Formazione di epitelio prostatico umano utilizzando tessuti ricombinazione dei roditori urogenitale Mesenchima Sinus e cellule staminali umane

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare l'urogenito dei roditori, il mesenchima sinusale o l'UGSM da embrioni di roditori e impiantare miscele di tessuti nella capsula renale che può formare l'epitelio prostatico umano. Ciò si ottiene isolando prima il seno urogenitale da embrioni di topo o ratto. Successivamente, il mesenchima del seno urogenitale viene separato dall'epitelio.

Quindi le sospensioni di singole cellule di mesenchima del seno urogenitale vengono combinate con cellule staminali pluripotenti. Infine, la miscela di cellule viene impiantata sotto la capsula renale di un topo ospite. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano la formazione dell'epitelio prostatico umano sul rene del topo attraverso la convalida dell'espressione specifica del PSA umano.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla funzione della prostata e sull'inizio della malattia, può essere applicato anche ad altri sistemi come lo xenotrapianto di tumori prostatici umani e l'induzione di linee cellulari tumorogeniche settimanali per formare tumori. Dopo l'eutanasia di un topo o di un ratto gravido e aver isolato gli embrioni, separarli dal sacco amniotico, tagliare il cordone ombelicale e trasferirli in un tubo da 50 millilitri contenente matasse ghiacciate. Bilanciare la soluzione salina e conservare in ghiaccio.

Metti un embrione in una capsula di Petri da 100 millimetri e usa le forbici per dividerlo in due a livello del bolo. Rimuovere lo stomaco e l'intestino tenue e quindi localizzare le ovaie nell'embrione femminile, che si trovano ai poli delle coccole dei reni o il testicolo nel maschio situato a livello della vescica. Sotto un cannocchiale di dissezione.

Usa le forbici Venice per tagliare la parete addominale per esporre la vescica e la parete posteriore dell'addome. Libera il tratto genitale superiore dagli attacchi e libera il cordone ombelicale. Tagliare l'osso pubico e con una pinza a punta fine dumont.

Senza mezzi termini, separarlo dalla parete anteriore del seno urogenitale. Separare la parete posteriore del seno urogenitale dal retto e tagliare il seno urogenitale con la vescica all'estremità inferiore. Quindi separare la vescica dal seno urogenitale.

Conservare il seno urogenitale e il blocco in HBSS ghiacciato. Trasferire il seno urogenitale in una provetta da 50 millilitri contenente l'1% di tripsina in HBSS senza calcio e magnesio e incubare a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere la tripsina e aggiungere il 10% di FBS e DM A MF 12 per neutralizzare la digestione.

Quindi, usa un ago o una pinza a punta sottile per stuzzicare con cura il manicotto mesenchimale appiccicoso dal tubo epiteliale. Mantenere intatto il tubo epiteliale riduce le possibilità di contaminazione delle cellule epiteliali del mesenchima. Ciò può provocare la formazione di ghiandole di roditori insieme all'epitelio ghiandolare umano derivato dalle cellule staminali.

Trasferire l'UGSM in una nuova provetta da 50 millilitri contenente il terreno DMM F 12 contenente il 10% di FBS, l'1% di streptococco pen, l'1% di aminoacidi non essenziali e un nanomolare. R 1 8 81 Incubare la provetta a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2 per una notte. Il giorno successivo centrifugare il fazzoletto a 200 G.Scartare il surnatante e utilizzare PBS per lavare il pellet.

Dopo aver rimosso il PBS, risospendere il tessuto in 0,2% di collagenasi in D-M-A-M-F 12 e incubare a 37 gradi Celsius con un leggero dondolio per un'ora, agitare vigorosamente il tessuto digestivo tre volte fino a quando non diventa una miscela omogenea di singole cellule e neutralizzare la collagenasi aggiungendo D-M-A-M-F 12 terreno con il 10% di FBS, 1% di streptococco in penna, 1% di aminoacidi non essenziali e un nanomolare R 1, 8, 81. Lavare le celle tre volte pellettandole a 200 G e Resus sospendendole in HBSS. Infine, sospendi le cellule mesenchimali in DMM F 12 e usa un emocitometro per contarle per effettuare il trapianto.

Dopo aver preparato un'area chirurgica sterile e aver anestetizzato un topo nudo atimico maschio con un'iniezione IP di ketamina xilazina, secondo il protocollo di testo, eseguire un pizzicamento del dito del piede per confermare il livello di sedazione preparare chirurgicamente il topo radendo il sito chirurgico se necessario e detergendolo con tre salviette alternate di alcol al 70% seguite dalla soluzione di Betadine. Dopo aver applicato l'unguento per gli occhi, praticare un'incisione longitudinale di un centimetro sulla schiena e continuare a tagliare la parete addominale con un'incisione longitudinale di 0,5 centimetri. Spremere delicatamente il rene dall'addome e utilizzare gocce di soluzione fisiologica sterile per mantenerlo umido.

Successivamente, utilizzando un ago per siringa calibro 27, perforare delicatamente la capsula renale per creare un sito di iniezione per la miscela cellulare. Quindi riempire un ago per siringa calibro 28 con 10 microlitri di miscela cellulare e inserirlo lentamente nel sito di puntura, penetrando nel parenchima renale. Per raggiungere un'area sotto la capsula renale.

Iniettare 10 microlitri della miscela cellulare per formare un bolo sul rene sotto la capsula renale e ritirare l'ago. Riposizionare il rene nella cavità addominale e fissare lo strato muscolare del peritoneo con quattro punti di sutura in nylon. Chiudere la pelle con punti di sutura o graffette e utilizzare soluzione fisiologica sterile per pulire il sangue dalla pelle.

Qui è mostrata un'immagine ecografica di uno xenotrapianto in crescita otto settimane dopo l'impianto. L'area cerchiata rappresenta lo xenotrapianto sulla superficie del rene. Queste immagini mostrano la crescita di xenotrapianti sulla superficie del rene.

Dopo 12 settimane, le cellule ES umane impiantate in assenza di seno urogenitale, mesenchima formeranno un grande teratomi, mentre il mesenchima del seno urogenitale impiantato da solo non riuscirà a formare alcuna struttura distinguibile. Mostrato al centro. I pannelli di questa figura sono colorazioni immunoistochimiche rappresentative dell'epitelio prostatico umano derivato da cellule staminali rispetto al tessuto prostatico umano adulto.

Come mostrato qui a sinistra, le ghiandole contengono uno strato epiteliale luminale AR positivo. Questo è anche PSA positivo, uno strato di cellule epiteliali basali P 63 positivo e una rara cromogranina. A cellule neuroendocrine, le ghiandole non sono cancro come dimostrato dalla colorazione negativa A-M-A-C-R dopo castrazione dell'ospite.

Le cellule luminali AR PSA positive non sono più presenti, dimostrando una caratteristica dipendenza dagli androgeni. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di prestare molta attenzione nel separare il mesenchima del seno urogenitale dall'epitelio. Poiché la contaminazione dell'epitelio del seno urogenitale formerà ghiandole e potenzialmente confonderà i risultati.