L'incapsulamento delle cellule dei mammiferi nei branelli di Alginate usando un vaso semplice mescolato

Questo video descrive un metodo per immobilizzare le cellule dei mammiferi, come le isole pancreatiche in perle di alginato utilizzando un semplice recipiente agitato. Il principio del metodo consiste nel generare goccioline di alginato mediante emulsione di acqua e olio, seguita dalla gelificazione interna delle goccioline di alginato. La prima fase della procedura consiste nel generare un'emulsione in cui una fase acquosa contenente cellule di alginato e carbonato di calcio viene dispersa in una fase organica di olio minerale.

Il secondo passaggio consiste nell'acidificare l'emulsione aggiungendo un acido solubile in olio, come l'acido acetico, che si divide rapidamente nella fase acquosa. L'abbassamento del pH porta alla dissoluzione del carbonato di calcio e alla gelificazione interna delle goccioline di alginato in perle. La fase finale consiste nel recuperare le perle dall'emulsione mediante l'aggiunta di una soluzione acquosa, separando le fasi mediante centrifugazione, seguita dal lavaggio e dal filtraggio delle perle.

Le cellule immobilizzate possono quindi essere coltivate in vitro o utilizzate per il trapianto. Il metodo che abbiamo descritto è un'alternativa all'utilizzo di incapsulatori cellulari basati su ugelli per generare perle di alginato. Questo è stato derivato da un metodo per gli enzimi e l'immobilizzazione delle cellule microbiche, riportato per la prima volta da Poncelet e altri nel 1992.

L'applicazione che ci interessa di più è l'incapsulamento dell'alginato come mezzo per immunoisolare le cellule trapiantate, in modo da ridurre o addirittura eliminare la necessità di farmaci antirigetto. I principali vantaggi del processo basato su emulsione rispetto ai dispositivi basati su ugelli sono la sua scalabilità e la sua robustezza. Poiché le goccioline vengono generate quasi simultaneamente, è possibile produrre quantità molto grandi di perle in periodi di tempo molto brevi, da soluzioni di alginato molto diluite o molto concentrate.

Inoltre il processo è molto robusto, e non è soggetto a guasti, e anche in presenza di particelle che potrebbero ostruire gli ugelli, e infine l'attrezzatura di processo è abbastanza semplice e quindi accessibile, molto relativamente a basso costo per la maggior parte dei laboratori. Le fasi chiave della lavorazione sono l'emulsione per formare le goccioline di alginato e l'acidificazione per rilasciare la fonte interna di calcio. La dimensione delle gocce è influenzata principalmente dal design della girante, dalla velocità di agitazione e dalla durata dell'agitazione.

Le proprietà meccaniche delle perle e la sopravvivenza cellulare sono influenzate dall'entità e dalla durata dell'acidificazione. In questo video mostriamo un metodo utilizzato per incapsulare le cellule in perle di alginato al 5% per il trapianto. Questi parametri richiederebbero probabilmente l'ottimizzazione per altre potenziali applicazioni.

Per generare perle di alginato al 5% contenenti una miscela metà e metà di alginati LVM e MVG, pesare 583 milligrammi di LVM e 583 milligrammi di polvere di acido alginico MVG. Posizionare 20 millilitri di tampone di processo su una piastra di agitazione magnetica. Per le applicazioni di trapianto utilizziamo un tampone HEPES da 10 millimolari contenente 170 millimolari di cloruro di sodio a pH 7,4.

Aggiungere progressivamente la polvere di acido alginico alla soluzione. Lasciare agitare la soluzione per una notte a bassa velocità. Se necessario, fissare il pallone alla piastra di agitazione.

Il giorno successivo, se l'alginato è sciolto in modo incompleto, fissare il barattolo su un mixer rotante e continuare a mescolare per una notte a 37 gradi Celsius. Una volta che l'alginato è completamente sciolto, sterilizzare la soluzione in autoclave per 30 minuti. Lasciare che la temperatura scenda sotto i 50 gradi Celsius prima di aprire l'autoclave.

Preparare la sospensione di carbonato di calcio aggiungendo un grammo di carbonato di calcio a 20 millilitri di tampone di processo. Autoclavare in autoclave la sospensione di carbonato di calcio e il recipiente agitato utilizzato per il processo di emulsione. Prima dell'uso, rimuovere eventuali tracce di acqua di condensa dal recipiente.

Immediatamente prima del processo di emulsione, sciogliere 44 microlitri di acido acetico glaciale in 11 millilitri di olio minerale posto in un tubo conico da 50 millilitri. Un errore comune è la dissoluzione incompleta dell'acido acetico, evitare di pipettare quantità inferiori a 10 microlitri e assicurarsi che l'acido sia completamente disciolto mediante vortice ripetuto. Lasciare che tutte le soluzioni raggiungano la temperatura ambiente prima di procedere all'incapsulamento delle celle.

Mettere 10 millilitri di olio minerale nel pallone rotante e iniziare a mescolare a 250 giri/min. Se si utilizzano cellule aderenti come le cellule beta-tc3, tripsinizzare le cellule. Terminare la reazione aggiungendo il terreno completo e prelevare un campione per l'enumerazione delle cellule.

Determinare la concentrazione delle celle manualmente o con un contatore di celle automatizzato. Centrifugare le celle per sette minuti a 300 g e quindi risospendere il pallet di celle in terreno completo. Ripetere la fase di centrifugazione e quindi risospendere le cellule nel volume appropriato di terreno completo per ottenere 10 volte e 1/2 la concentrazione finale desiderata nelle perle.

Trasferire 9,9 millilitri di soluzione di alginato in una provetta a fondo piatto, quindi aggiungere 1,1 millilitri di cellule e 550 microlitri di sospensione di carbonato di calcio. Mescolare l'alginato, il carbonato di calcio e la sospensione cellulare mediante un leggero vortex. Trasferire immediatamente 10,5 millilitri di questa miscela nell'olio agitatore utilizzando una siringa.

Aumentare la velocità di agitazione e quindi avviare il timer. Per determinare la velocità di agitazione, è necessario prima generare una curva standard che metta in relazione la dimensione del cordone con la velocità di agitazione. Dopo 12 minuti aggiungere 10 millilitri di soluzione di olio e acido acetico per acidificare l'emulsione, rilasciare il calcio dal carbonato e ottenere perle gelificate.

Attendere otto minuti per questa fase di gelificazione interna. Notare il cambiamento di colore delle goccioline emulsionate che contengono l'indicatore di pH rosso fenolo. Ridurre la velocità di agitazione a 400 giri/min, neutralizzare l'acido aggiungendo 40 millilitri di tampone di processo miscelato con il 10% di medium, che porta all'inversione di fase.

Interrompere l'agitazione un minuto dopo e trasferire il composto in tubi conici. Sciacquare il pallone con altri 20 millilitri di terreno e aggiungerlo ai tubi. Aspirare la maggior parte possibile della soluzione acquosa prima di aspirare la fase oleosa.

Centrifugare le provette per tre minuti a 630 g per accelerare la sedimentazione delle microsfere e la separazione di fase. Rimuovere l'olio e il tampone di processo in eccesso aspirando con una pipetta Pasteur. Lavare le perle almeno una volta con un fluido utilizzando 630 g di centrifugazione tra un lavaggio e l'altro.

Filtrare la sospensione del cordone su filtri cellulari in nylon da 40 micron e aspirare il liquido in eccesso nel filtro dal basso. Trasferire le perline in un volume noto di terreno utilizzando una spatola. Misurare il volume del cordone e rabboccare il fluido per ottenere la concentrazione di microsfere desiderata.

Una concentrazione tipica è di un millilitro di perle per cinque millilitri di volume totale. Da questo punto in poi, maneggiare sempre le perle con pipette di grosso diametro per evitare di danneggiarle. Le cellule incapsulate possono ora essere trasferite in fiasche a T e utilizzate per la coltura in vitro o il trapianto.

Al termine del processo di emulsione, si devono ottenere perle di alginato contenenti cellule immobilizzate. Dopo il processo, la distribuzione delle dimensioni delle perle e la sopravvivenza cellulare devono essere valutate di routine. Per determinare la distribuzione delle dimensioni delle perle, le perle possono essere colorate con blu di toluidina, seguite dall'analisi dell'immagine.

Da questo processo ci si aspetta un'ampia distribuzione delle dimensioni delle perline. Per valutare la sopravvivenza cellulare, le perle possono essere incubate con coloranti morti vivi, come la calceina-AM e l'omodimero di etidio. Utilizzando il processo descritto in questo video, è stata misurata la sopravvivenza delle cellule beta-tc3 del 76%.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come immobilizzare le cellule di mammifero in perle di alginato usando un semplice sistema agitato. Il protocollo di base mostrato in questo video dovrebbe essere adatto per immobilizzare una varietà di tipi di cellule utilizzando un'ampia gamma di tipi di alginato e calcitrazioni. Si consiglia di generare una curva standard che metta in relazione la dimensione media delle perle con la velocità di agitazione con ogni nuovo lotto di alginato o olio.

Il processo di emulsione che abbiamo descritto è un'alternativa promettente agli incapsulatori di celle basati su ugelli. È un metodo robusto e semplice per immobilizzare le cellule di mammifero in perle di alginato. Mentre noi e altri in tutto il mondo sviluppiamo terapie cellulari con ugelli, tale scala di metodi sarà necessaria per le molte migliaia di pazienti diabetici.

Abbiamo pubblicato risultati promettenti dal trapianto di una linea cellulare beta in perle di alginato al 5% e continuiamo a esplorare le prestazioni in vivo di questa barriera migliorata al rigetto del trapianto.