1.13: Introduzione alla microscopia ottica

Il microscopio ottico è uno strumento utilizzato per ingrandire i campioni di ricerca. I microscopi ottici sono uno strumento analitico inestimabile che ha il potenziale per consentire agli investigatori scientifici di visualizzare oggetti a 1000 volte le loro dimensioni originali. Come vedrete, il microscopio ottico funziona secondo alcuni principi molto basilari, ma ha applicazioni quasi illimitate per la visualizzazione dei campioni in laboratorio.

Come suggerisce il nome, il microscopio ottico richiede una sorgente luminosa, che produce luce che può essere focalizzata, da una lente a condensatore, sul campione.

La luce che illumina il campione raggiunge una lente nota come lente dell'obiettivo, che crea un'immagine ingrandita che viene invertita o capovolta. L'oculare, o lente oculare, ingrandisce ulteriormente l'immagine, che l'occhio poi riceve. È possibile introdurre elementi ottici aggiuntivi nel percorso della luce per raddrizzare l'immagine, in modo che l'occhio la veda con l'orientamento corretto. I microscopi che utilizzano più lenti come quella che vedi qui sono indicati come microscopi composti.

In un microscopio composto, l'ingrandimento totale viene calcolato moltiplicando l'ingrandimento della lente dell'obiettivo per l'ingrandimento della lente oculare o dell'oculare. Con un obiettivo 40X e una lente oculare 10X, l'ingrandimento totale è 400X.

Per aiutare a stimare le dimensioni degli oggetti al microscopio, è possibile utilizzare un reticolo oculare, una scala che viene proiettata sull'immagine. A un ingrandimento più elevato, i segni di spunta nel reticolo dell'oculare rappresenteranno distanze più piccole rispetto a quando si osservano a ingrandimenti inferiori.

Oltre all'ingrandimento, un altro aspetto dell'ottica del microscopio è la risoluzione. La risoluzione si riferisce alla distanza risolvibile più breve tra due oggetti sotto l'oscilloscopio. Man mano che le teste di questi personaggi diventano sempre più chiare e la risoluzione aumenta, la distanza osservabile più breve tra loro diminuisce.

I componenti principali del microscopio ottico includono gli obiettivi, gli oculari, il tavolino e il supporto del campione, la sorgente luminosa, il diaframma di campo, il condensatore e l'apertura e le manopole di messa a fuoco grossolana e fine.

Gli obiettivi sono responsabili della maggior parte dell'ingrandimento e della risoluzione del microscopio. Sono montati su un portaobiettivi rotante in modo tale che, al variare degli obiettivi, il piano focale rimanga lo stesso ? una proprietà denominata parafocalità. Un obiettivo può essere contrassegnato con l'ingrandimento, l'aperatura numerica o il N.A., il tipo di mezzo di immersione richiesto, lo spessore del vetrino coprioggetti che deve essere utilizzato durante il montaggio dei campioni e la distanza di lavoro, ovvero la distanza dalla punta dell'elemento della lente al piano focale nel campione.

L'apertura numerica, ancora una volta, definita come N.A., è una misura di quanto bene un obiettivo del microscopio può raccogliere la luce. Gli obiettivi ad alto N.A. consentono il passaggio della luce ad angoli obliqui, mentre gli obiettivi a basso N.A. richiedono una luce più diretta. La risoluzione di un obiettivo può essere calcolata dall'apertura numerica, data la lunghezza d'onda della luce.

La sorgente luminosa, il diaframma di campo, l'apertura e il condensatore sono tutti responsabili della produzione della luce e della sua consegna al campione.

La sorgente luminosa è in genere una lampadina alogena a bassa tensione che può essere regolata per controllare l'intensità della luce.

La luce passa quindi attraverso una varietà di filtri e nel diaframma di campo, che controlla l'area del campione da illuminare.

Il prossimo è il condensatore, che focalizza la luce brillante sul campione, il cono di illuminazione attorno al campione è controllato dal condensatore e deve essere regolato a seconda dell'obiettivo utilizzato.

Per iniziare a utilizzare il microscopio ottico, posizionare un campione contenente la regione di interesse sul tavolino del microscopio, centrarlo direttamente sull'obiettivo e fissarlo in posizione utilizzando le clip del tavolino.

Quindi, accendi la fonte di luce e passa all'obiettivo con la potenza più bassa.

Quindi, mettere a fuoco l'obiettivo a bassa potenza spostandolo nella direzione z utilizzando una regolazione iniziale della manopola di regolazione grossolana, quindi ruotando le manopole di regolazione fine per mettere a fuoco l'oggetto. Fare attenzione a non colpire il vetrino o il tavolino con l'obiettivo in quanto ciò potrebbe danneggiare l'obiettivo.

Quindi, individua l'area di interesse guardando attraverso gli oculari mentre regoli le manopole per spostare il carrello nelle direzioni x e y. La dimensione del campo visivo diminuirà drasticamente man mano che si passa da un ingrandimento basso a uno più alto.

Centrare l'obiettivo con la potenza più bassa sull'area di interesse prima di passare a una potenza più alta aumenta notevolmente le possibilità di trovare l'esemplare desiderato.

Una volta che il campione è stato posizionato a bassa potenza ed è a fuoco, passare all'obiettivo a potenza più alta che verrà utilizzato per l'acquisizione delle immagini.

Ottimizza la qualità dell'illuminazione regolando prima il diaframma di campo in modo che il diaframma stesso sia appena fuori dal campo visivo.

Quindi, regolare il diaframma del condensatore in modo che le impostazioni corrispondano all'apertura numerica dell'obiettivo in uso.

Infine, regola nuovamente la messa a fuoco. Questa volta solo utilizzando la manopola di regolazione fine.

Ora sei pronto per scattare immagini del tuo campione.

La microscopia ottica ha il potenziale per visualizzare un'ampia gamma di campioni ed esistono varie configurazioni del microscopio composto per adattarsi a molte applicazioni diverse.

Qui si vede un ricercatore che si prepara a lavorare al microscopio operatorio. Questi microscopi sono generalmente sospesi su un braccio mobile e sono stereoscopici, il che significa che consentono alla luce di passare all'osservatore e anche a una fotocamera montata sul microscopio. Questo microscopio operatorio viene utilizzato in una procedura di trapianto di rene, nei topi.

In questa clip, si vede un ricercatore che guarda attraverso un microscopio da dissezione, mentre sceglie le larve di drosophila perfette per un'ulteriore dissezione, al fine di esporre i muscoli della parete corporea in modo che la giunzione neuromuscolare possa essere studiata.

Qui si può vedere un microscopio composto invertito, che ha un obiettivo sotto il tavolino, mentre viene preparato per una tecnica di microiniezione. Questa procedura, nota come trasferimento nucleare di cellule somatiche, è un metodo importante per generare animali transgenici e creare cloni.

Hai appena visto JoVE? introduzione alla Microscopia Ottica.

In questo video abbiamo esaminato: cos'è un microscopio e come funziona, i suoi numerosi componenti, come apportare modifiche ad essi e come acquisire immagini di qualità. Grazie per l'attenzione!