Name: Titolo Incapsulamento cella di goccioline (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T13:09:54.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Scopri l'incapsulamento cellulare per la biostampa 3D utilizzando valvole solenoidi e gel specifici. Questo metodo consente di creare strutture cellulari complesse per applicazioni in ingegneria tissutale.

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NIH3T3 cellule preparazione: Le cellule A. espulsione <ol><li> Trypsinize cellule, poi diluire 1:1 con mezzi di comunicazione cellulare, e il trasferimento da un pallone T75 ad un tubo da 15 ml Falcon </li><li> Spin le cellule in una pallina da centrifugazione, aspirare il surnatante e lavare le cellule con DPBS </li><li> Spin le cellule in una pallina di nuovo e aspirare il surnatante </li><li> Risospendere le cellule in mezzi di comunicazione </li><li> Determinare la densità delle cellule con emocitometro (~ 200 x 10 4 cellule / ml per T75 fiasco) </li><li> Cellula soluzione centrifuga, aspirare il surnatante e risospendere in giusta quantità di supporti per la variazione delle concentrazioni di cellule </li></ol> B. cella di espulsione <ol><li> Cellule vortice prima di utilizzare per l&#39;espulsione </li><li> Trasferire 200 ul di soluzione di cella in siringa </li><li> Impostare la modalità appropriata sul generatore di impulsi <ol><li> Per espellere gocce singole e multiple gocce (treni), insieme al generatore di impulsi &quot;E. BUR&quot; modalità </li><li> Per l&#39;espulsione delle gocce continuo, generatore di impulsi impostato in modalità &quot;NORM&quot; </li></ol></li><li> Modificare le impostazioni del segnale <ol><li> Impostare il livello alto e basso livello di tensione di uscita: HIL a 5 V e LOL a 0 V e assicurarsi che il &quot;LIM&quot; LED è acceso </li><li> Impostare il segnale come un impulso quadrato </li><li> Modificare la quantità di tempo la valvola solenoide è aperta per l&#39;espulsione delle gocce, modificando il valore di &quot;WID&quot; o cambiando duty cycle (&quot;dovere&quot;) </li><li> Modificare la frequenza di espulsione, modificando il valore di &quot;PER&quot; </li><li> Modificare il numero di goccioline espulse in uno scoppio, modificando il valore di &quot;BUR&quot; </li></ol></li><li> Cellula soluzione di espulsione su substrato preparato per l&#39;imaging con microscopio </li></ol> C. colorazione <ol><li> Portare soluzione colorante con 0,5 microlitri calceina-AM e 2 omodimero microlitri di etidio per ml di DPBS </li><li> Immergere substrato preparato in soluzione colorante </li><li> Lasciare campione ad incubare per 10 minuti a 37 ° C prima di imaging </li></ol> Esperimento di convalida <ol><li> Su una Nikon Eclipse TE-2000 Microscopio U fluorescente <ol><li> Spot software avanzato (Diagnostics, Inc.) </li><li> Live / Dead Assay </li></ol></li></ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

<table><tbody><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td></td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse TE-2000 U</td><td></td></tr><tr><td>Eiettore di cellule a valvola solenoide</td><td></td><td></td><td></td><td>Frequenza di funzionamento: 1 kHz, 30 psi, 50 nl~0,5 µl. Alimentatore per valvola a 12 V: corrente di pilotaggio 2,5 A</td></tr><tr><td>Serbatoio d'aria portatile da 5 galloni</td><td></td><td>Coleman</td><td>Powermate CT5</td><td>Aria compressa: 30 psi</td></tr><tr><td>Regolatori di pressione</td><td></td><td>Marsh Bellofram</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Generatore di impulsi</td><td></td><td></td><td>HP8112A</td><td>Generazione della frequenza di attuazione: 50 MHz</td></tr><tr><td>Stadio XYZ</td><td></td><td>Newmark Systems</td><td></td><td>Con motore passo-passo: stadio xy con corsa di 6 pollici (NLS4-6-25), stadio z con corsa di 2,5 pollici (NLS4-2.5-25), controllore a 3 assi (NSC-G3), risoluzione 0,1 µm</td></tr><tr><td>NIH 3T3</td><td>Linea cellulare</td><td></td><td></td><td>fibroblasti</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td></td><td></td><td></td><td>Soluzione allo 0,05%</td></tr><tr><td>Mezzo per cellule NIH 3T3</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Tampone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75</td><td></td><td></td><td></td><td>Flaconi per coltura cellulare</td></tr><tr><td>Tubi conici in plastica</td><td></td><td></td><td></td><td>15 ml, per coltura cellulare</td></tr></tbody></table>

titolo incapsulamento cella di goccioline

Title Cell Encapsulation by Droplets

Titolo Incapsulamento cella di goccioline

Il mio nome è Hang Moon. Sto lavorando con il professore dei preservativi. Lui e io lavoriamo con la piattaforma XYJ per creare una struttura tridimensionale della cellula.Ciao, sono PE e Lynn e stiamo lavorando al progetto di stampa cellulare con incapsulamento cellulare e mezzi e gel. Questo è un solenoide per l'eiezione di una cellula e di una miscela cellulare di aros sul mezzo cellulare. La valvola solenoide viene attivata da due linee di segnale.Il cavo del segnale proviene da una scheda secca qui. Il segnale proviene da qui. Quel cavo attraverso quel collegamento, quello è il generatore di funzioni principale.Quindi, in primo luogo, viene generato tramite il nostro metodo programmato. Quindi, se si desidera modificare il flusso, è possibile modificare il programma con la riga di interruttori oppure controllare quel generatore di processo tramite computer. La valvola cellulare si apre e si chiude in risposta a un segnale elettrico, ma la cellula viene alimentata attraverso quella linea.La cella e il mezzo o il gel di agarosio vengono forniti attraverso siringhe. Le siringhe all'interno dell'acqua, all'interno della siringa, sono sottoposte a pressione leggera causata dall'aria. L'aria pressurizzata viene fornita da un serbatoio, come qui indicato dalla linea.Quindi la piccola linea e l'aria ionizzata passano attraverso il filtro dell'aria. Il filtro dell'aria discrimina la polvere e altri tipi di sporco. Ciò che chiamiamo generatore di pressione produce il segnale utilizzato per aprire o chiudere la valvola dell'aria solare; il computer è collegato tramite connettore P-I-B-U-S-V.Quindi possiamo utilizzare la porta USB collegandola direttamente al nostro computer, al portatile. Quella è collegata a questo lato qui. E poi possiamo controllare tramite il computer di controllo qui.Pertanto, se vogliamo sincronizzare il movimento della piattaforma e l'apertura del campana, ciò può essere controllato dallo stesso controller di un laptop. Possiamo quindi controllare i tempi di apertura, chiusura, movimento e arresto. Inoltre, possiamo sincronizzare il movimento con l'apertura del campana.Quella fase è la fase motorizzata. Viene spostata automaticamente tramite il cavo del segnale di morte e il motore. La motorizzazione è quindi di 0,1 micrometri.Quindi, idealmente, può tracciare la linea fino alla linea dei 100 millimetri. L'asse del getto si muove, salendo e scendendo in questo modo. In questo modo controlla lo spazio tra il substrato e la cinghia solare.Quindi può controllare l'altezza di espulsione. Il substrato è collegato agli stadi XY qui, X qui e Y lì. Pertanto si muove all'interno di un piano XY.Quindi disegna alcune demo di caratteristiche in determinate fasi: ci sono tre assi, X, Y e G. L'asse del getto (asse del getto) o l'asse XY sono controllati da un segnale qui. La linea del segnale è collegata al controllore del movimento qui. Tale controllore del movimento non dispone di alcun interruttore manuale, poiché non può essere controllato manualmente.È controllato tramite il computer portatile. Quindi il computer portatile è collegato. Sul retro del controller, abbiamo tre xs per una cella di stampa XY jet.Quindi genera tre tipi diversi di segnale in modo indipendente. Il controller del movimento comunica attraverso i connettori RF 2, 3, 2 che sono collegati direttamente all'USV. L'USV è poi collegato al computer portatile.Quindi il prestatore controllato dal laptop. Utilizziamo il programma AutoCAD, creiamo un percorso di gen A in questo modo bam. E poi viene convertito nel linguaggio della macchina in questo modo.Quindi il linguaggio macchina viene trasferito in modo che il semplice carattere e i numeri siano così. Ogni posizione è associata agli assi X, Y, Z; qui scelgo il file che contiene quel tipo di programma, quindi apro il programma di download in questo modo. Successivamente scelgo dal file esattamente lo stesso file di testo.Viene scaricato solo il file di testo; selezionare il file di testo e scaricarlo automaticamente dal laptop al controller di movimento com, quindi procedere con il carattere BAM come menzionato in precedenza, BAM. In questo flacone ci sono cellule di fibroblasti murini NIH/3T3. Per prima cosa procederò ad aspirare il vecchio mezzo di coltura.Questo processo serve per il passaggio delle cellule, che sono aderenti al fondo della fiasca. Pertanto, dopo aver aspirato il mezzo, aggiungerò sei RYS, che è un enzima. Ok? Dopo aver aggiunto la tripsina nella fiasca, è necessario attendere da tre a cinque minuti affinché le cellule si stacchino dal fondo della fiasca.Ora siamo pronti ad aggiungere il mezzo e a trasferire le cellule in un tubo da centrifuga. Si tratta di una diluizione uno a uno. Quindi aggiungo qui sei millilitri di questo mezzo e risciacquo leggermente i piatti per assicurarmi che tutte le cellule vengano trasferite.E ora le cellule sono pronte per essere centrifugate in questo tubo. Ora centrifugheremo queste cellule a mille giri al minuto per tre-cinque minuti. Ora che le cellule sono state sedimentate in un pellet, aspirerò il sopranatante.Ora procederò a lavare le cellule con PBS. Questo passaggio serve per la colorazione delle cellule. I coloranti che stiamo utilizzando sono substrati esterasici.Ok, ora procederemo nuovamente con la centrifugazione per far sedimentare le cellule in un pellet. Aspirerò il PBS e risospendo le cellule nel mezzo da conteggiare.Sto mescolando le cellule in modo che, quando preleverò un campione, la concentrazione sarà uniforme in tutta la provetta. Ora preleverò cento microlitri delle cellule per misurare la densità cellulare. Ora aggiungo cento microlitri di trypan blue, che è un colorante.Attendiamo da tre a cinque minuti affinché il colorante penetri le membrane delle cellule morte. Durante il conteggio delle cellule, non consideriamo quelle di colore blu. Le cellule sono pronte per essere contate con l'emocitometro; trasferirò 50 microlitri della sospensione cellulare su ciascun lato dell'emocitometro.Ok, lo coprirò con il lato del vetrino. Il emocitometro ha due lati. Andrò a contare il primo lato e, dopo aver contato entrambi i lati, farò la media e poi moltiplicherò per due, poiché abbiamo effettuato una diluizione uno a uno con il tipo in blu.Quindi, in pratica, la nostra densità cellulare sarà di 135 per 10 alla quattro cellule per ml. Per il nostro esperimento, utilizzeremo una soluzione cellulare con una concentrazione di mezzo milione di cellule per ml. E poiché abbiamo 13,5 milioni di cellule, sospenderò le cellule in 27 ml di mezzo.Stiamo utilizzando due tipi diversi di coloranti. Si tratta di un saggio live/dead di Molecular Probes. Il nostro primo colorante si chiama calcium am.Il nostro secondo colorante si chiama dimero AUM. Colora le cellule morte. Utilizziamo un'eccitazione blu per ottenere una fluorescenza verde e un'eccitazione verde per ottenere una fluorescenza rossa. Per questi due coloranti, quando eseguiamo l'immagine, la nostra soluzione verrà preparata in PBS.Quindi, per prima cosa trasferirò cinque mil di PBS in un tubo, soluzione salina tamponata al fosfato. Questa è una soluzione salina. Ora aggiungerò mezzo microlitro di calcio am per mil.Ora aggiungo 2,5 microlitri di calcio am al tubo e 2 microlitri di omodimero athe per mil di PBS. Questa è la macchina btex. Distribuisce uniformemente le cellule e il mezzo in tutto il volume.Ora carichiamo la cella con 200 microlitri qui sul sette. Quindi mettiamo il cappuccio, che è sigillato ermeticamente in questo modo; qui apro la valvola e poi entra aria leggera sotto pressione, quindi regolo la cinghia in questo modo. E poi modifico la pressione.Quindi regolo. La pressione è di cinque PSI. La pressione all'interno del tubo è di cinque PSI.Da qui a qui, è collegato attraverso questo all'interno del foro. Quindi, apriamo semplicemente il campana qui, poi la cella viene iniettata con una pressione di cinque PSI e quindi inizia l'apertura. E poi la valvola Sona inizia a funzionare.E poi arrotoliamo il substrato. Il substrato è semplicemente un vetrino. Quindi carichiamo la porzione corretta e metto del nastro adesivo per fissare il substrato in questo modo, giusto?E semplicemente lo fisso. Quindi impostiamo l'intero sistema, la cella e la valvola ary e il substrato durante lo spostamento del componente ary in funzione, che inizia a lavorare. Dunque configuriamo l'intero sistema e quindi apriamo la valvola ary per iniziare.E poi spostiamo la piastra in questo modo, giusto? E poi creiamo un certo modello sul substrato, un modello sul substrato e bum, il carattere. Immergerò queste gocce che abbiamo stampato nella soluzione colorante che abbiamo preparato in precedenza.Ora le goccioline verranno incubate per 10 minuti e successivamente analizzate mediante imaging. Per prima cosa, regolerò l'immagine attraverso l'oculare. La nostra prima immagine è semplicemente un'immagine in campo chiaro.Spengerò la luce e cambierò il filtro in modo da avere un'eccitazione blu, che mostrerà una fluorescenza verde. E la terza immagine che acquisiremo sarà quella delle cellule morte, ovvero la colorazione con Thm Homodimer. Con luce verde, otterremo una fluorescenza rossa.

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Titolo Incapsulamento cella di goccioline

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