Perfusione retrograda e riempimento del sistema vascolare coronarico mouse come preparazione per la Micro Computed Tomography Imaging

L'obiettivo generale di questa procedura è riempire il sistema vascolare coronarico con un colorante radiopaco in preparazione per la micro tomografia computerizzata o la micro TC. Innanzitutto, la cavità addominale del topo viene aperta e l'aorta addominale viene incannulata. Quindi il sistema vascolare viene perfuso con un tampone vasodilatatore, seguito da perfusione con fissativo AFF.

I recipienti vengono quindi legati sia per dirigere l'otto PERFUSE, sia per bloccare potenziali punti di perdita. Infine, le coronarie vengono riempite con colorante radiopaco. Il riempimento completo della vascolarizzazione coronarica può essere valutato mediante analisi visiva del cuore o tramite imaging e analisi micro CT.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla vascolarizzazione coronarica, sui modelli di ramificazione, nonché sui blocchi dei vasi e su altre malattie dei vasi coronarici. Può anche essere applicato ad altre reti vascolari in altri sistemi di organi come il cervello, i reni o gli arti posteriori. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di legatura dei vasi sono difficili da imparare.

Se non si ha familiarità con l'anatomia dei vasi, anche trovare e legare i vasi corretti nel tessuto circostante può essere difficile. Prima di iniziare la procedura, riempire un lato di un apparecchio di perfusione a pressione con un tampone vasodilatatore e l'altro con aldeide paraforme al 4% in PBS. Quindi, riempi una siringa da insulina da mezzo CC con un ago da mezzo pollice calibro 29 con 0,1 millilitri da uno a 100 eparina.

Quindi piegare l'ago a un angolo di circa 120 gradi con lo smusso rivolto verso l'alto. Infine, riempire una siringa da un millilitro con un ago da mezzo pollice calibro 26 con 0,4 millilitri di soluzione satura di cloruro di potassio, quindi piegare l'ago a 120 gradi come appena dimostrato. Dopo aver anestetizzato il topo e appuntato il lato ventrale dell'animale al vassoio di dissezione, spruzzare l'animale con etanolo fino a quando il pelo non è bagnato.

Quindi aprire la cavità addominale con un'incisione sulla linea mediana. Ritrarre la pelle per esporre gli organi e spostare l'intestino da un lato in modo che la vena posteriore CVA o PVC sia accessibile. Pulire il grasso o il tessuto connettivo, se necessario, e iniettare la soluzione di eparina preparata nel PVC.

Mentre estrai l'ago. Coprire il foro dell'ago con un applicatore con punta di cotone per evitare perdite e tenere l'applicatore in posizione per alcuni secondi fino a quando la parete in PVC non si coagula e si sigilla. Dopo aver atteso due o tre minuti affinché l'eparina si disperda in tutta la circolazione del topo, sezionare il diaframma e la gabbia toracica in modo che il battito forte possa essere visualizzato.

Quindi iniettare lentamente la soluzione di cloruro di potassio preparata nel PVC fino a quando il cuore non si arresta. Quindi, tagliare il PVC vicino al livello del diaframma in modo che la porzione prossimale al cuore sia facile da individuare nei passaggi successivi. Quindi rimuovere tutti gli organi sotto il diaframma e asportare la parte posteriore del topo.

Ora individua l'estremità tagliata dell'aorta e posiziona una lunga sutura di seta intrecciata a sei trattini zero raddoppiata su se stessa sotto l'aorta, a pochi millimetri anteriormente all'estremità tagliata. Taglia questo lungo pezzo di sutura in modo che ce ne siano due sotto l'aorta. Infine, inserire il catetere nell'estremità tagliata dell'aorta e legare ciascuna sutura con un doppio nodo per tenere il catetere in posizione e per evitare che la contropressione all'interno dell'aorta fuoriesca.

Iniziare collegando l'apparecchio di perfusione a pressione al catetere. Quindi pompare l'apparato di perfusione a una pressione di guida da 100 a 110 millimetri di mercurio per perfondere i vasi con tampone vasodilatatore. Assicurarsi che il tampone perfondi attraverso le coronarie confermando che il liquido stia uscendo dal PVC in attesa che il liquido scorra limpido.

Seziona le costole e appunta la gabbia toracica per esporre il cuore. Una volta esposto, spremere il tampone sul cuore da un pezzo di garza imbevuto di tampone per evitare che si secchi. Eliminare il timo.

Esporre l'arco aortico La legatura dei vasi è l'aspetto più difficile di questa procedura. Localizzare i vasi attaccati all'arco aortico può essere molto frustrante per il principiante, ma una volta compresa l'anatomia dei vasi, si impara a fidarsi del fatto che i vasi siano lì anche se non possono essere visti chiaramente attraverso il grasso e altro tessuto connettivo. Posizionare i punti di sutura richiede pazienza e una mano ferma, ma è un'abilità che diventa più facile con la pratica.

Quindi utilizzando sei dash zero treccia di sutura di seta, i tre principali rami aortici per garantire che il fluido venga deviato attraverso le coronarie piuttosto che attraverso questi vasi più grandi a bassa resistenza. Quindi, perfondere il cuore con il fissativo per 15 minuti. Quindi risciacquare con tampone di vasodilatazione per almeno due minuti.

Nel frattempo, per evitare che il microriempimento fuoriesca dal cuore dopo l'iniezione, legare la prima vena cava anteriore e poi legare la seconda vena cva anteriore. Posizionare i punti di sutura attorno al PVC e all'aorta, ma non stringerle fino a dopo il riempimento. Dopo aver preparato il microfill e averlo caricato in una siringa da un millilitro, riempire il vassoio di dissezione con acqua F per coprire il catetere.

A questo punto, scollegare l'apparecchio di perfusione dal catetere e collegare la siringa di microriempimento. Iniettare il microfill nell'aorta. Prima riempirà le arterie, poi si riverserà nei capillari provocando il lavaggio del tessuto con il colore del microriempimento.

Si noti come la natura idrofobica del microfill lo faccia apparire inizialmente come sfere indipendenti quando emerge dai vasi più piccoli. Il riempimento completo è evidente quando il microriempimento è continuo all'interno dei recipienti e fuoriesce attraverso il PVC. Al termine del riempimento, stringere rapidamente le suture attorno al PVC e all'aorta per evitare che la natura elastica del tessuto cardiaco spremi il microriempimento dai vasi.

Evitare qualsiasi pressione esterna sul cuore durante il processo di polimerizzazione, come sollevare o girare il cuore nel tentativo di ottenere una visione anticipata dei vasi riempiti nella parte posteriore del cuore. Quindi immergere una garza nell'acqua del vassoio di dissezione e coprire il cuore con la garza per evitare che si secchi. Lascia riposare il cuore per circa un'ora a temperatura ambiente fino a quando il microfill non si sarà polimerizzato.

Infine, rimuovi il cuore e fissalo al 4% di PFA durante la notte a quattro gradi Celsius. Quindi sposta il cuore in etanolo al 70% e conservalo a quattro gradi Celsius. I recipienti che vengono efficacemente perfusi dal microfill avranno un microfill continuo e ininterrotto in tutti i recipienti.

Come dimostrato in questa prima figura, l'entità del riempimento dei vasi coronarici può essere giudicata a occhio. Le vene sono localizzate epicamente e sono facilmente osservabili come indicato dalla punta della freccia. Le arterie che sono più intra miocardiche sono visibili anche attraverso la superficie del cuore e sono indicate qui dalla freccia.

È evidente anche il riempimento capillare. Osserva un'area densa capillare del cuore in questa figura come indicato dalla stella. Occasionalmente, le ostruzioni possono impedire il riempimento di una parte del letto vascolare.

Pertanto, tutte le reti vascolari che non riescono a riempirsi saranno evidenti a causa della mancanza di microriempimento come indicato qui con una freccia. Possono verificarsi ulteriori interruzioni nel microriempimento, esempi dei quali sono contrassegnati da un asterisco. Un riempimento incompleto può verificarsi anche se viene utilizzata una pressione insufficiente durante la somministrazione del microfill, poiché il microfill non verrà forzato in tutte le reti capillari.

Si noti come il tessuto non abbia assunto il colore giallo del microfill indicando che il microfill non è penetrato nei capillari. Al contrario, una pressione eccessiva può causare lo scoppio dei capillari e lo stravaso del microriempimento nel tessuto circostante, come evidenziato dalla freccia. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di non iniettare il microfill troppo velocemente o con troppa pressione poiché i vasi scoppieranno e rovineranno il calco vascolare.

Seguire la procedura in micro CT. Altri metodi, come l'analisi immunoistochimica, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande e per caratterizzare meglio i vasi e il tessuto circostante.