Contemporaneamente Catturare immagini in tempo reale in due canali di emissione Utilizzando un Splitting sistema Dual Camera Emissione: Applications to Cell Adhesion

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire un saggio di adesione in una camera a flusso a piastre parallele utilizzando un sistema di suddivisione dell'emissione a doppia telecamera per registrare simultaneamente sequenze di immagini in tempo reale in due colori. A tal fine, le due telecamere dell'apparato di imaging vengono innanzitutto allineate. Successivamente, si preparano le cellule e il substrato reattivo e si allestisce la camera a flusso a piastre parallele.

Le impostazioni della fotocamera vengono quindi calibrate per l'acquisizione di immagini a due colori e vengono apportate eventuali correzioni digitali necessarie all'allineamento della fotocamera. Vengono quindi acquisite sequenze di immagini, che dimostrano l'acquisizione di immagini a doppio colore con elevata risoluzione temporale. Il vantaggio dei sistemi di suddivisione dell'emissione a doppia fotocamera rispetto ai sistemi a fotocamera singola è che è possibile assegnare tempi di esposizione diversi a ciascuna fotocamera e viene mantenuto l'intero campo visivo.

Questa tecnica può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'adesione cellulare, ad esempio in che modo la localizzazione delle molecole di adesione sulla superficie delle cellule possa influenzare processi biologici dinamici come la migrazione cellulare, l'infiammazione e la metastasi tumorale. La procedura seguente richiede un microscopio a fluorescenza episcopica invertito, dotato di una sorgente luminosa ad alta intensità collegata a un condotto luminoso, un cubetto filtro combinato e un sistema di camere con divisione dell'emissione a doppia camera.

Il sistema del microscopio deve essere collegato a un computer che esegue un software di acquisizione immagini in grado di raccogliere e combinare le immagini catturate da telecamere CCD monocromatiche. In questo caso, viene utilizzato il software StreamPix5 con il modulo SimulPix. Per iniziare, aprire StreamPix5 nella barra delle attività, quindi selezionare l'area di lavoro.

Quindi, all'estremità destra dello schermo, aprire il gestore dell'area di lavoro e selezionare una nuova area di lavoro. Dopo aver assegnato un nome alla telecamera, seguire le indicazioni del software per selezionare da un elenco precompilato un acquisitore compatibile con il modello della telecamera; nell'area di lavoro apparirà un piccolo'icona a forma di telecamera per indicare che il flusso video della telecamera è stato ricevuto. Gli oggetti acquisiti con il microscopio possono ora essere visualizzati sullo schermo.

Ripetere questo processo per l'area di lavoro della seconda telecamera, quindi per l'area di lavoro unita, ripetere nuovamente e tutte le telecamere saranno in uso. Apparirà un messaggio di errore. Questo messaggio è normale: le telecamere assegnate dall'area di lavoro uno e due all'area di lavoro unita nel pannello di aggancio situato sul lato destro dello schermo di visualizzazione.

Le immagini nell'area di lavoro uno e due verranno sovrapposte nell'area di lavoro unita come due immagini a colori falsati. L'aspetto più complesso di questa procedura è l'allineamento della fotocamera. Per garantire il successo, utilizziamo la diapositiva fornita dal produttore seguendo scrupolosamente le istruzioni del produttore.

Per allineare le telecamere nel sistema di suddivisione dell'emissione con doppia telecamera, inviare la luce in campo chiaro o in contrasto di fase all'oculare del microscopio. Posizionare la griglia di calibrazione rivestita di metallo fornita dal produttore sul portacampioni del microscopio e allineare la griglia rispetto al piano del portacampioni. Visualizzare la griglia senza binning e senza ridimensionamento automatico, metterla a fuoco, quindi spostare, senza rimuovere, l'alloggiamento del divisore dicromatico per allineare la telecamera uno.

Quindi, utilizzando la manopola di regolazione della messa a fuoco sulla porta seamount uno, mettere nuovamente a fuoco l'immagine. Successivamente, spingere completamente il supporto del dicotomico nel dispositivo di acquisizione a doppio canale in modo che l'immagine venga divisa dal dicotomico verso entrambe le telecamere. Allentare le viti di bloccaggio da 3 5 60 di pollice e ruotare la seconda telecamera sulla porta femmina CM due fino a quando l'orientamento della griglia risulti identico in entrambe le immagini; utilizzando la manopola di regolazione della messa a fuoco sulla porta C due, mettere a fuoco l'immagine proveniente dalla seconda telecamera.

Per completare l'allineamento, utilizzare la manopola RL sul lato destro del DC due per regolare le posizioni delle immagini combinate finché il sollevamento destro. Il confine verticale delle immagini è allineato con precisione nell'area di lavoro unita. Quindi, utilizzare la manopola UD per regolare l'allineamento verticale della seconda immagine finché le barre della griglia orizzontale non sono correttamente allineate.

Se durante l'allineamento verticale si verifica una leggera rotazione della telecamera, correggere il problema allentando le tre viti da un quarto di pollice 5-60 della telecamera due e ruotando fino a quando l'immagine visualizzata non risulta correttamente allineata. Preparare le cellule tumorali del seno BET 20 per il saggio di adesione in camera a piastre parallele colorandole con anti-CD 24 e TECA 4-5-2 utilizzando secondari LOR 5-68 e 4-88 come descritto nel documento allegato; assicurarsi di preparare i corrispondenti controlli monocromatici. Dopo la colorazione, distribuire le cellule nel serbatoio della camera a piastre parallele. Collegare due tratti separati di tubo rispettivamente ai porti di ingresso e di uscita della camera di flusso.

Un tubo sarà collegato al serbatoio contenente le cellule marcate sospese in DPBS più 0,1% PSA. Collegare l'altro tubo alla pompa per siringa, che aspirerà il liquido a una velocità di flusso specificata. Collegare una linea di vuoto alla camera di flusso e posizionare la camera di flusso sopra la piastra per colture cellulari da 35 millimetri contenente un monostrato di cellule di ovario di criceto cinese che esprimono lectina o cellule cho e.

Regolare la camera di flusso e la guarnizione della camera di flusso per garantire un sigillo a vuoto adeguato. Aspirare il fluido dal serbatoio, monitorando l'assemblaggio della camera di flusso per verificare il corretto sigillamento. Infine, posizionare l'assemblaggio della camera di flusso sul microscopio, accendere la sorgente luminosa e configurare il microscopio mediante ispezione manuale.

Assicurarsi che l'alloggiamento del divisore ottico sia nella corretta posizione operativa abbassata e non in modalità bypass. Passare manualmente alla modalità di fluorescenza e selezionare il cubo filtro per fluorescenza verde-rossa per determinare separatamente il tempo di esposizione e il guadagno. Acquisire le immagini delle cellule utilizzando la fluorescenza rossa sulla prima telecamera e la fluorescenza verde sulla seconda telecamera.

Premere manualmente il dicromatico secondo necessità per ottenere le immagini. Successivamente, depositare una sospensione di cellule BT 20 colorate esclusivamente con la flora rossa. Quattro anticorpi coniugati nel serbatoio collegato alla porta di ingresso della camera a piastra parallela.

Utilizzare la pompa per siringa per perfondere le cellule BT 20 sul monolayer di choi nella camera a flusso parallelo. Nelle impostazioni in tempo reale del software di imaging, regolare il tempo di esposizione della telecamera uno per ottenere un'immagine nel canale rosso. Impostare il tempo di esposizione della telecamera due uguale al tempo di esposizione della telecamera uno.

Se un'immagine viene osservata nel canale verde, sono presenti artefatti di sovraimpressione. In tal caso, mantenere il tempo di esposizione equivalente tra la telecamera uno e la telecamera due e ridurre il tempo di esposizione finché l'artefatto di sovraimpressione non risulta più visibile nel canale verde. Regolare il guadagno della telecamera uno per migliorare la visibilità dell'immagine nel canale rosso, se necessario.

Successivamente, rimuovere qualsiasi sospensione residua di cellule BT 20 dal serbatoio e sostituire la sospensione con DPBS. Utilizzare la pompa a siringa per perfondere la soluzione sul monolayer di choi fino a quando le cellule BT 20 non risultano più visibili sul monolayer. Riempiere nuovamente il serbatoio con la sospensione di cellule BT 20 marcate solo con l'anticorpo coniugato con il fluorocromo verde.

Ripetere il processo di calibrazione della telecamera utilizzando i controlli del colore singolo verde. Questa volta, impostare il tempo di esposizione con la telecamera due per acquisire immagini delle cellule nel canale verde senza artefatti di sovrapposizione nel canale rosso acquisito dalla telecamera uno. Utilizzare il software di acquisizione per visualizzare contemporaneamente le immagini catturate dalle due telecamere CCD monocromatiche nella camera di flusso.Esperimento.

Unire le immagini acquisite da entrambe le telecamere utilizzando il modulo simul pics di stream picks. Utilizzare le regolazioni di correzione digitale in simul pic o in un software alternativo per allineare spazialmente le immagini unite. Se necessario, le immagini possono essere corrette con il modulo simul PIC per aggiustamenti orizzontali, verticali e rotazionali.

Il sistema è ora pronto per essere utilizzato per acquisire contemporaneamente immagini a due colori. È stato utilizzato un saggio di adesione in camera a flusso con piastre parallele per dimostrare il sistema di suddivisione dell'emissione con doppia telecamera descritto in questo video. Come mostrato qui, il sistema ha rilevato cellule BT 20 marcate in modo fluorescente con anticorpo anti-umano CD 24 mostrato in rosso e con HECA 4 52, che si lega a molecole correlate a SCOs mostrate in verde.

Alcune cellule rotolanti mostravano segnali rossi ma non verdi. Altre mostravano segnali verdi ma non rossi, mentre altre ancora mostravano sia segnali rossi che verdi. Qui, le telecamere hanno mantenuto la risoluzione ottica e temporale necessaria per tracciare le caratteristiche cellulari durante il movimento rotatorio e il ribaltamento delle cellule mentre rotolavano sul substrato reattivo nella direzione del flusso; i canali di emissione fusi hanno rivelato la distribuzione e la codistribuzione (colocalizzazione) delle molecole CD24 e sialil-LewisX sulla superficie delle cellule BT20 in rotolamento e adesione a monocapati di CHOe.

Queste immagini mostrano un ingrandimento di una singola cellula BT 20 in cui le molecole CD 24 e sated co-localizzano e appaiono come punti gialli fino a arancioni quando i canali di emissione pseudocolorati in rosso e verde vengono sovrapposti. Nel complesso, queste informazioni dimostrano che il sistema di suddivisione dell'emissione con doppia telecamera possiede la risoluzione spaziale, temporale e ottica necessaria per rivelare caratteristiche cellulari e molecolari in applicazioni come i saggi di adesione in camera a flusso, in cui le cellule si muovono rapidamente attraverso il campo visivo.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come configurare e calibrare un sistema a doppia telecamera con divisione dell'emissione o eseguire in tempo reale un saggio di adesione in una camera a flusso con piastre parallele con imaging a due colori. Questo metodo può essere applicato ad altri saggi in vitro che utilizzano la fluorescenza per studiare il comportamento cellulare.