guida fino al dotto epatico sinistro, quindi far avanzare lo sfinterterotoma di cinque centimetri nel dotto biliare per acquisire una posizione stabile. Dopo aver rimosso il filo guida, collegare una siringa da 10 millimetri alla porta del filo guida attraverso il blocco inferiore e utilizzare 10 millilitri di pressione negativa per aspirare la bile. Rimuovere la siringa contenente la bile e, dopo aver reinserito il filo guida, iniettare l'agente di contrasto attraverso la porta di iniezione per opacizzare l'albero biliare.

Quindi, trasferire la bile raccolta in una provetta da 15 millilitri con ghiaccio e, se conservata per un tempo successivo, centrifugare il campione a 500 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti prima di congelare a meno 80 gradi Celsius. Per procedere immediatamente con l'isolamento degli esosomi, trasferire 400 microlitri di bile in una provetta da microcentrifuga e centrifugare a 300 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti per raccogliere cellule e detriti cellulari. Per eliminare ulteriormente il surnatante, trasferire la soluzione in provette da microcentrifuga fresche e centrifugare i campioni a 16, 500 volte g e quattro gradi Celsius per 20 minuti.

Quindi, in una cabina di biosicurezza, raccogliere il surnatante in una siringa e filtrarlo attraverso un filtro a membrana in polietersulfone da 0,2 micrometri per rimuovere eventuali particelle rimanenti di dimensioni superiori a 200 nanometri. Trasferire il surnatante filtrato nelle provette dell'ultracentrifuga e utilizzare il PBS per portare le provette ad almeno due terzi del pieno per evitare che le provette collassino durante la centrifugazione. Pellettare gli esosomi attraverso l'ultracentrifugazione a 120.000 volte g e quattro gradi Celsius per 70 minuti.

Una piccola pallina gialla conterrà gli esosomi. Scartare il surnatante decantando accuratamente e disinfettare i rifiuti aggiungendo candeggina a una concentrazione finale del 10% in volume per volume. Quindi lasciare riposare per 20 minuti.

Per gli esperimenti a valle, elaborare i pellet in un piccolo volume di soluzione appropriata o risospenderli in 50-100 microlitri di PBS e conservarli a meno 80 gradi Celsius per un uso futuro. Dopo aver preparato griglie di vescicole extracellulari colorate con contrasto, o EV, secondo il protocollo di testo, acquisire immagini con un microscopio elettronico utilizzando una tensione di accelerazione di 80 kilovolt a partire da ingrandimenti di 20.000 X e aumentando a 100.000 X, quando si determina la dimensione delle particelle. Gli esosomi sono troppo piccoli per essere rilevati con la microscopia regolare o la citometria a flusso; tuttavia, questa figura mostra i risultati di una tipica analisi di tracciamento delle nanoparticelle, o NTA, di esosomi che misurano la concentrazione e la distribuzione dimensionale, che in media è stata di 97 nanometri in questo campione di bile umana isolata.

La microscopia elettronica può essere utilizzata anche per confermare la dimensione delle particelle isolate nella bile umana e questa cifra mostra un tipico risultato EM di trasmissione. Questi western blot sono stati sondati per proteine arricchite in esosomi come la tetraspanina CD63 e Tsg101. Questo grafico di amplificazione in tempo reale mostra una varietà di specie di microRNA estratte dagli esosomi della bile umana.

Poiché gli esosomi mancano di standard affidabili come l'RNA ribosomiale 18S o 28S o i geni di pulizia, lo spikeking di un microRNA sintetico è importante per la normalizzazione. La tecnica di isolamento degli esos può essere eseguita in tre ore se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere ed elaborare la bile da pazienti o animali per isolare e analizzare le vescicole extracellulari.

Durante la ritrattazione di questa procedura, è importante ricordarsi di centrifugare il campione a 500 G e quattro gradi prima di congelare a meno 80, se non è possibile procedere con l'ultracentrifugazione. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come gli studi sui microRNA per rispondere a ulteriori domande come i profili dei microRNA. Non dimenticare che lavorare con la bile può essere estremamente pericoloso poiché potrebbe contenere epatite e precauzioni come indossare guanti e occhiali di sicurezza dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.

Dopo il suo sviluppo, la tecnica ha aperto la strada alla ricerca nel campo della ricerca sul colangiocarcinoma per esplorare le vescicole extracellulari come potenziale biomarcatore nella bile di pazienti con problemi biliari come l'ostruzione del PSA.