Preparazione del campione per la visualizzazione tridimensionale basata sulla tomografia computerizzata dei vasi dell'arto posteriore murino
7 ottobre 2021
Qui, descriviamo un metodo di visualizzazione e quantificazione per i vasi murini degli arti posteriori utilizzando la tomografia computerizzata a micro-raggi X.
È possibile acquisire immagini TC dei vasi sanguigni negli arti inferiori e negli organi addominali utilizzando il protocollo step. Il metodo consente la valutazione completa di tutti i vasi sanguigni. Inoltre, è possibile valutare solo le arterie o, allo stesso tempo, le arterie e le vene.
È molto importante prevenire coaguli di sangue, perdite o sangue bene ed evitare bolle d'aria. Prima dell'operazione, iniettare 1 unità/grammo di eparina in PBS nella cavità intraperitoneale del topo. Dopo 30 minuti, fare un'incisione della linea mediana nello sterno del topo eutanasizzato e fissare il torace aperto con i perni.
Tagliare l'aorta ascendente prima di rimuovere il cuore, quindi rimuovere il polmone per esporre l'aorta discendente. Tagliare l'aorta discendente in diagonale per rivelare la sezione trasversale della nave. Quindi, inserire un catetere calibro 22 nell'aorta discendente durante l'esecuzione del buffer di vasodilatazione.
Fissare la radice del catetere e fare un nodo per evitare perdite dovute al riflusso. Una volta fatto, iniziare la perfusione con una soluzione vasodilatatrice riscaldata a una pressione fissa tra 13 e 15 kilopascal. Dopo tre minuti, perfondere una soluzione di paraformaldeide al 4% in PBS per 3 minuti.
Arrestare la perfusione e riempire il tubo di prolunga collegato al catetere con 2 ml del mezzo di contrasto appena preparato diluito nel rapporto 1:1 per perfusare a un punto fisso compreso tra 13 e 15 kilopascal. Per visualizzare le arterie, controllare l'unghia del piede della bocca per confermare che il mezzo di contrasto ha raggiunto l'arteria. Allo stesso modo, controllare la vena cava inferiore del diaframma per confermare la completa circolazione del mezzo di contrasto e visualizzare tutti i vasi.
Se la circolazione del mezzo di contrasto è completa, chiudere il rubinetto a tre vie e rimuovere il tubo. Incubare il campione durante la notte a 4 gradi Celsius. In questo protocollo, sono stati visualizzati tutti i vasi negli arti inferiori del mouse.
I risultati di un modello di ischemia degli arti posteriori hanno confermato che l'arteria femorale non legata correva parallela alla vena femorale. Inoltre, l'interruzione del mezzo di contrasto ha reso facile la visualizzazione di un'arteria femorale legata e lo sviluppo di vasi collaterali. Alcuni vasi pieni del mezzo di contrasto potevano essere visti.
D'altra parte, è stata notata anche l'interruzione dei mezzi di contrasto dovuta alla miscelazione di mezzi non contrapposti o a una perfusione insufficiente. Era impossibile visualizzare le arterie sulla superficie del corpo mediante l'osservazione microscopica o stereomicroscopica del mezzo di contrasto, il che rendeva più facile valutare i difetti della vascolarizzazione. È molto importante evitare bolle d'aria quando si inserisce il catetere.
Poiché anche i loro organi addominali sono rilassati, è possibile estrarre dagli organi e fare una TAC. Utilizzando questo metodo, siamo stati in grado di identificare un nuovo quarto di saturazione.
Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per visualizzare e quantificare i vasi degli arti posteriori murini utilizzando la tomografia computerizzata a micro-raggi X. La tecnica permette una valutazione completa dei vasi sanguigni negli arti inferiori e negli organi addominali.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Biologia vascolare
- Tecniche di imaging
Sfondo
- La tomografia computerizzata a micro-raggi X è un potente strumento di imaging.
- Comprendere la struttura dei vasi sanguigni è cruciale per vari studi biologici.
- I metodi precedenti potrebbero non fornire una visualizzazione completa.
- Questo studio mira a migliorare le tecniche di visualizzazione per i modelli murini.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per visualizzare i vasi degli arti posteriori.
- Permette la quantificazione delle strutture vascolari nei modelli murini.
- Valutare l'impatto degli interventi sulla salute vascolare.
Metodi utilizzati
- Iniezione di eparina per prevenire i coaguli di sangue.
- Perfusione di mezzo di contrasto per visualizzare i vasi sanguigni.
- Imaging CT per catturare strutture vascolari dettagliate.
- Valutazione di arterie e vene negli arti posteriori.
Risultati principali
- Visualizzazione di successo di tutti i vasi negli arti inferiori.
- Identificazione di vasi collaterali in un modello di ischemia degli arti posteriori.
- Sfide notate con bolle d'aria e perfusione incompleta.
- Il metodo ha permesso la valutazione dei difetti vascolari.
Conclusioni
- Il metodo fornisce un approccio completo all'imaging vascolare.
- Può migliorare la comprensione delle condizioni vascolari nei modelli murini.
- Le applicazioni future potrebbero includere studi sulla salute e sulle malattie vascolari.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This method enables comprehensive 3D visualization of murine vascular networks, supporting preclinical assessment of angiogenic responses and vascular pathology. By providing quantitative structural data from hind-limb and abdominal organ vasculature, it enhances target validation in vascular biology and ischemic disease models. The technique improves predictive confidence in lead identification by reducing reliance on 2D sectioning and enabling direct observation of vascular architecture and collateral formation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to angiogenesis and vascular remodeling in ischemic models.
- Operational Value: Provides functional validation of vascular targets through direct 3D imaging of perfusion defects and collateral development.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying vascular responses to pharmacological or genetic interventions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares standardized biological systems for downstream compound screening by establishing baseline vascular morphology.
- Quantitative Output: Delivers measurable vascular parameters such as vessel density, branching patterns, and perfusion completeness for assay standardization.
- Scalability: Compatible with micro-CT platforms, enabling reproducible imaging across laboratories and study sites.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models physiological and pathological angiogenesis in hind-limb ischemia, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery findings with preclinical validation by enabling longitudinal vascular assessment.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria by visualizing vascular defects and compensatory mechanisms that influence drug efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, particularly in target validation and lead optimization stages where vascular phenotypes are critical readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of angiogenic pathways and vascular integrity in disease models.
- Screening: Enables assay-ready vascular models with reproducible, quantitative imaging outputs for compound evaluation.
- Analytics: Provides structural and perfusion-based readouts that allow comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Connects molecular findings to vascular outcomes in preclinical models, supporting biomarker-linked efficacy assessment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for vascular phenotyping across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in vascular responses.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through standardized perfusion and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of vascular liabilities and reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted advancement decisions based on quantitative vascular morphology and perfusion data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical vascular perfusion and contrast agent handling.
- Dependent on micro-CT imaging infrastructure and contrast medium preparation capabilities.
- Necessitates cross-team standardization of perfusion pressure, timing, and contrast dilution for reproducible results.
- Adaptation across model systems may require adjustments in cannulation technique and perfusion parameters.
- Practical limitations include sensitivity to air bubbles, incomplete perfusion, and contrast mixing, which can impair visualization quality.
