Utilizzo di Scanner Flatbed per la raccolta ad alta risoluzione e ritardi Immagini della Arabidopsis Root gravitropica risposta
25 gennaio 2014
Questo protocollo descrive un procedimento per la rapida raccolta di immagini di piantine di Arabidopsis rispondono ad uno stimolo gravità utilizzando commercialmente disponibili scanner piani. Il metodo consente di poco costoso, ad alto volume cattura di immagini ad alta risoluzione possono essere sindacate per algoritmi di analisi a valle.
L'obiettivo generale di questo video è quello di illustrare un metodo basato su scanner per l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione della risposta tropica delle radici nell'opsi della pianta modello. Per iniziare questo protocollo, i semi del ceppo di semi designato vengono piantati su piastre di Petri contenenti un mezzo trasparente Dopo che i semi sono germinati per il periodo di tempo designato, le piastre di Petri vengono rimosse dalla camera di crescita, preparate per la scansione, quindi collocate in scanner piani orientati verticalmente. Le lastre vengono quindi ruotate di 90 gradi e scansionate per un periodo di tempo designato.
Le immagini vengono salvate sul computer o su un dispositivo di archiviazione dati e utilizzate successivamente per l'elaborazione delle immagini. Prima dell'acquisizione dell'immagine, preparare le piastre aga contenenti i due tessuti vegetali scansionati B. Per prima cosa, assorbire l'eventuale condensa accumulata sul coperchio e sui lati della piastra AGA con una salvietta kim.
Quindi, applicare una generosa quantità di Triton X 100 per prevenire future condense. Infine, termina questo processo avvolgendo la lastra con del nastro microporoso per fissare il coperchio e consentire la ventilazione per iniziare l'acquisizione dell'immagine. Impostare le cartelle per salvare le immagini nella posizione desiderata.
Ogni nome di cartella è costituito da una raccolta di metadati relativi alle informazioni da scansionare. In questo esempio, l'età dell'identificazione, la dimensione e il ceppo, le dimensioni e le scorte di semi univoci erano dati inclusi nei nomi delle cartelle. Questi metadati possono quindi essere copiati e incollati in un nome di cartella.
Questo protocollo presuppone che venga utilizzato più di uno scanner per raccogliere le immagini e fornisce istruzioni per collegare più scanner a un computer. Per questo motivo, sono state configurate tre cartelle per il salvataggio delle immagini. Il passaggio successivo consiste nell'impostare i timer per un orario di raccolta designato.
Dal momento che c'è ancora un bel po' di preparazione da fare a questo punto, assicurati di impostare i timer per un po' di tempo in più. Quindi, accendi il primo scanner e apri il programma di scansione della vista. Nella scheda di input, imposta l'origine sullo scanner corretto e la casella a discesa di ripetizione automatica su nessuno nella scheda di ritaglio.
Imposta l'area di anteprima su Massimo e premi anteprima. Scegli una casella di ritaglio che catturi la regione di interesse e imposti l'area di anteprima su casella di ritaglio. Quindi visualizza nuovamente l'anteprima dell'immagine.
Per salvare i dati raccolti nella posizione desiderata, premere la scheda di output e trovare i nomi delle cartelle precedentemente creati che corrispondono a ciascuno scanner. Accendi lo scanner successivo e ripeti la scansione della vista. Imposta le indicazioni per gli altri due scanner, assicurandoti di scegliere le cartelle corrette in cui salvare i dati.
È anche importante esaminare ogni scheda e assicurarsi che tutte le impostazioni dello scanner siano quelle desiderate. Il nostro laboratorio ha riscontrato che le seguenti impostazioni funzionano meglio per il tipo di raccolta di immagini che si sta eseguendo. Tuttavia, diversi tipi di raccolta di immagini potrebbero richiedere altre impostazioni.
Dopo aver selezionato tutte le impostazioni, scegli la scheda di input e imposta la casella a discesa di ripetizione automatica su continua su tutti e tre gli scanner. Posizionare le lastre preparate negli scanner con le piantine orientate orizzontalmente e posizionare temporaneamente il lato in feltro dello sfondo contro le piastre per garantire la stabilità nello scanner. Se si esegue questo protocollo con un partner, una persona gira le piastre di 90 gradi e immediatamente lo sfondo percepito, l'altra persona preme il pulsante di scansione ed entrambe fissano lo sfondo allo scanner con una corda elastica.
Ripete questo processo per gli scanner due e tre. Ogni immagine dovrebbe richiedere circa due o tre minuti per essere scansionata completamente. Le immagini finali appariranno come mostrato. È una buona idea controllare le cartelle in cui vengono salvate le immagini per assicurarsi che tutte vengano salvate correttamente.
È ideale per mantenere gli scanner in un'area priva di disturbi per la scansione del tempo designata. È inoltre prudente considerare le condizioni ambientali nell'area di scansione per garantire risposte fenotipiche ideali. Le immagini seguenti sono esempi di quelle raccolte utilizzando il metodo descritto in questo video.
I pannelli A e B e C e D sono la prima e l'ultima immagine di un singolo periodo di scansione. A e B mostrano l'intera area scansionata. Mentre C e D sono una regione ritagliata dell'area scansionata che mostra una singola lastra, si possono osservare diverse incongruenze.
La figura A mostra la variazione nella germinazione e nella traiettoria di crescita. L'immagine B mostra che le lastre possono accumulare condensa, mentre le immagini C e D sono considerate buoni risultati grazie alla robusta crescita delle piantine e alla qualità dell'immagine durante la corsa. La procedura descritta in questo documento si inserisce nella sua nicchia nel mondo dell'imaging radicolare in quanto è ad alta produttività e alta risoluzione, pur essendo relativamente conveniente.
Un ulteriore vantaggio di questo approccio è che può essere facilmente personalizzato per soddisfare le esigenze di imaging di un particolare gruppo di ricerca. Il metodo è stato anche personalizzato per l'imaging di altri.
Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per acquisire immagini ad alta risoluzione di piantine di Arabidopsis in risposta alla gravità, utilizzando scanner a piastra. L'approccio è economico e consente la raccolta di un elevato numero di immagini, adatte per ulteriori analisi.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Biologia vegetale
- Analisi delle immagini
- Risposta tropica della radice
Sfondo
- Arabidopsis funge da organismo modello nella ricerca vegetale.
- Comprendere le risposte delle radici alla gravità è fondamentale per lo studio dello sviluppo vegetale.
- Le tecniche di imaging ad alta risoluzione migliorano la raccolta di dati per l'analisi fenotipica.
- Gli scanner a piastra piatta offrono una soluzione economica per l'imaging ad alto rendimento.
Scopo dello studio
- Dimostrare un metodo basato su scanner per acquisire le risposte tropiche delle radici.
- Facilitare la raccolta di immagini per analisi successive.
- Fornire un protocollo di acquisizione immagini personalizzabile per gruppi di ricerca.
Metodi Utilizzati
- I semi vengono germinati su un supporto trasparente in piastre di Petri.
- Le piastre vengono scansionate utilizzando scanner piatti orientati verticalmente.
- È possibile collegare più scanner a un singolo computer per maggiore efficienza.
- Le impostazioni di acquisizione delle immagini vengono regolate per ottenere risultati ottimali.
Risultati principali
- Le immagini acquisite mostrano variazioni nelle traiettorie di germinazione e crescita.
- Sono stati osservati problemi di condensa sulle piastre, che hanno compromesso la qualità delle immagini.
- Sono state ottenute immagini di alta qualità, che dimostrano una crescita vigorosa delle piantine.
- Il metodo consente un'acquisizione di immagini ad alto rendimento e personalizzabile.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un mezzo efficace per l'analisi delle risposte radicolari.
- È adattabile a diverse esigenze di imaging all'interno di contesti di ricerca.
- L'approccio bilancia costo ed efficienza nella raccolta dei dati.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'imaging fenotipico ad alta risoluzione della risposta gravitropica delle radici consente una riduzione meccanicistica dei rischi nella validazione precoce delle proteine bersaglio per la scoperta di terapie a base vegetale. Questo approccio di imaging economico e ad alto rendimento supporta una previsione affidabile negli studi sulla funzione genica generando dati quantitativi e temporizzati adatti a flussi analitici di imaging successivi. Il metodo affronta le sfide relative alla scalabilità in biologia della scoperta mantenendo l'integrità dei dati per una continuità traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la misurazione quantitativa delle traiettorie di crescita delle radici come lettura fenotipica della funzione genica.
- Valore operativo: Offre una riduzione del rischio biologico grazie all'acquisizione ad alto rendimento di 216 risposte individuali al giorno con risoluzione di 4.800 dpi.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio generando un'ampia quantità di dati immagine di qualità per applicazioni di analisi delle immagini che chiariscono le variazioni nelle traiettorie di crescita.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati (piantine di Arabidopsis su supporto trasparente) per flussi di lavoro standardizzati e riproducibili di screening di composti o genetici.
- Valore operativo: Garantisce la prontezza del saggio mediante acquisizione automatica di immagini a intervalli di tempo regolari, ogni pochi minuti, utilizzando scanner piatti economici.
- Valore di scalabilità: Permette il riutilizzo della piattaforma e l'adattamento tra diversi gruppi grazie alla progettazione personalizzabile del protocollo e alla connessione di più scanner a un singolo computer.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore traslazionale: Mantiene la continuità del sistema rilevante per la patologia dalla scoperta attraverso la quantificazione fenotipica della risposta tropica radicale, un meccanismo conservato negli organismi modello.
- De-risking meccanicistico: Riduce l'ambiguità nella validazione dell'obiettivo isolando la variabile indipendente (spostamento del vettore gravitazionale) e misurando la variabile dipendente (crescita correttiva) con elevata risoluzione temporale.
- Conferma predittiva: Supporta decisioni di avanzamento ponderate sul rischio fornendo output quantitativi che permettono l'analisi statistica delle variazioni nella germinazione e nella traiettoria di crescita.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso di scoperta, dall'analisi delle ipotesi fino all'identificazione dei composti promettenti, fornendo dati fenotipici quantitativi standardizzati che guidano le decisioni di avanzamento o interruzione nelle fasi iniziali della validazione del bersaglio.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante l'osservazione della crescita correttiva nelle radici di piantine spostate dall'allineamento con il vettore gravitazionale.
- Screening: Garantisce standardizzazione e riproducibilità del saggio grazie a una preparazione controllata delle piastre (prevenzione della condensa mediante Triton X-100 e nastro microporoso) e protocolli uniformi per il salvataggio delle immagini.
- Analisi: Produce set di dati di immagini sequenziali con risoluzione fino a 4.800 dpi, adatti a misurazioni quantitative delle traiettorie di crescita e della coerenza nella germinazione.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica fornendo letture fenotipiche rilevanti per le malattie in un sistema modello suscettibile a perturbazioni genetiche e farmacologiche.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità di imaging riutilizzabile piuttosto che come tecnica monouso, grazie al basso costo, all'elevata produttività e alla facilità di personalizzazione tra diversi gruppi di ricerca.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Maggiore affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi grazie alla riduzione dell'ambiguità meccanicistica nella fenotipizzazione della risposta gravitropica.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità ottenute mediante protocolli di scansione automatizzati e denominazione delle cartelle guidata dai metadati per l'organizzazione dei dati.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci su prosegui/non prosegui, maggiore efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate grazie alla riduzione precoce del rischio fenotipico mediante imaging ad alto volume e ad alta risoluzione.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per rischio rese possibili da un'ampia disponibilità di dati immagine di qualità a supporto delle applicazioni di analisi delle immagini.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze scientifiche richieste in biologia vegetale e protocolli di acquisizione delle immagini per l'analisi delle radici di Arabidopsis.
- Le attrezzature necessarie includono scanner a piastra verticale in grado di raggiungere una risoluzione di 4.800 dpi e collegabili a un singolo computer per il funzionamento multiplo degli scanner.
- La standardizzazione tra gruppi di lavoro richiede una preparazione uniforme delle piastre (controllo della condensa mediante Triton X-100 e nastro microporoso) e la denominazione delle cartelle basata su metadati per un salvataggio dati riproducibile.
- Le considerazioni per l'adattamento a diversi sistemi modello includono la regolazione dell'orientamento dello scanner e della preparazione delle piastre in base alle dimensioni diverse delle piantine e alle condizioni di crescita.
- I limiti pratici comprendono la gestione della condensa sulle piastre e il mantenimento di un orientamento stabile delle piantine durante la rotazione di 90 gradi per l'induzione della risposta gravitropica.
