Una tecnica di microscopia TIRF per Real-time, Imaging simultanea del TCR e delle sue proteine ​​associate segnalazione

Questo video descrive una procedura per tracciare gli eventi di segnalazione del recettore delle cellule T utilizzando l'acquisizione simultanea a doppio canale. La microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale o la microscopia per tappeto erboso vengono trasfettate con un plasmide codificante GFP marcato ZAP 70, un doppio strato lipidico supportato da vetro, che incorpora un peptide ancorato ai lipidi. Vengono preparati complessi MHC, molecole di adesione e molecole co-stimolatorie.

Le cellule T trasfettate ZAP 70 vengono aggiunte al doppio strato quando i recettori delle cellule T sono coinvolti da complessi peptidici MHC. Le tre catene associate al recettore delle cellule T CD sono fosforilate dalla chinasi LCK della famiglia SARC e la chinasi zap 70 viene reclutata dal citoplasma. Il recettore delle cellule T viene quindi marcato in fluorescenza e viene eseguito l'imaging in cui le cellule vengono immerse in un mezzo con indice di rifrazione inferiore al vetro di copertura e illuminate da un raggio laser ad un angolo che subisce una riflessione interna totale.

Questo genera un'onda evanescente all'interfaccia vetro-acqua, che decade esponenzialmente nel mezzo, consentendo una profondità di penetrazione da 100 a 200 nanometri. Quindi solo i fluoro quattro nella membrana plasmatica o molto vicino ad essa sono eccitati. L'analisi delle immagini risultanti rivela che la segnalazione avviene nei micro cluster del recettore delle cellule T.

Il vantaggio principale della microscopia per tappeti erbosi o della microscopia confocale convenzionale è che si ottiene una risoluzione migliore in modo tale che i cluster di segnalazione o i complessi di segnalazione come i micro cluster TCR siano facilmente visualizzabili. Travis Crites e Chen. Entrambi i postdoc nel mio laboratorio dimostreranno come trasfettare le cellule T primarie di topo utilizzando la tecnologia dell'affezione maxi nucleo e quindi visualizzarle utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale o il tappeto erboso M stimolato con vetro di strato biliare lipidico di uccello contenente antigene.

Questo metodo è stato ampiamente utilizzato per studiare la segnalazione in varie cellule immunitarie, tra cui cellule T, cellule B, natural killer e cellule master. Il metodo è ampiamente applicabile e può essere utilizzato per studiare la maggior parte dei sistemi recettoriali nelle cellule di mammifero, soprattutto se la segnalazione avviene in cluster. Gli individui che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà iniziali poiché le cellule T sono molto difficili da trasfettare.

Inoltre, è necessario un coordinamento preciso in modo che la vitalità delle cellule T e l'efficienza della trasfezione, la qualità del bilare e l'allineamento del microscopio siano all'altezza. Il primo passo di questa procedura consiste nel trasfettare cellule T primarie naive o attivate in vitro con plasmidi di espressione e molecole di segnalazione codificanti marcate mediante GFP utilizzando un kit effettore di nucleo di cellule T di topo AM maxa. Tutte le cellule T utilizzate in questo studio esprimevano l'A-N-D-T-C-R che riconosce il peptide MCC trovato nella molecola MHC IE di K. La procedura di trasfezione mostrata qui viene eseguita secondo le raccomandazioni del produttore.

Tuttavia, vengono presentati alcuni suggerimenti che promuovono la vitalità delle cellule T dopo la trasfezione. Sia la vitalità che l'efficienza di trasfezione sono più elevate nelle cellule T attivate in vitro rispetto alle cellule naive e, quindi, questo protocollo utilizza cellule T attivate in vitro prima di iniziare. Preparare due millilitri di terreno di coltura a cellule T integrato per ogni trasfezione combinando 1,9 millilitri di terreno fornito nel kit 20 microlitri di componente, A 20 microlitri di componente B e 100 microlitri di siero fetale bovino in una provetta da due millilitri.

Trasferire due millilitri di terreno in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Porre la piastra in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius per almeno un'ora per consentire al terreno di equilibrare la morte cellulare risultante dalla sospensione Resus di cellule trasfettate in un terreno freddo o non a un pH di 7,2. Per preparare la miscela di trasfezione, combinare 82 microlitri di soluzione effettrice di nucleo di cellule T di topo con 18 microlitri di integratore due e cinque microgrammi di DNA plasmidico libero da endotossine a una concentrazione non inferiore a 0,5 microgrammi per microlitro miscelato accuratamente picchiettando.

Trasferire da cinque a 10 milioni di cellule in una provetta da centrifuga da 15 millilitri, centrifugare a 75 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente dopo la centrifuga. Utilizzare un aspiratore a vuoto per rimuovere la maggior parte possibile del surnatante per risospendere delicatamente il pellet cellulare nella miscela di trasfezione e aspirare lentamente il pellet cellulare tre o quattro volte fino a quando non rimangono grandi grumi di cellule. Utilizzando una pipetta, la sospensione è stata trasferita con cura in un amaxa vete certificato, assicurandosi che non siano presenti bolle.

Chiudere il qve select programma effettore nucleare X 0 0 1 sul dispositivo effettore nucleo. Inserire il vete nel supporto Q vete e premere il pulsante per applicare il programma selezionato. Quindi trasferire immediatamente il terreno di coltura veterinario e pre-bilanciato sulla cappa.

Utilizzando la pipetta di plastica in dotazione, aggiungere circa 500 microlitri del terreno pre-bilanciato al vete. Quindi aggiungere la sospensione cellulare al terreno nella piastra. Goccia dopo goccia.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per quattro ore per consentire un'espressione a basso livello delle proteine marcate con GFP e per ridurre al minimo la comparsa di artefatti da sovraespressione. In questa sezione, viene descritto un metodo per allineare il microscopio per l'imaging simultaneo a due canali prima di avviare l'alimentazione su tutti i componenti del microscopio. Avviare il computer e il software.

Quindi assicurarsi che tutti i componenti hardware siano riconosciuti dal software. Poiché il software si avvia senza alcun messaggio di errore, tutti i componenti sono stati rilevati. Diluire un microlitro di risoluzione inferiore.

Le microsfere multifluorescenti luminose di Flores in due millilitri di PBS per l'uso come standard di colocalizzazione. Quindi aggiungere 0,25 millilitri di sospensione di microsfere a ciascun pozzetto di un sistema di vetro di copertura a otto pozzetti Lab Tech. Posizionare il sistema di scorrimento della camera sulla piattaforma sopra l'obiettivo.

Quindi porta le perle assorbite sul vetro in modo che siano a fuoco nell'anteprima dal vivo. Il riquadro di sinistra è il canale in cui saranno visibili le cellule trasfettate GFP. Il riquadro di destra mostrerà il TCR etichettato durante gli esperimenti di imaging di cellule vive.

Utilizzando l'allineamento Y del lancio della fibra XY, Z, regolare la posizione del raggio laser in modo tale che il raggio emerga dall'obiettivo e venga proiettato sul soffitto. È importante farlo quando l'obiettivo si trova nella posizione in cui il piano di vetro è a fuoco. Se il raggio sul soffitto è diffuso, il raggio non è fascicolato.

Regolare il micrometro Z per ottenere la collazione completa del test di collazione per ciascuna delle linee laser da utilizzare nell'esperimento. Quindi, utilizzando un misuratore di potenza laser, regolare la potenza del laser da 20 a 30 micro watt per ciascun canale. Le celle T sono estremamente sensibili alle radiazioni laser e l'illuminazione è limitata a un totale combinato di 50 micro watt.

Avanti per impostare l'angolo per il tappeto erboso. Ruotare il micrometro di allineamento Y sul lancio della fibra per allontanare il raggio dal soffitto fino al suo angolo. Rispetto agli obiettivi, l'asse ottico si avvicina a 90 gradi.

Una volta raggiunto l'angolo critico per la riflessione interna totale, la luce laser non uscirà più dall'obiettivo Per valutare se l'allineamento del tappeto erboso è stato raggiunto, mettere a fuoco su e giù attraverso il piano del vetro di copertura. Si noti qui che quando le perle che vengono assorbite dalla superficie vengono messe fuori fuoco, si possono vedere molte perle galleggiare in soluzione. Per ottenere un buon allineamento del tappeto erboso, è necessario aumentare l'angolo del raggio rispetto all'obiettivo.

All'aumentare dell'angolo del raggio, le perle che galleggiano vicino alla superficie iniziano a scomparire e le perle assorbite all'interfaccia aumentano di intensità. Ora, quando le perle assorbite nell'interfaccia vengono messe fuori fuoco, non rimane visibile alcuna perlina che galleggia nella soluzione. A questo punto, il tappeto erboso è correttamente allineato in quanto solo le perline che vengono assorbite dal vetrino coprioggetti possono essere inserite. Fuoco.

Successivamente, per allineare i canali fluorescenti rosso e verde l'uno rispetto all'altro, mettere a fuoco le perline e confrontare la posizione delle caratteristiche identificabili nelle immagini prodotte in entrambi i canali. Utilizzando le viti micrometriche X e Y su un supporto per fotocamera, avvicinare il più possibile la posizione relativa delle perline. Qui. Si noti la perlina luminosa nel quadrante in basso a sinistra di entrambe le immagini per garantire l'allineamento spaziale tra i due canali.

Questa funzione viene portata alla stessa posizione relativa in entrambe le immagini. Cattura e salva l'immagine da entrambi i canali. Queste immagini verranno utilizzate come standard di colocalizzazione per allineare i due canali.

Un esempio di questo allineamento è visto qui prima dell'allineamento. Uno dei canali viene ruotato rispetto all'altro, come mostrato in questa immagine in cui le immagini provenienti dai due canali delle perline a risoluzione secondaria sono sovrapposte. Dopo le regolazioni, le immagini vengono allineate come mostrato qui.

La qualità dell'allineamento può essere ulteriormente esaminata confrontando le immagini delle cellule viventi trasfettate GFP. Da notare come il podio di Laila dai due canali sia perfettamente allineato. Dopo aver allineato le due immagini utilizzando la calibrazione stabilita utilizzando le microsfere fluorescenti.

Una volta che il microscopio è stato installato, vengono preparate camere di flusso contenenti doppi strati lipidici supportati da vetro che presentano l'antigene e viene eseguito il tappeto erboso M per visualizzare prima le cellule T TRASFETTATE che interagiscono con il substrato. Seguendo il protocollo descritto da Ana e Dustin assemblano una camera di flusso con doppi strati lipidici planari formati su un vetrino di vetro contenente lipidi NI NTA, la molecola di adesione ICAM one e complessi peptidici MHC. Gli IEFK caricati con MCC sono incorporati nel doppio strato tramite tag istidinici.

La molecola co-stimolatrice CD 80 è incorporata. Utilizzando un'ancora GPI, posizionare la cella di flusso sul tavolino del microscopio e stabilizzarla fissando la camera a una piastra adattatrice sul tavolino del microscopio utilizzando una barra di tensione per immobilizzarla. Quindi, collegare l'elemento riscaldante fornito dal produttore sulla cella di flusso per controllarne la temperatura.

Posizionare l'obiettivo su un doppio strato e mettere a fuoco il piano del doppio strato per consentire il riscaldamento dell'obiettivo e la cella di flusso accende la cella di flusso e i riscaldatori dell'obiettivo per portare la temperatura della camera a 37 gradi Celsius. Dopo quattro ore di incubazione, trasferire le cellule T sezionate in una provetta da 15 millilitri e centrifugare a una velocità di 80 volte G.Risospendere le cellule in 300 microlitri di tampone H-B-S-B-S-A. Quindi aggiungere H 57 FAB o H 57 frammento variabile a catena singola per etichettare il TCR a una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro per fab o 20 microgrammi per millilitro per il frammento variabile a catena singola.

Trasferire le cellule in un tubo fax da cinque millilitri. Successivamente, utilizzando una siringa da un millilitro, iniettare le cellule nella camera di flusso tramite una valvola a tre vie. Impostare le condizioni di imaging in modo che l'acquisizione in tempo reale a doppio canale mostri un'anteprima in tempo reale dei canali TCR e GFP e trovi un campo con cellule trasfettate.

A causa delle differenze di intensità tra TCR e GFP, potrebbe essere necessario regolare il ridimensionamento delle immagini in tempo reale in modo che le celle possano essere visualizzate in entrambi i canali. Come in questo caso, confermare l'illuminazione del tappeto erboso concentrandosi sul piano di vetro per rilevare eventuali macchie laterali della membrana. Se le membrane laterali non vengono messe a fuoco, l'allineamento del tappeto erboso è buono.

In questa anteprima dal vivo, la colorazione laterale della membrana è evidente sia nel piano del vetrino coprioggetti che quando il vetrino coprioggetti viene messo fuori fuoco per portare il microscopio in un buon allineamento del tappeto erboso. L'angolo del laser rispetto all'obiettivo è aumentato e la membrana laterale va fuori fuoco. Inizia a catturare singole immagini e sequenze time-lapse con un intervallo di 10 secondi.

Per cinque minuti, le cellule sono state incubate su un supporto di vetro e su due strati di INTA contenenti sei molecole per quadrato. Micrometro di IEFK caricato con peptidi, 100 molecole per micrometro quadrato di Alexa 6, 4, 7 ICAM coniugato con tag hist uno e 100 molecole per quadrato. Micrometro di GPI ancorato CD 80 a doppio canale La microscopia del tappeto erboso ad acquisizione simultanea è stata eseguita in presenza continua di Alexa 5 46 coniugato H cinque sette frammento FAB.

Per colorare il TCR, le cellule sono state sottoposte a imaging fino a un'ora dopo il contatto iniziale con il doppio strato. Il numero di cluster ZAP 70 per cella è stato analizzato utilizzando un software di conteggio automatico dei cluster. In ogni caso sono state analizzate almeno 40 cellule.

I peptidi caricati sono indicati nel riquadro. ICAM uno si riferisce a cellule su doppi strati contenenti 100 molecole per micrometro quadrato di Alexa 6 4 7 coniugate. La segnalazione dipendente da zap 70 si verifica in micro cluster TCR e solo in risposta a ligandi agonisti come si può vedere in questo filmato, ripreso a 10 secondi per fotogramma.

La segnalazione del TCR in risposta ai peptidi agonisti è sostenuta dalla generazione continua di micro cluster TCR nella periferia dell'area di contatto che reclutano ZAP 70. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come trasfettare le cellule T primarie utilizzando una tecnologia di affezione nucleare maxa e visualizzare correttamente il reclutamento di molecole di segnalazione GFPT in micro cluster TCR utilizzando la microscopia per tappeto erboso. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sette ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di essere molto delicati con le cellule primarie. Più le cellule sono sane in ogni fase dell'esperimento, maggiore sarà l'efficienza di trasfezione e più cellule verranno catturate nell'imaging. Le cellule T sono altamente mt e, di conseguenza, l'imaging sequenziale del canale TCR e GFP fa sì che le due immagini non si allineino perfettamente a causa del movimento dei micro cluster e delle cellule TCR.

Per ovviare a questo problema, abbiamo sviluppato il microscopio per tappeti erbosi ad acquisizione simultanea a doppio canale.