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Regolazione della temperatura in laboratorio: conservazione dei campioni utilizzando il freddo

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Regulating Temperature in the Lab: Preserving Samples Using Cold

1.13: Introduction to Light Microscopy

1.15: Regulating Temperature in the Lab: Applying Heat

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08:07 min

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April 30, 2023

Overview

La conservazione di campioni di laboratorio, campioni e reagenti utilizzando il freddo estremo viene eseguita di routine nei laboratori di ricerca biomedica. Questo video discuterà alcuni dei metodi per mantenere freddi i campioni di laboratorio e spiegherà il metodo di raffreddamento corretto da utilizzare per ogni requisito sperimentale.

Ad esempio, gli agenti di raffreddamento, come il ghiaccio e il ghiaccio secco, vengono in genere utilizzati quando si mantengono i campioni freddi durante gli esperimenti. Questo video discute le proprietà fisiche degli agenti di raffreddamento più comunemente usati, nonché le precauzioni di sicurezza per lavorare con loro.

Quando si tratta di mantenere i campioni freddi tra un esperimento e l’altro, è possibile utilizzare apparecchiature di raffreddamento, inclusi frigoriferi e congelatori di laboratorio, per conservare i campioni per un lungo periodo di tempo. In questo video sono discussi anche i tipi di campioni e reagenti che possono essere conservati nelle apparecchiature di raffreddamento del laboratorio comunemente disponibili.

Infine, il concetto di crioconservazione viene introdotto come un processo attraverso il quale tessuti, cellule e biomolecole vengono raffreddati a temperature sotto lo zero, fermando così efficacemente tutta l’attività biologica che degrada il campione. Vengono discussi diversi metodi di crioconservazione che riducono al minimo o eliminano la formazione di cristalli di ghiaccio dannosi.

Procedure

La conservazione di campioni di laboratorio, campioni e reagenti è un requisito dei laboratori di ricerca di tutto il mondo. Un modo efficace per preservare l’integrità e la vitalità dei campioni nel tempo consiste nel mantenerli a basse temperature.

Sia che tu stia lavorando con un campione al banco o conservando un campione alla fine di un esperimento, è possibile utilizzare diversi metodi di raffreddamento. Questo video dimostrerà i tipi di agenti di raffreddamento e strumenti che si trovano tipicamente in laboratorio e ti aiuterà a capire quali tipi di campioni sono conservati a quali temperature.

La scelta dell’agente di raffreddamento dipende dalla natura della procedura sperimentale eseguita.

Il ghiaccio convenzionale è la scelta logica per preservare i campioni a breve termine. Probabilmente sai che il ghiaccio è acqua ghiacciata, che ha un punto di fusione di 0 ° C alla normale pressione atmosferica, come puoi vedere in questo diagramma di fase. Potresti non sapere che a volte viene definito “ghiaccio bagnato”, perché diventa liquido mentre si riscalda a temperatura ambiente.

“Wet Ice” è ideale per mantenere freddi campioni e reagenti durante il lavoro o il trasporto.

Mentre “ghiaccio bagnato” è H2O solido, “ghiaccio secco” è la forma solida di anidride carbonica, che ha un punto di fusione di -78,5 °C. Il ghiaccio secco non si scioglie in liquido a pressione atmosferica ma si trasforma direttamente in gas di anidride carbonica, attraverso un processo chiamato sublimazione. La sublimazione si riferisce a uno spostamento nella fase della materia dal solido direttamente al gas e si verifica al di sotto del punto triplo in un diagramma di fase.

Utilizzare ghiaccio secco, quando si lavora con campioni biologici come cellule o tessuti batterici o di mammiferi congelati, che sono generalmente conservati a temperature ben al di sotto di 0 ° C.

Il ghiaccio secco è anche vantaggioso in quanto non lascia residui al cambio di stato, il che lo rende ideale per costruire un bagno di congelamento versando liquido su ghiaccio secco.

L’azoto liquido è un gas di azoto condensato ed è. comunemente scritto come “LN2”. A pressione atmosferica l’azoto liquido bolle, o passa da liquido a gas, a -196 °C, che si può vedere dal suo diagramma di fase.

Quando è necessario conservare campioni biologici a temperature inferiori a quelle che la maggior parte dei congelatori da laboratorio può ottenere, viene utilizzato azoto liquido.

L’azoto liquido può essere conservato in un dewar, o pallone sottovuoto, con un coperchio a montaggio allentato o un grande serbatoio dewar dotato di una valvola di sfogo per prevenire l’accumulo di pressione all’interno del sistema.

Sebbene non tossici, il ghiaccio secco e l’azoto liquido sono materiali pericolosi e non devono essere maneggiati fino a quando non si è stati addestrati da un membro esperto del laboratorio.

A causa delle temperature estremamente basse dell’azoto liquido e del ghiaccio secco, gravi danni ai tessuti possono verificarsi a contatto con la pelle. Indossare sempre una protezione adeguata, compresi guanti criogenici e un camice da laboratorio. Utilizzare strumenti per manipolare i campioni per evitare il contatto con la pelle.

Inoltre, i contenitori ermetici non dovrebbero mai essere utilizzati per conservare ghiaccio secco o azoto liquido, poiché questi agenti di raffreddamento cambiano stato in gas. In condizioni eretiche, la pressione può aumentare portando a un’esplosione.

E ora per gli strumenti che mantengono freddi i campioni… I frigoriferi e i congelatori da laboratorio regolano la temperatura più strettamente di quelli che si trovano in casa per garantire una temperatura uniforme in tutta l’unità.

Sono generalmente dotati di sistemi di monitoraggio della temperatura e allarmi che si spendono in seguito a significativi smodi di temperatura.

Non conservare mai cibi o bevande in frigoriferi o congelatori da laboratorio, in quanto ciò potrebbe comportare la contaminazione con sostanze chimiche tossiche o batteri. Dovrai trovare un altro posto dove conservare il tuo pranzo.

I frigoriferi sono mantenuti a 4 ° C e generalmente utilizzati per la conservazione temporanea dei campioni, specialmente quando il congelamento può influire sull’integrità del campione.

Molti reagenti e soluzioni vengono conservati a 4 ° C per prolungarne la durata di conservazione, compresi i mezzi di coltura tissutale e le piastre di coltura cellulare versate, che vengono riscaldate prima dell’uso.

Le celle frigorifere sono ideali per lo stoccaggio di apparecchiature più grandi che dovrebbero funzionare a basse temperature, come le unità di cromatografia liquida.

I congelatori di laboratorio hanno una temperatura da -20 ° C a -196 ° C per i congelatori criogenici.

Per la conservazione di acidi nucleici e reagenti, come l’enzima di restrizione, -20 °C è la scelta appropriata. Al momento della rimozione dal congelatore, i campioni e i reagenti devono essere conservati sul ghiaccio.

I congelatori a -80°C e criogenici sono adatti per la conservazione di tessuti e cellule congelati per un lungo periodo di tempo dopo la crioconservazione in azoto liquido. Il ghiaccio secco viene generalmente utilizzato per trasportare campioni prelevati da congelatori a -80 °C.

La crioconservazione è un termine che si riferisce alla conservazione a lungo termine dei tessuti o persino delle cellule viventi. A temperature sotto lo zero tutta l’attività biologica, comprese le reazioni che degradano il campione, viene effettivamente interrotta.

Quando si congelano cellule e tessuti viventi, possono formarsi cristalli di ghiaccio, portando a disidratazione e danni cellulari, nonché all’accumulo di molecole di soluto a concentrazioni dannose.

Il congelamento a scatto o flash è il processo mediante il quale i campioni biologici vengono rapidamente immersi in azoto liquido o in una miscela di ghiaccio secco ed etanolo, in modo che grandi cristalli di ghiaccio non possano formarsi e danneggiare le cellule. I crioprotenzienti possono anche essere usati come additivo per ridurre la formazione di ghiaccio.

In alternativa al congelamento flash, le macchine possono essere utilizzate per controllare lentamente il processo di congelamento, necessario per crioconservare gli embrioni di pecora che vedete qui.

Recentemente, la vitrificazione è stata introdotta come metodo per crioconservare cellule e tessuti senza alcun danno dovuto ai cristalli di ghiaccio. Questo processo trasforma il liquido nel campione in un solido vetroso non cristallino attraverso un rapido raffreddamento in presenza di alcuni crioprotezioni.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE al raffreddamento di campioni e reagenti di laboratorio.

In questo video abbiamo esaminato diversi tipi di agenti e apparecchiature di raffreddamento ed esempi di quando utilizzare ciascun metodo di raffreddamento. Abbiamo anche introdotto diversi modi per crioconservare campioni biologici. Grazie per l’attenzione.

Transcript

Preservation of laboratory samples, specimens and reagents, is a requirement of research laboratories worldwide. An efficient way to preserve sample integrity and viability over time is by maintaining them at cold temperatures.

Whether you are working with a sample at the bench, or storing a sample at the end of an experiment, different methods of cooling can be used. This video will demonstrate the types of cooling agents and instruments typically found in the lab and will help you understand what types of samples are stored at which temperatures.

The choice of cooling agent is dependent on the nature of experimental procedure being performed.

Conventional ice is the logical choice for preserving samples over the short-term. You probably know that ice is frozen water, which has a melting point of 0 °C at normal atmospheric pressure as you can see in this phase diagram. You might not know that it is sometimes referred to as “wet ice”, because it becomes liquid as it warms at room temperature.

“Wet Ice’ is ideal for keeping samples and reagents cold while working with- or transporting them.

While “wet ice’ is solid H2O, “dry ice’ is the solid form of carbon dioxide, which has a melting point of -78.5 ˚C. Dry ice does not melt into liquid at atmospheric pressure but rather transforms directly into carbon dioxide gas, through a process called sublimation. Sublimation refers to a shift in the phase of matter from solid directly to gas and occurs below the triple point in a phase diagram.

Use dry ice, when you are working with biological specimens such as frozen bacterial or mammalian cells or tissue, which are generally stored at temperatures well below 0˚C.

Dry ice is also advantageous as it leaves no residue upon changing state, which makes it ideal for constructing a freezing bath by pouring liquid over dry ice.

Liquid nitrogen is condensed nitrogen gas and is. commonly written as “LN2”. At atmospheric pressure liquid nitrogen boils, or transitions from liquid to a gas, at -196 °C, which you can see by its phase diagram.

When you need to store biological specimens at temperatures below what most laboratory freezers can obtain, liquid nitrogen is used.

Liquid Nitrogen can be stored in a dewar, or vacuum flask, with a loose fitting lid or a large tank dewar equipped with a relief valve to prevent pressure build-up within the system.

Though non-toxic, dry ice and liquid nitrogen are dangerous materials and should not be handled until you have been trained by an experienced member of the lab.

Due to the extremely low temperatures of liquid nitrogen and dry ice, severe tissue damage can occur upon contact with skin. Always wear proper protection, including cryogenic gloves and a lab coat. Use tools to manipulate samples to avoid contact with skin.

Also, airtight containers should never be used to store either dry ice or liquid nitrogen, since these cooling agents change state into gas. Under airtight conditions, pressure can build leading to an explosion.

And now for the instruments that keep samples cold… Laboratory refrigerators and freezers regulate temperature more tightly than those found in the home to ensure a uniform temperature throughout the unit.

They are generally equipped with temperature monitoring systems and alarms that go off following significant temperature change.

Never store food or drink in lab fridges or freezers, as this could result in contamination with toxic chemicals or bacteria. You’ll have to find another place to store your lunch.

Refrigerators are maintained at 4°C and generally used for temporary storage of samples especially when freezing can affect sample integrity.

Many reagents and solutions are stored at 4°C to extend their shelf life, including tissue culture media and poured cell culture plates, which are warmed before use.

Cold rooms are ideal for storage of larger equipment that should operate at low temperatures, such as liquid chromatography units.

Laboratory grade freezers range in temperature from -20° C to -196 °C for cryogenic freezers.

For storage of nucleic acids and reagents, such as restriction enzyme, -20 °C is the appropriate choice. Upon removal from the freezer, samples and reagents should be kept on ice.

-80°C and cryogenic freezers are suitable for storage of frozen tissue and cells over an extended period of time following cryopreservation in liquid nitrogen. Dry ice is generally used to transport samples taken out of -80 ˚C freezers.

Cryopreservation is a term that refers to the long-term storage of tissues, or even living cells. At sub-zero temperatures all biological activity, including reactions that degrade the sample is effectively stopped.

When freezing living cells and tissue, ice crystals can form, leading to cell dehydration and damage, as well as accumulation of solute molecules to harmful concentrations.

Snap- or flash-freezing is the process by which biological samples are rapidly submerged in liquid nitrogen, or a mixture of dry ice and ethanol, so that large ice crystals cannot form and damage the cells. Cryoprotectants can also be used as an additive to reduce the formation of ice.

As an alternative to flash freezing, machines can be used to slowly control the freezing process, which is needed to cryopreserve the sheep embryos you see here.

Recently, vitrification has been in introduced as a method to cryopreserve cells and tissue without any damage due to ice crystals. This process transforms the liquid in the sample to a non-crystalline, glassy solid through rapid cooling in the presence of certain cryoprotectants.

You’ve just watched JoVE’s introduction to cooling laboratory specimens and reagents.

In this video we reviewed different types of cooling agents and equipment, and examples of when to use each cooling method. We also introduced several ways to cryopreserve biological specimens. Thanks for watching.