High Throughput singola cellula e cellula Multiple-Micro-incapsulamento

Le applicazioni che utilizzano cellule incapsulate in gocce di piccole dimensioni da picolitri sono state spesso limitate dall'incapacità di controllare il numero di cellule per goccia. Questo protocollo dimostra un metodo per controllare l'incapsulamento cellulare combinando due distinti fenomeni microfluidici, l'ordinamento dinamico delle celle e la generazione di gocce in un microugello focalizzato a flusso. In un canale a monte, viene fornita una portata sufficientemente elevata di soluzione acquosa con celle o particelle sospese per provocare la formazione di treni con uguale spaziatura nella direzione del flusso a valle.

Un ugello di generazione di gocce con focalizzazione del flusso viene utilizzato per formare gocce acquose a velocità di kilohertz in un fluido vettore di olio ammissibile stabilizzato con tensioattivo. I treni di particelle cellulari ordinati vengono quindi combinati con la generazione di gocce regolando le velocità di flusso acquoso e di olio per fornire velocità di generazione di gocce sincronizzate con l'arrivo di celle o particelle ordinate longitudinalmente all'ugello di generazione delle gocce, mentre le particelle vengono utilizzate come surrogati cellulari. Per dimostrare questo protocollo, le portate devono essere sufficientemente piccole da limitare il fluido.

Stress puri sulle cellule biologiche, la sovrapposizione dell'ordinamento cellulare, la generazione di gocce e la vitalità cellulare. I vincoli di velocità di flusso acquoso forniscono un regime operativo ideale per l'incapsulamento controllato di celle singole e multiple. L'analisi dei dati della microscopia video mostra che le efficienze di incapsulamento a cella singola e doppia o di particelle superano le efficienze di incapsulamento casuale e riducono notevolmente il numero di gocce, che non contengono il numero desiderato di cellule o particelle.

Il confinamento delle cellule e delle gocce limita la diluizione delle secrezioni cellulari, evidenzia l'eterogeneità cellulare e controlla anche i segnali intercellulari rispetto a una sospensione di massa. Mezzi efficienti per incapsulare queste cellule in gocce fornisce uno strumento prezioso per i ricercatori biologici Per iniziare questa procedura. Progettare un modello a microcanali come mostrato in questa figura nel software AutoCAD.

La sezione lunga del canale rappresenta il canale di ordinamento del flusso acquoso con una larghezza di 27 micron. Lo schema dell'ugello ingrandito mostra larghezze di canale uguali di 27 micron per il canale di ordinazione acquoso e il canale dell'olio, seguiti dalla contrazione dell'ugello di 22 micron e dall'improvvisa espansione a un canale più ampio di 61 micron. L'altezza del dispositivo è di 52 micron.

Sia l'ingresso dell'acqua che quello dell'olio hanno grandi filtri per detriti con spazi vuoti nell'ordine della larghezza del canale di ordinamento, come illustrato da questo schema ingrandito dell'ingresso dell'olio. Mostrato. Ecco un'immagine reale del canale di ordinazione e dell'ugello iniettato con il colorante. Impiega un produttore di terze parti per stampare una maschera di trasparenza ad alta risoluzione su pellicola Mylar o quarzo in cui i canali sono trasparenti su uno sfondo scuro.

Successivamente creare un master in silicone e otto fotoresist SU per lo stampaggio della replica. Fissare lo stampo master sul fondo di una capsula di Petri per lo stampaggio della replica PDMS. Dopo che lo stampaggio della replica è stato completato e il contorno del dispositivo è stato ritagliato, utilizzare un punzone per biopsia del diametro esterno di 0,75 millimetri per perforare le porte fluidiche nelle tre regioni rotonde mostrate in questa figura, un caro nastro adesivo sul lato del modello del PDMS e staccare per rimuovere la polvere dopo l'incollaggio al plasma.

Il PDMS su un vetrino da microscopio in vetro pulito. Metti l'intero dispositivo in un forno e riscalda il forno gradualmente fino a 120 gradi Celsius. Lasciare il dispositivo nel forno a 120 gradi Celsius per una notte per completare l'incollaggio e riportare il PDMS al suo stato idrofobico originale.

Un metodo alternativo per rendere idrofobica la superficie di vetro del canale consiste nell'iniettare un rivestimento come l'acqua nelle porte fluidiche e quindi spurgare con aria. Utilizzando una siringa da un millilitro e un ago per siringa, aspirare diverse centinaia di microlitri di aria, seguita da una piccola quantità di aquil sufficiente a riempire solo la punta della siringa di metallo con attenzione, ma iniettare saldamente l'acqua seguita dall'aria di spurgo nelle porte fluidiche. Senza rompere il PDMS al vetro legandolo in modo aggressivo.

Ripetere lo spurgo dell'aria su tutte le porte di ingresso e di uscita rimuovendo l'acqua in eccesso per evitare depositi che potrebbero ostruire i canali durante l'asciugatura. Il controllo della concentrazione cellulare è essenziale per ottenere il numero corretto di cellule al numero corretto di gocce. Questo ha due componenti impegnative.

Il primo è stimare in anticipo la concentrazione corretta e il secondo è mantenere tale concentrazione durante l'esperimento Per il particolare dispositivo utilizzato in questo studio, le celle o le particelle da otto a 15 micron devono essere adeguatamente ordinate per l'incapsulamento controllato. In questa dimostrazione, le microsfere di polietilene da 9,9 micron saranno utilizzate come surrogati cellulari per preparare la concentrazione di sospensione acquosa di particelle per ottenere l'incapsulamento ideale dell'audit, iniziando con una concentrazione di stock di microsfere dell'1% di solidi in peso utilizzando i dati precedenti per l'ordinazione completa. A titolo indicativo, aumentare la concentrazione all'1,5% di solidi centrando delicatamente un millilitro del campione di riserva, rimuovendo 250 microlitri di liquido supinato e sospendendo le particelle mediante miscelazione a vortice o miscelazione più delicata.

Quando si utilizzano le celle, sia le celle che le particelle di polistirene hanno un peso specifico maggiore di uno, anche se non mostrato in questo video. Per esperimenti a lungo termine dell'ordine di molti minuti o ore, la soluzione può essere abbinata alla galleggiabilità aggiungendo un soluto come il cloruro di calcio per le particelle o la preparazione ottimale per le cellule. Dopo che la cella o la sospensione di particelle è pronta, preparare un campione da 10 millilitri della fase continua di fluorocarburo in un vortice di provette da centrifuga da 15 millilitri.

Miscelare il tensioattivo e l'olio fluorocarbonico a circa il 2,5% in peso. Qui otteniamo una miscela di 2,4 peso in peso, che è accettabile per impostare l'esperimento di micro incapsulamento. Innanzitutto, accendere il microscopio ottico invertito e la fotocamera ad alta velocità.

Concentrati sullo strato di microcanali e ispeziona i canali per verificare la presenza di intasamenti ed eventuali detriti che potrebbero staccarsi. Seleziona un canale privo di detriti di grandi dimensioni o ostruzioni evidenti. Tagliare tre lunghezze di tubo in PVC tigon traslucido per l'ingresso acquoso, l'ingresso dell'olio e l'uscita dell'emulsione per ridurre al minimo il volume morto.

Tagliare il tubo quanto basta per raggiungere le pompe a siringa al microscopio. Estremità del tubo tagliate a tavolino con un angolo di 45 gradi Per facilitare l'inserimento nelle porte fluidiche, utilizzare una pinzetta per inserire a pressione le estremità del tubo nelle porte fluidiche. Quindi inserire a pressione un ago per siringa in acciaio inossidabile con punta smussata calibro 30 nell'estremità libera del tubo di ingresso acquoso.

Ripetere per il tubo di ingresso dell'olio. Spostare il dispositivo e collegare il tubo al tavolino del microscopio utilizzando un allineamento dell'obiettivo 20 volte e mettere a fuoco l'ugello del dispositivo. Regolare manualmente il microscopio per l'illuminazione Kohler per fornire un'illuminazione ottimale sul piano focale.

Utilizzando il software della fotocamera ad alta velocità, ritaglia il campo visivo attorno all'ugello per consentire frame rate più elevati e quindi imposta la frequenza dei fotogrammi, il tempo di esposizione e altre impostazioni della fotocamera come richiesto per una registrazione ottimale. Quindi, riempire una siringa da un millilitro con la soluzione in fase acquosa ben miscelata precedentemente preparata. Riempire una siringa da tre millilitri con la soluzione in fase oleosa.

Inclinare verticalmente una delle siringhe piene e muovere le bolle d'aria verso l'uscita della siringa. Premere lentamente lo stantuffo abbastanza a lungo da spingere l'aria verso la punta della siringa che tiene la siringa verticalmente. Collegare la siringa al rispettivo ago della siringa già collegato al dispositivo.

Premere lo stantuffo per forzare il volume morto dell'ago della siringa fino a quando il fluido non viene spinto attraverso il tubo quasi fino al dispositivo, montare saldamente la siringa su una pompa a siringa e innestare il blocco dello stantuffo. Ripetere i collegamenti per la seconda siringa e montarla su una seconda alimentazione della pompa a siringa su ciascuna pompa a siringa e programmare ciascuna pompa. Utilizzando i protocolli del produttore, impostare le portate iniziali a 50 microlitri al minuto per la fase oleosa e a cinque microlitri al minuto.

Per l'avvio della fase acquosa, le pompe attendono che ogni fluido entri nel dispositivo e riempiono i canali espellendo l'aria morta rimanente. L'utilizzo delle portate iniziali può richiedere diversi minuti. Osservare la formazione di gocce sull'ugello.

Aumentare lentamente la portata acquosa per osservare l'ordine delle particelle nel lungo canale della soluzione acquosa. All'aumentare della portata, non aumentare la portata fino al punto in cui viene attivato il getto del flusso di fluido acquoso sull'ugello, come mostrato in questo esempio, utilizzando una diversa nota dell'ugello di generazione della goccia, il flusso instabile e la goccia incoerente sono qui. Se la concentrazione di particelle è troppo bassa per fornire treni alternati con relativamente poche particelle mancanti e il campione non era corrispondente alla galleggiabilità, inclinare fisicamente la pompa a siringa verso l'uscita della siringa per fornire una sedimentazione graduale delle particelle verso le uscite della siringa.

Una volta effettuato un ordine adeguato, regolare la portata dell'olio per regolare la frequenza di generazione e la dimensione delle gocce. Regola in modo iterativo entrambe le portate per ottenere le velocità di incapsulamento e i volumi di caduta desiderati. Una volta confermato l'incapsulamento ordinato stabile, spostare il tubo di uscita dal serbatoio di scarico in un serbatoio di raccolta per un uso futuro.

L'incapsulamento di particelle singole e doppie o di celle può essere ottenuto ad alta efficienza. L'utilizzo di questo protocollo mostrato qui è un risultato rappresentativo dell'incapsulamento di singole particelle con una portata d'olio di 60 microlitri al minuto e una portata acquosa di nove microlitri al minuto. Lambda, il numero medio di particelle per goccia è 0,95.

La spaziatura delle particelle nella direzione del flusso è di circa 17-18 micron per particelle alternate completamente ordinate. La velocità di generazione delle gocce in questo esempio è di 6,1 kilohertz con una dimensione media delle gocce di 24,4 picolitri. L'istogramma confronta l'efficienza delle particelle di incapsulamento a goccia dell'ordine dell'incapsulamento di una singola particella con il più.

In base alle statistiche, l'incapsulamento casuale per una dimensione del campione di 517 gocce, la frazione media di gocce contenenti una particella è del 79,5% rispetto a una frazione di incapsulamento casuale prevista del 36,7% La frazione di particelle che finiscono nelle gocce correttamente incapsulate è stata osservata essere dell'83,7% per una dimensione del campione di 491 particelle, mentre la frazione di incapsulamento casuale era del 37,3%L'incapsulamento a doppia particella si ottiene semplicemente riducendo la portata dell'olio a 30 microlitri al minuto, mantenendo la portata acquosa a nove microlitri al minuto. Qui lambda, il numero medio di particelle per goccia è 1,8. Simile all'incapsulamento di singole particelle.

La spaziatura delle particelle nella direzione del flusso è di circa 17-18 micron per particelle alternate completamente ordinate. Le gocce più grandi hanno una dimensione media di 39,8 picolitri e si sono formate a una velocità di 3,8 kilohertz rispetto all'incapsulamento casuale. Per una dimensione del campione di 383 gocce, la frazione media di gocce di incapsulamento ordinate contenenti due particelle è del 71,5% rispetto a una frazione di incapsulamento casuale prevista del 26,8% La frazione di particelle che tendeva nelle gocce correttamente incapsulate è stata osservata essere del 79,5% per una dimensione del campione di 689 particelle, mentre la frazione di incapsulamento casuale era del 33,4% Presa.

Insieme, questi risultati mostrano che sia l'efficienza di incapsulamento di particelle singole che quelle doppie superano le efficienze di incapsulamento casuale di oltre un fattore due e riducono notevolmente il numero di gocce, che non contengono il numero desiderato di cellule o particelle. L'importanza di concentrazioni corrette di particelle o celle per un'elevata efficienza di incapsulamento è illustrata in questa corsa sperimentale. Mentre le portate di olio e acqua sono le stesse della corsa di incapsulamento a doppia particella mostrata in precedenza, il numero medio di celle per goccia lambda è diminuito a 1,57.

Di conseguenza, l'ordinamento completo non si verifica e quindi emergono buchi nei treni che lasciano gocce di sole con meno particelle del previsto. Questo istogramma mostra la diminuzione dell'efficienza per l'incapsulamento di due particelle a causa del valore più basso di Lambda. Per una dimensione del campione di 324 gocce, la frazione media di gocce contenenti due particelle era del 55,9% con quasi lo stesso numero di gocce di particelle singole come gocce di particelle doppie.

Ciò indica che Lambda deve essere uguale o vicino al numero di celle desiderate per goccia per massimizzare le particelle o le celle correttamente incapsulate con l'esatto valore di lambda scelto, a seconda che sia tollerabile un numero inferiore o maggiore di cellule per goccia. In questa dimostrazione, sfruttiamo le discrepanze di galleggiamento per consentire il controllo in tempo reale della concentrazione durante l'esperimento. Tuttavia, per esperimenti a lungo termine, può essere consigliabile abbinare la corrispondenza di galleggiamento per ottenere risultati più coerenti dopo l'incapsulamento delle cellule in gocce acquose.

Gli esperimenti dipendenti dal tempo possono essere eseguiti in una provetta da centrifuga o al microscopio reiniettando le gocce in array microfluidici.