Utilizzando ad alta risoluzione Tomografia Computerizzata Per visualizzare la struttura tridimensionale e funzione delle piante Vasculature

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare la tecnologia di microtomografia a raggi X basata sul sincrotrone per esplorare la struttura e la funzione del trasporto vascolare nelle piante. Ciò si ottiene preparando prima i campioni per l'installazione in un supporto per mandrino o nel supporto per piante vive, assicurandosi che la parte da scansionare sia il più verticale possibile ed effettuando le necessarie misurazioni fisiologiche preliminari. Il secondo passo consiste nel posizionare i campioni preparati o le piante vive nella gabbia A LS Beamline 8.3 0.2 e fissare la gabbia per la scansione. Prossimo.

Dopo il corretto posizionamento del campione, viene avviata la scansione. Il passaggio finale consiste nell'utilizzare i computer workstation per normalizzare, ricostruire e valutare la qualità della scansione prima di passare i dati in un VISO per il processo di visualizzazione 3D. In definitiva, la microtomografia a raggi X viene utilizzata per rivelare dettagli precisi delle interconnessioni e dello stato funzionale della vascolarizzazione dell'acqua che conduce nelle piante.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il sezionamento seriale e la microscopia ottica, è che il tessuto vegetale può essere esplorato in qualsiasi orientamento con una risoluzione senza precedenti. Questo metodo può aiutarci a comprendere le questioni chiave nel campo della biologia vegetale, dagli aspetti fondamentali del trasporto dell'acqua nelle piante alla siccità, dalla tolleranza al gelo al modo in cui i patogeni si muovono sistemicamente nelle piante ospiti. Questo protocollo, come descritto, è progettato per lavorare con la sorgente di luce avanzata.

8,3 0,2. Possono essere necessari adattamenti della linea di luce per il lavoro in altre strutture di sincrotrone. Assicurati di seguire la formazione sulla sicurezza e sulle radiazioni richiesta per l'uso di queste strutture per iniziare la preparazione dei campioni per le piante vive.

Per prima cosa coltiva le piante in vasi di circa 10 centimetri di diametro, assicurandoti che il fusto principale o l'altra parte della pianta da scansionare sia il più centrata possibile e orientata verticalmente nel vaso. Le dimensioni fisiche dello strumento HRCT Hutch limitano le piante vive a circa un metro di altezza. Di conseguenza, l'imaging di piante vive viene eseguito al meglio su piantine o alberelli.

Coltivate in piccoli vasi, utilizzano una presina rigida in alluminio su misura per montare le piante vive in vaso. L'altezza della piastra superiore deve essere regolata per adattarsi a una gamma di altezze del vaso. Qui, la parte superiore della piastra è progettata per allinearsi con la parte superiore della superficie del terreno e la pianta sporge dal centro della piastra in due parti.

Una volta montato nel supporto, misurare il potenziale idrico dello stelo utilizzando una camera a pressione in stile lander SHO o un parametro fogliare a clip per determinare lo stato fisiologico della pianta prima della scansione. Attorciglia un piccolo pezzo di filo di rame attorno allo stelo per fungere da fiduciario per garantire una posizione di scansione coerente sulle piante che verranno scansionate ripetutamente. Ora, posiziona un cilindro acrilico a parete sottile sopra la pianta sopra il supporto per piante in alluminio e fissalo in posizione con le viti per stabilizzare il campione.

È necessario utilizzare ulteriori tovaglioli di carta da imballaggio e nastro adesivo per ridurre ulteriormente le vibrazioni e il movimento delle parti dell'impianto, che possono causare distorsioni dell'immagine. Fissare la presina personalizzata al tavolino con cuscinetto d'aria e bloccarla in posizione posizionata tra la sorgente di raggi X e il sensore di immagine e l'apparecchiatura della fotocamera. Assicurarsi di posizionare lo stelo il più verticalmente possibile e centrare il campione sulla base del mandrino magnetico per assicurarsi che rimanga nel campo visivo Durante la rotazione, il materiale vegetale fresco, in genere steli o animali domestici, può essere scansionato dopo la rimozione immediata da una pianta viva.

Se l'intento dell'esperimento è quello di visualizzare l'intera rete xilematica, l'acqua all'interno dei recipienti deve prima essere evacuata e sostituita con aria. Per fare ciò, montare il campione in una camera a pressione di tipo calunnia e spingere aria compressa o azoto attraverso il campione a bassa pressione per circa cinque minuti. Le specie differiranno nel tempo necessario per evacuare la rete di navi.

Se l'intento è quello di valutare l'entità della formazione di embolia nel tessuto vegetale fresco, asportare campioni dalla pianta utilizzando una lama di rasoio fresca facendo i tagli sott'acqua. Quindi, avvolgere il campione in uno strato di paraforma per evitare l'essiccazione durante la scansione, montare il campione in un mandrino di perforazione fissato a una piastra metallica avvitata nel cuscinetto d'aria, al centro del palco, e orientare il campione verticalmente come descritto in precedenza, per garantire che il campione rimanga nel campo visivo. Per preparare campioni da tessuto legnoso essiccato, iniziare tagliando i campioni a circa sei centimetri di lunghezza.

Selezionare campioni che siano il più dritti possibile nella regione di scansione mirata e che abbiano un diametro di circa un centimetro. Il passaggio successivo consiste nel disidratare lentamente l'intero campione per garantire una visualizzazione ottimale del campione tissutale e il contrasto dell'immagine. Posizionare il campione di tessuto legnoso in un forno di essiccazione a bassa temperatura per asciugare lentamente il campione senza causare screpolature o spaccature del tessuto.

In alcune situazioni, può essere auspicabile avere un marcatore fiduciario allegato al campione. Ciò garantisce che la successiva dissezione e visualizzazione utilizzando la microscopia elettronica a scansione possa essere orientata in punti specifici dell'immagine HRCT. Per fare ciò, attacca una perlina o un filo di metallo o di vetro all'esterno dello stelo usando il profumo.

Infine, montare il campione nel controllo del trapano e centrare come descritto sopra prima della scansione. Determina l'ingrandimento che funzionerà meglio per la tua applicazione. L'A LS Beamline 8.3 0.2 utilizzato qui ha la capacità di scansionare con lenti con ingrandimenti di due x cinque x e 10 x.

Impostare l'energia dei raggi X a 15 kilo elettronvolt. I tempi di esposizione dipendono generalmente dallo spessore e dalla densità del campione e vanno da 100 a 1000 millisecondi. Scegliere un incremento angolare appropriato per l'applicazione.

I campioni vengono ruotati di 180 gradi durante una scansione e il numero di immagini scattate durante la rotazione può avere un impatto significativo sulle dimensioni del set di dati, sulla lunghezza dell'intervallo di scansione e sulla qualità finale dell'immagine. Le scansioni tipiche vengono eseguite con incrementi di 0,25 gradi, producendo 513 immagini per scansione. È possibile ottenere intervalli di scansione più brevi utilizzando l'impostazione della tomografia continua durante la quale il campione ruota continuamente mentre le immagini vengono acquisite per ogni scansione, devono essere raccolte anche immagini in campo chiaro e in campo scuro.

Le immagini in campo chiaro sono immagini senza il campione nel raggio. Questi vengono spesso raccolti prima e dopo la scansione del campione traslando orizzontalmente il campione. I campi scuri vengono raccolti chiudendo l'otturatore a raggi X.

Misura la quantità di segnale che la telecamera mostra senza raggi X. Una volta completata la scansione, trasferire le immagini TIFF 2D grezze dal computer di acquisizione a un file server e quindi esportarle su un computer da utilizzare per l'elaborazione dei dati. Successivamente, le immagini devono essere convertite in una scala di trasmissione percentuale.

Beamline 8.3 0.2 dispone di un plug-in di normalizzazione dello sfondo personalizzato che può essere scaricato e utilizzato con i pacchetti software disponibili gratuitamente. Image J o Fiji caricano le immagini normalizzate nel pacchetto software octopus, quindi ricostruiscono un set di dati 3D dai file di immagine TIFF 2D raw utilizzando le fasi di elaborazione designate. Successivamente, la pila di immagini può essere visualizzata in uno dei vari pacchetti software.

Qui viene utilizzato il pacchetto software aviso, carica i set di dati nella memoria di sistema e visualizza il campione in orientamenti trasversali, longitudinali o radiali virtuali Grazie agli attributi 3D del set di dati, le fette virtuali attraverso il campione possono essere ruotate su qualsiasi piano per allinearsi con le regioni di interesse. Una volta effettuata la segmentazione, è possibile quantificare le strutture delle piante target o i cambiamenti funzionali in volume, lunghezza, larghezza, presenza o assenza di acqua, aria, ecc. Le scansioni HRCT di sincrotrone sono state implementate con successo su un'ampia varietà di tessuti e specie vegetali utilizzando la linea di luce 8.3 0.2 e hanno fornito nuove informazioni sulla struttura e la funzione dello xilema vegetale con una risoluzione senza precedenti in 3D.

Le capacità di visualizzazione ed esplorazione fornite dalle ricostruzioni 3D, come mostrato qui, consentono di determinare con precisione la posizione e l'orientamento delle strutture con le reti Xylem sia su campioni di accise che in piante viventi. Qui vediamo una ricostruzione 3D del fusto di sequoia sottoposto a stress da siccità e che mostra trachee piene d'aria e d'acqua. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in pochi minuti se eseguita correttamente Seguendo questa procedura. Altri metodi, come la microscopia elettronica a scansione, possono essere utilizzati per convalidare le strutture che vediamo all'interno delle piante e per ottenere soglie dimensionali, che vengono poi inserite nei programmi di elaborazione che utilizziamo per l'analisi dei dati.