Contemporaneamente Catturare immagini in tempo reale in due canali di emissione Utilizzando un Splitting sistema Dual Camera Emissione: Applications to Cell Adhesion

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire un saggio di adesione in camera di flusso su piastra parallela utilizzando un sistema di divisione dell'emissione a doppia telecamera per registrare simultaneamente sequenze di immagini in tempo reale in due colori. A tale scopo, le due telecamere nella configurazione di imaging vengono prima allineate. Successivamente, vengono preparate le celle e il substrato reattivo e viene allestita la camera di flusso a piastre parallele.

Le impostazioni della fotocamera vengono quindi calibrate per l'acquisizione di immagini a due colori e vengono apportate tutte le correzioni digitali necessarie all'allineamento della fotocamera. Vengono quindi acquisite sequenze di immagini che dimostrano l'acquisizione di immagini a due colori con un'elevata risoluzione temporale. Il vantaggio dei sistemi di suddivisione dell'emissione a doppia telecamera rispetto ai sistemi a telecamera singola è che è possibile assegnare tempi di esposizione diversi a ciascuna telecamera e mantenere l'intero campo visivo.

Questa tecnica può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'adesione cellulare, come ad esempio il modo in cui la localizzazione delle molecole di adesione sulla superficie delle cellule può influenzare i processi biologici dinamici come la migrazione cellulare, l'infiammazione e le metastasi del cancro. La seguente procedura richiede un microscopio a epifluorescenza invertito. Questo dovrebbe essere dotato di una sorgente luminosa ad alta intensità accoppiata a una guida di luce, un cubo di filtri combinati e un sistema di telecamere a doppia telecamera per la suddivisione delle emissioni.

La configurazione del microscopio deve essere collegata a un computer che esegue un software di imaging in grado di raccogliere e combinare le immagini acquisite da telecamere CCD monocromatiche. Qui, il software multi-camera stream picks five viene utilizzato con il modulo simul picks. Inizia aprendo le selezioni del flusso cinque nella barra multifunzione delle attività, seleziona l'area di lavoro.

Quindi, all'estrema destra dello schermo, apri Gestione area di lavoro e seleziona Nuova area di lavoro. Dopo aver assegnato un nome alla telecamera, seguire le istruzioni del software per selezionare da un elenco precompilato, un grabber corrispondente al modello della telecamera, una piccola icona della telecamera apparirà nell'area di lavoro per indicare che il feed della telecamera è stato ricevuto. Gli oggetti ripresi con il microscopio possono ora essere visualizzati sullo schermo.

Ripetere questo processo per la seconda area di lavoro della telecamera, quindi per l'area di lavoro unita, ripetere l'operazione ancora una volta e tutte le telecamere sono in uso. Apparirà un messaggio di errore. Questo messaggio è normalmente assegnato alle telecamere dall'area di lavoro uno e due all'area di lavoro unita nel pannello di aggancio situato sul lato destro dello schermo di visualizzazione.

Le immagini nell'area di lavoro uno e due verranno sovrapposte nell'area di lavoro unita come due immagini pseudo colorate. L'aspetto più difficile di questa procedura è l'allineamento della fotocamera. Per garantire il successo, utilizziamo la slitta del produttore seguendo meticolosamente le istruzioni del produttore.

Per allineare le telecamere nel sistema di divisione dell'emissione a doppia fotocamera, inviare una luce di campo chiaro o di contrasto di fase all'oculare del microscopio. Posizionare la griglia di calibrazione con rivestimento metallico fornita dal produttore sul tavolino del microscopio e squadrare la griglia sul tavolino del microscopio. Visualizza la griglia senza binning e senza ridimensionamento automatico e mettila a fuoco, quindi spostala, ma non rimuovere l'alloggiamento dicroico per allineare quello della fotocamera.

Quindi, utilizzando la ghiera di regolazione della messa a fuoco sulla porta sottomarina uno, mettere nuovamente a fuoco l'immagine. Quindi, spingere completamente l'alloggiamento dicroico nel dispositivo di acquisizione a doppio canale in modo che l'immagine venga divisa dal dicroico su entrambe le fotocamere. Allentare le viti di fermo da 3 5 60 quarti pollici e ruotare la seconda fotocamera sulla porta femmina dell'attacco CM due fino a quando l'orientamento della griglia è identico in entrambe le immagini utilizzando la manopola di regolazione della messa a fuoco sulla porta C mount due, mettere a fuoco l'immagine dalla fotocamera due.

Per finalizzare l'allineamento, utilizzare la manopola RL sul lato destro di DC two per regolare le posizioni combinate dell'immagine fino al giusto sollevamento. Il contorno verticale delle immagini è allineato con precisione nell'area di lavoro unita. Quindi utilizzare la manopola UD per regolare l'allineamento verso l'alto verso il basso della seconda immagine fino a quando le barre orizzontali della griglia non sono allineate correttamente.

Se durante l'allineamento verso l'alto verso il basso si verifica una leggera rotazione della telecamera, correggere il problema allentando le viti da 3 5 60 quarti di pollice per la telecamera due e ruotandole fino a quando l'immagine visualizzata non è allineata correttamente. Preparare le cellule di carcinoma mammario BET 20 per il test di adesione in camera di flusso a piastre parallele colorandole con anti CD 24 e TECA 4 5 2 utilizzando LOR 5 68 e 4 88 secondarie come descritto nel documento di accompagnamento, assicurarsi di preparare i controlli a colore singolo appropriati dopo la colorazione erogare le cellule nel serbatoio della camera di flusso a piastre parallele. Collegare due lunghezze separate di tubo alle porte di ingresso e uscita della camera di flusso.

Un tubo si collegherà al serbatoio contenente le cellule marcate sospese in DPBS più contenenti lo 0,1% di PSA. Collegare l'altro tubo alla pompa a siringa, che preleverà il fluido a una portata specificata. Collegare una linea del vuoto alla camera di flusso e posizionare la camera di flusso sopra la piastra di coltura tissutale da 35 millimetri contenente un monostrato di cellule ovariche di criceto cinese che esprimono lectina o cellule cho e.

Regolare la camera di flusso e la guarnizione della camera di flusso per garantire un'adeguata tenuta del vuoto. Prelevare il fluido dal serbatoio monitorando il gruppo della camera di flusso per verificarne la corretta tenuta. Infine, posizionare il gruppo della camera di flusso sull'alimentazione del microscopio sulla sorgente luminosa e sulla configurazione del microscopio mediante ispezione manuale.

Assicurarsi che la custodia dicroica si trovi nella corretta posizione di funzionamento premuta e non sia in modalità bypass. Passa manualmente alla modalità di fluorescenza e seleziona il cubo del filtro a fluorescenza verde rosso per determinare separatamente il tempo di esposizione e il guadagno. Immagini delle cellule utilizzando la fluorescenza rossa nella fotocamera uno e la fluorescenza verde nella fotocamera due.

Premere manualmente il dicroico secondo necessità per ottenere le immagini. Successivamente depositare una sospensione di cellule BT 20 colorate con solo flora rossa. Quattro anticorpi coniugati nel serbatoio sono collegati alla porta di ingresso della camera di flusso a piastre parallele.

Utilizzare la pompa a siringa per perfondere le cellule BT 20 sul monostrato choi nella camera di flusso a piastre parallele. Nelle impostazioni live del software di imaging, regolare il tempo di esposizione della fotocamera uno per ottenere un'immagine nel canale rosso. Far corrispondere il tempo di esposizione della fotocamera due al tempo di esposizione della fotocamera uno.

Se si osserva un'immagine nel canale verde, sono presenti artefatti di smarginatura. In tal caso, mantenere il tempo di esposizione equivalente nella fotocamera uno e nella fotocamera due e ridurre il tempo di esposizione fino a quando l'artefatto di sbavatura non è più visibile nel canale verde. Regolare il guadagno della fotocamera uno per migliorare la visibilità dell'immagine nel canale rosso, se necessario.

Quindi, rimuovere le sospensioni BT 20 rimanenti dal serbatoio e sostituire le sospensioni con DPBS. Utilizzare la pompa a siringa per perfondere la soluzione sul monostrato choi fino a quando le cellule BT 20 non sono più visibili sul monostrato. Riempire il serbatoio con la sospensione di cellule BT 20 colorate con solo anticorpo verde coniugato fluoro quattro.

Ripetere il processo di calibrazione della fotocamera utilizzando i controlli verdi a colore singolo. Questo tempo definisce il tempo di esposizione con la fotocamera due per visualizzare le celle nel canale verde senza sbavature attraverso gli artefatti nel canale rosso raccolti dalla fotocamera uno. Utilizzare il software di imaging per visualizzare simultaneamente le immagini acquisite dalle due telecamere CCD monocromatiche nella camera di flusso. Rsperimento.

Unisci le immagini raccolte da entrambe le telecamere utilizzando il modulo simul pics di stream picks. Utilizza le regolazioni di correzione digitale in simul pic o software alternativi per allineare spazialmente le immagini unite. Se necessario, le immagini possono essere corrette con il modulo PIC simultaneo per regolazioni orizzontali, verticali e rotazionali.

Il sistema è ora pronto per essere utilizzato per acquisire due immagini a colori contemporaneamente. Un saggio di adesione della camera di flusso a piastre parallele è stato utilizzato per dimostrare il sistema di suddivisione dell'emissione a doppia telecamera descritto in questo video. Come mostrato qui, il sistema ha rilevato cellule BT 20 che sono state marcate in fluorescenza con CD 24 anti-umano mostrato in rosso e HECA 4 52, che si lega alle molecole correlate alle SCO mostrate in verde.

Alcune celle rotanti mostravano segnali rossi ma non verdi. Altri mostravano segnali verdi ma non rossi, e altre celle ancora mostravano sia segnali rossi che verdi. Qui. Le telecamere hanno mantenuto la risoluzione ottica e temporale per tracciare le caratteristiche delle cellule su una cellula che cade e oltre l'estremità mentre rotola sul substrato reattivo nella direzione del flusso, i canali di emissione fusi hanno rivelato la distribuzione e la colocalizzazione di CD 24 e molecole sazie sulla superficie delle cellule BT 20 che rotolano e aderiscono ai monostrati CHO e.

Queste immagini mostrano uno zoom di una singola cellula BT 20 in cui le molecole CD 24 e sature si localizzano e appaiono come macchie da gialle ad arancioni quando i canali di emissione pseudo colorati rossi e verdi vengono fusi. Presi insieme. Queste informazioni dimostrano che il sistema di suddivisione dell'emissione a doppia telecamera ha la risoluzione spaziale, temporale e ottica necessaria per rivelare le caratteristiche cellulari e molecolari in applicazioni come i saggi di adesione della camera di flusso in cui le cellule si muovono rapidamente attraverso il campo visivo.

Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come impostare e calibrare un sistema di divisione delle emissioni a doppia telecamera o di imaging di un saggio di adesione in camera di flusso su piastra parallela in tempo reale in due colori. Questo metodo può essere applicato ad altri saggi in vitro che utilizzano la fluorescenza per studiare il comportamento cellulare.