Name: Preparazione di Qualità pirofosfati Inositolo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Scopri come produrre e purificare pirofosfati di inositolo di alta qualità, in particolare IP7, mediante reazioni enzimatiche ed elettroforesi su gel. Questo metodo facilita lo studio dei meccanismi di segnalazione cellulare.

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Ringraziamo A. Riccio per gli utili commenti e leggere il manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato dal Medical Research Council (MRC) i finanziamenti per l&#39;Unità di Biologia Cellulare e da un Umano Frontier Science Grant Program (RGP0048/2009-C).

1. La reazione enzimatica - giorno 1 (1 ora al pomeriggio) <ol><li> Il primo passo è quello di preparare 10-20 indipendente reazioni enzimatiche in cui IP 6 K1 o VIP1 convertire IP 6 al isoforme pyrophosphorylated. </li><li> Utilizziamo His-IP 6 K1 e GST-VIP1 enzimi purificato da E. coli secondo il protocollo precedentemente descritto 17,18. </li><li> Preparare 50 reazioni microlitri contenente 1X tampone di reazione (30 Hepes mM pH 6,8, 50 mM NaCl, 6 mM MgSO 4, 1 mM DTT), 6 mM fosfocreatina (PCr), 25 U / mL CreatinePhosphoKinase (CPK), 5 mM ATP (Mg sale), 0,3 mM IP6, 0,05-0,1 mg suo-IP 6 K1 o GST-VIP1. Regolare il volume con MiliQ DDH 2 O. </li><li> Brevemente girare la reazione e incubare a 37 ° C durante la notte con rotazione. </li></ol> 2. Poliacrilammide colata gel e di carico - giorno 2 (4 ore al pomeriggio) <ol><li> Il gel di poliacrilammide si prepara a 24 cm di lunghezza, lastre di vetro 18 centimetri di larghezza e 1,5 mm di larghezza distanziatori. Di solito un 16 lane o un singolo pettine corsia preparativo viene utilizzato. </li><li> Preparare una miscela (50 ml / gel) contenente le seguenti: 35,5% (w / v) di acrilammide: Bis-acrilamide 19:1, 1X Tris / Borato / EDTA (TBE), 0,05% (w / v) di ammonio persolfato (APS ), 0,05% (w / v) TEMED. Versate il mix tra il pre-lastre di vetro fuso, inserire il pettine e lasciare polimerizzare per 30-60 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Una volta che il gel è polimerizzato, trasferire l'apparecchiatura alla stanza fredda e pre-run in TBE 1X per circa 30-60 minuti a 200-300 Volt. </li><li> Aggiungi 1X di OrangeG colorante (10 mM Tris-HCl pH7.0, 1 mM EDTA, 30% glicerolo, 0,1 OrangeG%) per ogni reazione. Preparare un campione contenente 2 nmol di IP da 6 a caricare come un controllo standard. </li><li> Lavare ogni pozzetto a fondo con l'esecuzione buffer utilizzando una siringa e un ago 21G per rimuovere l'eventuale precipitato, quindi caricare il gel. Evitare di caricare nei pozzetti laterali. </li><li> Esegui il gel notte a 450-550 Volt (7 mAmp / gel), fino a quando la band colorante OrangeG è da meno di 10 cm dal fondo del gel. </li></ol> 3. Isolamento di IP 7 - giorno 3 (4 ore) e il 4 ° giorno (6-7 ore SpeedVac processo di essiccazione) <ol><li> Smontare l'apparato gel e con attenzione rimuovere una lastra di vetro lasciando il gel su l'altro. Tagliare una piccola porzione del gel da appena sopra la banda colorante OrangeG al fondo contenente l'IP 6 standard e una corsia campione, come mostrato nella Figura 1. </li><li> Macchiare la parte tagliata del gel con blu di toluidina (0,1% (w / v) di blu di toluidina, 20% (w / v) metanolo, 2% (w / v) glicerolo) per alcuni minuti (1-3 min) o fino a quando la band pirofosfato inositolo appare. Mettere la lastra di vetro precedentemente rimosso torna in cima al gel per evitare che il gel senza macchia si secchi. </li></ol> L'IP a 7 bande dovrebbero essere visibili in quanto corre leggermente più lento del IP 6 standard. ATP, che corre più veloce di IP 6, dovrebbero essere visibili (Figura 1). Trasferire la parte macchiata del gel in un de-soluzione colorante (20% (w / v) metanolo) per alcuni minuti, lavare via ogni eccesso di blu di toluidina e riposizionare il gel con il gel senza macchia. Se la visualizzazione di più isoforme pyrophosphorylated inositolo IP (IP 8 e 9) è richiesto, macchia il gel con una soluzione di toluidina colorazione blu per 20 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, lavare via il blu toluidina con la de-soluzione colorante per circa 15 minuti. <ol start="3"><li> Con una lametta tagliare la banda IP 7 sulla porzione senza macchia del gel utilizzando come riferimento la posizione di migrazione IP 7 determinato con il gel colorato (Figura 1). </li><li> Mettere la IP 7 band che è stata tagliata dal gel su un tubo da 15 ml e aggiungere 10 ml di MilliQ DDH 2 O. Mettere tubi in rotazione per 10 minuti a temperatura ambiente. Eliminare il liquido per rimuovere l'eccesso di particelle di acrilammide TBE e microscopiche. </li><li> Successivamente, eseguire due cicli di idratazione-disidratazione. Aggiungere 5 ml di 50% (w / v) metanolo al tubo con il gel contenente 7 IP e ruotare a temperatura ambiente per 2 ore. Trasferire la fetta gel a un nuovo tubo di 15 ml contenente 5 ml di MilliQ DDH 2 O e ruotare a temperatura ambiente per 2 ore. Non eliminare il metanolo e MilliQ H 2 O dai tubi. Ripetere la disidratazione-idratazione ciclo ancora una volta da ri-trasferimento del gel di poliacrilammide in provette da 15 ml precedentemente utilizzato. Uno dei lavaggi può essere eseguita durante la notte. </li><li> Per concentrare l'IP eluiti 7, asciugare il 10 mL insieme (5 ml MilliQddH 2 O e 5 ml al 50% (w / v) metanolo) utilizzando un SpeedVac riscaldata a 60 ° C. </li><li> Una volta che i campioni sono quasi a secco, trasferire il liquido residuo (300-600 mL) a A1.5 tubo ml centrifuga e gira per 2 minuti a 5000 rpm. </li><li> Raccogliere il supernatante e trasferirlo in un nuovo tubo di 1,5 ml per centrifuga; lasciareil fondo 20-30 microlitri dal momento che può contenere particelle di acrilammide. </li><li> Se necessario continuare il processo di essiccazione mediante un SpeedVac riscaldata. Il recupero di IP 7 è drasticamente ridotto, se i campioni asciugare completamente, quindi terminare il processo di essiccazione, quando i campioni di raggiungere il volume di 100-300 microlitri. </li></ol> 4. Determinazione della IP 7 concentrazione e purezza. <ol><li> Utilizzare 2-5 microlitri della recuperato IP 7 campioni per l'esecuzione su un gel PAGE, in modo simile a Sezioni 2,2-2,5. Carico di diluizioni diverse di IP 6 (ovvero 0,5, 1, 2, 4 nmol) come standard la concentrazione e 4 nmol di Poly-P marcatore. Dopo aver eseguito il gel, visualizzare le isoforme pirofosfato inositolo dalla colorazione e de-colorazione il gel intero con una soluzione blu di toluidina, seguendo la procedura descritta al punto 3.2 (Figura 2A). </li><li> Dopo la colorazione toluidina, la concentrazione può essere determinata attraverso la scansione il gel e confrontando le differenze di intensità tra i 6 IP e IP 7, utilizzando software di imaging come immagine-J, come mostrato nella figura 2B. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: La conversione preparativa enzimatica di IP da 6 a 7 utilizzando IP IP enzimi 6 K1 e VIP1 può essere facilmente risolto utilizzando l'analisi PAGE (Figura 1). Il carico di 6 IP come controllare le dimensioni con colorazione blu toluidina gel permette l'identificazione dei derivati ​​pyrophosphorylated, dal momento che corrono più lentamente a seconda del numero di gruppi fosfato presenti sull'anello inositolo. La procedura descritta sopra permette la purificazione facile IP 7. L'analisi del pirofosfato purificata da PAGE inositolo ha rivelato la purezza del nostro IP 7 (Figura 2A). È interessante notare che i 5 isomero 1/3PP-IP di IP 7 prodotti di VIP1 migra leggermente più lento del 5PP-IP 5 isomero di IP 7 che viene generato dal IP 6 K1. L'uso di IP 6 standard consentire una facile quantificazione della concentrazione della IP purificato 7 (Figura 2B). Prima di utilizzare 7 IP per ulteriori esperimenti, la sua attività biologica può essere valutata (Figura 3). 5PP-IP 5 è incubato con VIP1 e con l'IP 7 fosfatasi DDP1 (phosphohydrolase polifosfato diphosphoinositol). Di routine, l'IP purificata 7 è convertito in IP 8 da VIP1 e IP 6 da DDP1 (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1:. Colorazione di toluidina PAGE e isolamento della banda IP 7 La porzione del gel contenente lo standard IP (6) è stato tagliato e colorati con una soluzione di blu di toluidina. Le tre bande rappresentano (dall'alto in basso) 7 IP, IP 6 e ATP. La parte macchiata del gel è stato quindi allineato con il restante del gel. Questo permette la localizzazione della porzione del gel contenente 7 IP, che possono poi essere tagliato e purificato (casella tratteggiata). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: analisi PAGE di IP prodotti di reazione 6 K1 e VIP1. A) Analisi di IP 6 (4, 2, 1, 0,5 nmol) dalla colorazione blu di toluidina è stato utilizzato per determinare la concentrazione IP 7 purificato da entrambe le 6 di IP K1 (5PP-IP 5) e VIP1 (1/3PP-IP 5) reazioni. B) appezzamento di analisi a dispersione per determinare la concentrazione di IP purificato 7. Le concentrazioni sono state determinate in funzione dell'intensità delle bande, calcolato utilizzando il software ImageJ, rispetto ai livelli pre-determinata quantità di IP 6. L'asse X rappresenta l'intensità, l'asse Y rappresenta concentrazioni espresse in nmol. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3:. Analisi di IP 7 attività biologica Per determinare la qualità della PI purificata 7 abbiamo incubato 5PP-IP 5 (IP 6 K1 generato IP 7) con VIP1 o con l'IP 7 fosfatasi DDP1 e poi risolto la reazione PAGINA. La colorazione DAPI e toluidina rivelato la produzione prevista di IP 8 da VIP1 e la conversione di IP da 7 a 6 per DDP1 IP.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;uso di inositolo pirofosfato in biochimica è severamente limitato dalla indisponibilità commerciale di tali composti e la scarsa sensibilità dei metodi di rilevazione già esistenti. La combinazione di pagina, che consente la separazione di molecole in possesso di diverso numero di gruppi fosfato e blu di toluidina (Figura 1), un colorante metacromatica che si lega ai gruppi fosfato, consente la facile individuazione delle isoforme pyrophoshate inositolo aprendo nuove vie di ricerca 20. L&#39;uso della tecnologia descritta PAGE per purificare i prodotti pirofosfato inositolo della reazione enzimatica svolta outby sia IP 6 K1 o VIP1 è un metodo semplice, economico e affidabile che consente la produzione di grandi quantità di IP di alta qualità 7. Il metodo sopra descritto non si limita alla purificazione semplice IP 7, ma piccole modifiche del protocollo descritto può permettere la purificazione di una diversa gamma di pirofosfati inositolo. Superiore fosforilata isoforme pirofosfato inositolo, contenente più di otto gruppi fosfato possono essere rilevati tramite IP 7 o diverse quantità di IP 6 come substrato 20,6. Queste pirofosfati inositolo possono essere rilevati aumentando la lunghezza della procedura di colorazione e successivamente purificato (sezione 3.2). Inoltre, l&#39;uso di IP 5 come substrato per la reazione enzimatica che permette la purificazione di PP-IP 5 e altre pirofosfati inositolo contenente un gruppo idrossile sull&#39;anello inositolo. In conclusione, questo metodo permette di poco impegnativo per la purificazione affidabile di quantità milligrammo di pirofosfati inositolo con strumenti ampiamente disponibili, aprendo così nuove strade per questo campo di ricerca entusiasmante.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> L&#39;acido fitico (IP 6) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8810 </td></tr><tr><td> Poly-P (esametafosfato di sodio) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8510 </td></tr><tr><td> ATP-Mg 2 + sale </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9187 </td></tr><tr><td> OrangeG </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3756 </td></tr><tr><td> Fosfocreatina (PCr) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7936 </td></tr><tr><td> CreatinePhospho chinasi (CPK) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3755 </td></tr><tr><td> GST-VIP1 </td><td> 17 </td><td> 17 </td></tr><tr><td> Il suo-IP6K1 </td><td> 18 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> Il suo-Ddp1 </td><td> Disponibile in laboratorio </td><td> Disponibile in laboratorio </td></tr><tr><td> Acrilamide: Bis-acrilamide 19:01 (40%) </td><td> Flowgen </td><td> H16972 </td></tr><tr><td> Di ammonio persolfato (APS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9164 </td></tr><tr><td> Tris / Borato / EDTA (TBE) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T 9060 </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> BDH </td><td> 43083G </td></tr><tr><td> Blu toluidina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 198161 </td></tr><tr><td> SpeedVac </td><td> Cristo </td><td> 100218 </td></tr><tr><td> Gel apparato </td><td> Hoefer </td><td> SE600 </td></tr><tr><td> Pressione di aspirazione </td><td> Cristo </td><td> Alfa 2-4 </td></tr><tr><td> Pompa del vuoto </td><td> ABM Greiffenberger </td><td> 4EKF63CX </td></tr></tbody></table>

preparazione di qualità pirofosfati inositolo

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Myo-inositolo è presente in natura sia senza modifiche o più derivati ​​complessi fosforilata. Delle più recenti, il più abbondante nelle cellule eucariotiche due sono pentakisphosphate inositolo (IP 5) e hexakisphosphate inositolo (acido fitico o IP 6). IP 5 e IP 6 sono i precursori di molecole pirofosfato inositolo che contengono uno o più legami pirofosfato 1. Fosforilazione di IP 6 genera diphoshoinositolpentakisphosphate (IP 7 o PP-IP 5) e bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP 8 o (PP) 2-IP 4). Pirofosfati inositolo sono stati isolati da tutti gli organismi eucarioti sinora studiati. Inoltre, le due classi distinte di enzimi responsabili della sintesi pirofosfato inositolo sono altamente conservati durante l&#39;evoluzione 2-4. L&#39;IP 6 chinasi (IP 6 Ks) possiede una flessibilità enorme catalizzatore, la conversione IP 5 e 6 al PP IP-IP IP 4 e 7 rispettivamente e successivamente, utilizzando questi prodotti come substrati, promuovere la generazione di molecole più complesse 5,6 . Recentemente, una seconda classe di enzimi pirofosfato generazione è stata individuata nella forma della proteina di lievito VIP 1 (noto anche come PP-IP 5 K), che è in grado di convertire IP da 6 a 7 e IP IP 8 7,8. Pirofosfati inositolo regolano molti processi cellulari disparati quali la secrezione di insulina 9, la lunghezza dei telomeri 10,11, chemiotassi 12, il traffico vescicolare 13, 14 e omeostasi fosfato di HIV-1 gag rilascio 15. Due meccanismi di azione sono stati proposti per questa classe di molecole. Essi possono influenzare le funzioni cellulari da allosterically interagendo con proteine ​​specifiche, come AKT 16. In alternativa, il gruppo pirofosfato può donare un fosfato di pre-fosforilata proteine ​​17. L&#39;enorme potenziale di questo campo di ricerca è ostacolata dalla mancanza di una fonte commerciale di pirofosfati inositolo, che impedisce molti scienziati di studiare queste molecole e questa nuova modificazioni post-traduzionali. I metodi attualmente disponibili per isolare pirofosfati inositolo richiedono sofisticate apparecchiature cromatografiche 18,19. Queste procedure utilizzano condizioni di acidità che potrebbe portare al degrado pirofosfato inositolo 20 e quindi al recupero poveri. Inoltre, l&#39;ingombrante post-colonna procedure di dissalazione limitarne l&#39;uso a laboratori specializzati. In questo studio descriviamo un metodo poco impegnativo per la generazione, l&#39;isolamento e la purificazione dei prodotti di IP 6-chinasi e PP-IP 5-chinasi reazioni. Questo metodo è stato possibile grazie alla capacità di elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAG) per risolvere i polifosfati inositolo altamente fosforilata 20. A seguito di IP 6 K1 e PP-IP 5 K reazioni enzimatiche utilizzando IP 6 come il substrato, PAGINA è stato utilizzato per separare i pirofosfati generato inositolo che sono stati successivamente eluiti in acqua.

Pirofosfati inositolo svolgono un ruolo importante nelle patologie umane come il cancro, il diabete e l&#39;obesità, ma l&#39;esatto meccanismo d&#39;azione è una questione di controversia. La mancanza di pirofosfati inositolo disponibili in commercio rende studi dettagliati problematico. Qui descriviamo un semplice protocollo per la produzione e isolare milligrammi di pirofosfati inositolo.

Preparazione di Qualità pirofosfati Inositolo

Il mio-inositolo è presente in natura sia in forma non modificata sia in derivati fosforilati più complessi. Di questi ultimi, i due più abbondanti nelle cellule eucariotiche...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare e purificare pirofosfato di inosite di buona qualità e senza impurità. Questo risultato si ottiene innanzitutto utilizzando l'IP6 come substrato per la chinasi IP6, un enzima che genera IP7. Successivamente, le reazioni enzimatiche vengono caricate su un gel di poliammide e la banda corrispondente all'IP7 viene escissa.L'IP sette viene quindi isolato mediante cicli successivi di disidratazione e idratazione. L'ultimo passaggio della procedura consiste nel confermare la purezza del prodotto e nel determinare la concentrazione. Infine, si possono ottenere risultati che mostrano l'attività biologica dell'IP sette attraverso l'incubazione con l'IP sette.Con VIP una chinasi e con IP sette la fosfatasi DDP uno, queste reazioni generano rispettivamente IP otto e IP sei. Questo approccio può fornire informazioni sul segnale di IP sette. Può inoltre essere applicato ad altri sistemi, come nel caso di fosfati come IP otto o il PPIP quattro derivato da IP cinque.Questo protocollo inizia con la preparazione di reazioni enzimatiche in cui la chinasi dell'IP sei uno o la VIP uno convertono l'IP sei in isoforme correlate a gruppi pirofosfato. Per questa dimostrazione, l'IP sei chinasi uno marcati con istidina e gli enzimi VIP uno marcati con GST sono stati purificati da e coli seguendo una procedura descritta in precedenza. Per cominciare, preparare da 10 a 20 reazioni enzimatiche indipendenti contenenti IP sei e IP sei chinasi uno con marcatore his oppure VIP uno con marcatore GST, come descritto nel protocollo scritto.Regolare il volume a 50 microlitri con acqua milli Q doppia distillata. Dopo aver centrifugato brevemente i tubi, incubare le reazioni a 37 gradi Celsius durante la notte con agitazione rotatoria. Preparare l'apparato per gel di poliacrilamide utilizzando piastre di vetro lunghe 24 centimetri e larghe 18 centimetri, distanziali larghi 1,5 millimetri e un pettine a 16 pozzetti.Successivamente, versare una soluzione di gel precedentemente preparata tra le lastre di vetro precostituite in un volume di 50 millilitri per gel. Inserire il pettine e lasciare polimerizzare il gel per 30-60 minuti a temperatura ambiente. Una volta che il gel è polimerizzato, trasferire l'apparato in camera fredda.Eseguire la pre-correzione del gel in TBE 1x per circa 30-60 minuti a 200-300 volt, contemporaneamente in colorante Orange G 1x. Per ogni reazione, preparare un campione controllo standard contenente due mol di IP sei. Dopo la pre-correzione, lavare accuratamente ogni pozzetto con il buffer di corsa.Utilizzare una siringa collegata a un ago da 21 gauge per rimuovere qualsiasi precipitato. Quindi caricare i campioni nel gel, evitando di caricare le prime due e le ultime due corsie del gel. Infine, far correre il gel tutta la notte a sette milliampere per gel fino a quando la banda del colorante arancione G si trova entro gli ultimi 10 centimetri in fondo al gel.Per iniziare l'isolamento dell'IP sette, smontare l'apparato elettroforetico e rimuovere con attenzione una delle lastre di vetro, lasciando il gel sull'altra. Tagliare una piccola porzione del gel dalla zona appena sopra la banda arancione del GD fino al fondo, includendo lo standard di IP sei e una corsia del campione. Colorare la porzione di gel tagliata con blu di toluidina per alcuni minuti, fino a quando appare la banda dell'Anatol Pyrophosphate.Nel frattempo, rimettere la lastra di vetro precedentemente rimossa sulla parte superiore del gel per evitare che il gel non colorato si secchi. Trasferire la porzione colorata del gel in una soluzione di colorazione DES per alcuni minuti, al fine di rimuovere l'eccesso di blu di toluidina, quindi riposizionare il gel insieme al gel non colorato. La banda IP sette dovrebbe essere visibile poiché migra leggermente più lentamente rispetto allo standard IP sei di ATP, mentre IP sei, che migra più velocemente, dovrebbe essere anch'esso visibile.Successivamente, utilizzare una lametta per tagliare la banda IP sette nella porzione non colorata del gel. Sfruttare la posizione di migrazione di IP sette determinata con il gel colorato. Per stimare la posizione della banda IP sette, inserire la banda di IP sette tagliata dal gel in un tubo da 15 millilitri e aggiungere 10 millilitri di acqua milli Q doppia distillata.Ruotare le provette per 10 minuti a temperatura ambiente dopo l'incubazione, quindi eliminare il liquido per decantazione per rimuovere l'eccesso di TBE e le particelle microscopiche di acrilamide. Successivamente, eseguire due cicli di disidratazione e idratazione aggiungendo prima cinque millilitri di metanolo al 50% alla provetta contenente il gel IP seven. Ruotare il campione a temperatura ambiente per due ore.Quindi trasferire il frammento di gel in un nuovo tubo da 15 millilitri contenente cinque millilitri di acqua distillata doppia milli Q e ruotare a temperatura ambiente per due ore. Conservare il tubo contenente metanolo per ulteriore utilizzo dopo l'incubazione. Ripetere il ciclo di disidratazione e idratazione un'altra volta per concentrare l'IP sette eluito.Combinare i cinque millilitri di acqua e i cinque millilitri di metanolo al 50% aggiunti in precedenza. Essiccare la soluzione combinata utilizzando un evaporatore sotto vuoto riscaldato a 60 gradi Celsius. Una volta che i campioni sono quasi secchi, trasferire il liquido rimanente in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri.Centrifugare il tubo per due minuti a 5.000 giri al minuto. Raccogliere il soprannatante, lasciando i 20-30 microlitri inferiori poiché potrebbero contenere particelle di acrilammide. Trasferire il campione in un nuovo tubo da centrifuga da 1,5 millilitro.Se necessario, proseguire il processo di essiccazione utilizzando un evaporatore a vuoto non riscaldato. Il recupero dell'IP sette è notevolmente ridotto se i campioni si asciugano completamente. Pertanto, è fondamentale interrompere il processo di essiccazione quando i campioni raggiungono un volume compreso tra 100 e 300 microlitri.Dopo aver recuperato l'IP sette isolato, caricare da due a cinque microlitri del campione su un gel PAGE per determinarne la concentrazione e la purezza. Caricare diverse diluizioni di IP sei come standard di concentrazione e quattro mol di marcatore polip. Dopo aver eseguito l'elettroforesi, visualizzare le isoforme iniziali di pirofosfato mediante colorazione e decolorazione dell'intero gel con soluzione di blu di toluidina.Seguendo la procedura appena descritta dopo la colorazione con toluidina, le concentrazioni possono essere determinate scansionando il gel e confrontando le differenze di intensità tra IP sei e IP sette. Utilizzando un software di analisi delle immagini come Image J, la conversione enzimatica preparativa di IP sei in IP sette, ottenuta mediante le enzimi IP sei chinasi uno e VIP uno, può essere facilmente risolta mediante analisi su gel.Il caricamento dell'IP6 come controllo di dimensione, insieme alla colorazione del gel con blu di toluidina, permette l'identificazione dei derivati pirofosforilati. Poiché questi migrano più lentamente, a seconda del numero di gruppi fosfato presenti sull'inositolo iniziale, la procedura descritta in precedenza ha permesso la facile purificazione dell'IP7. Inoltre, l'analisi del pirofosfato di anatolo purificato mediante elettroforesi su gel ha rivelato la purezza dell'IP7.È interessante notare che l'isomero dell'IP sette con un tripirefosfato in posizione uno, prodotto da VIP uno, migra leggermente più lentamente rispetto all'isomero dell'IP cinque con un pirefosfato in posizione cinque, generato dalla chinasi IP sei uno. L'uso di standard di IP sei permette una facile quantificazione della concentrazione di IP sette purificato prima dell'utilizzo di IP sette. Per ulteriori esperimenti, la sua attività biologica può essere valutata. Cinque.Il pirofosfato IP cinque viene incubato con FIP uno e con la fosfatasi IP sette DDP uno abitualmente. L'IP sette purificato viene convertito in IP otto da VIP uno e in IP sei da DDP uno. Seguendo questo procedimento, altri metodi come una colorazione prolungata con toluidina blu possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come l'isolamento di IP otto o di altre forme isoformi fosforilate.

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