Microscopia di multi-colore localizzazione delle proteine di membrana singola in organelli delle cellule di mammiferi dal vivo

Questa tecnica può rispondere a domande chiave nei processi regolatori, come il ruolo che la dinamica e l'organizzazione delle proteine svolgono nell'adattamento funzionale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere eseguita in cellule viventi, rivelando così la dinamica delle proteine a livello di singola molecola. Sebbene questo metodo sia stato originariamente implementato per fornire informazioni sull'organizzazione spazio-temporale delle proteine di membrana mitocondriali, può essere applicato anche ad altri organelli e ad altre proteine di membrana.

A dimostrare la tecnica sarà Timo Appelhans, uno studente laureato del mio laboratorio. Dopo aver trasfettato e preparato i campioni cellulari e il microscopio secondo il protocollo di testo, montare il campione preparato con perline fluorescenti nel supporto del campione tra l'anello in PTFE e l'anello di gomma rossa. Avviare il microscopio, tutti i componenti hardware e tutto il software necessario per la microscopia.

Utilizzare un fazzoletto fresco e privo di lanugine spruzzato con isopropanolo per pulire la lente dell'obiettivo e la parte inferiore del vetrino coprioggetti. Quindi posizionare una goccia di olio da immersione sulla pupilla della lente dell'obiettivo. Quindi, posizionare il portacampione con il campione di perlina sul tavolino del microscopio in modo che la parte inferiore del vetrino coprioggetti entri in contatto con l'olio.

Quindi mettere a fuoco le perline utilizzando la luce di trasmissione o una linea laser. Regolare la potenza dei due laser di eccitazione per ottenere una densità di segnale simile nei due canali di fluorescenza. Quindi cerca un'area con molti segnali fluorescenti distinti.

Genera una vista unita dei canali fluorescenti utilizzando il software di controllo della telecamera. Quindi utilizzare le viti sullo splitter di immagine per inclinare manualmente lo splitter ottico di immagine interno per ottenere la migliore sovrapposizione dei segnali dai due canali fluorescenti. Avviare il software di controllo del microscopio TIRF e scegliere di visualizzare i singoli canali in modalità live streaming.

Scatta un'istantanea, emozionando le fluorescenze in tutti i canali. Utilizzare quindi questa immagine per produrre la matrice di trasformazione. Avviare il plug-in di analisi del software e caricare nel software le immagini a due colori registrate in precedenza di perline fluorescenti.

Scegliere l'orientamento utilizzato dei canali fluorescenti. Fare clic su Sì quando viene richiesto di calibrare le immagini e selezionare l'istantanea scattata in precedenza. Aprire il gestore unità per definire i fattori di conversione delle unità, quindi aprire il gestore della localizzazione.

Per determinare la funzione di diffusione dei punti, o PSF, premere il pulsante PSF Radius. Nella finestra PSF Estimator che si apre, definire l'apertura numerica e il massimo di emissione. Quindi fare clic su Stima raggio PSF.

Successivamente, accetta la PSF sperimentale ottenuta. Definisci la casella di valutazione, il numero di cicli di deflazione e quanti core del computer vengono utilizzati per il calcolo. Quindi premere Localizza per iniziare ad adattare la distribuzione di intensità delle singole particelle, utilizzando una funzione gaussiana simmetrica 2D.

Aprire il gestore di calibrazione. Nell'immagine renderizzata e unita dei due canali, verranno mostrati il segnale originale e i centri localizzati. Scegli la modalità affine.

Quindi collegare manualmente le corrispondenti coppie di centri localizzati nei due canali, che hanno avuto origine dallo stesso perlina fluorescente, tracciando una linea di connessione. Collegare i segnali corrispondenti distribuiti sul campo visivo. Premere quindi Accetta e salvare la matrice di trasformazione.

Per eseguire l'imaging molecolare singolo delle proteine della membrana mitocondriale, montare il vetrino copricampione tra gli anelli di gomma e PTFE. Quindi riempire la camera con 0,5-0,8 millilitri di terreno di imaging. Pulire la lente dell'obiettivo e la parte inferiore del vetrino coprioggetti.

Quindi utilizzare la luce di trasmissione o una linea laser per mettere a fuoco le cellule, dopo aver aggiunto una goccia di olio alla lente. Quindi regolare la potenza dei due laser di eccitazione per ottenere un'intensità simile e cercare un'area con molti segnali fluorescenti. Regolare l'angolo di illuminazione nel software di controllo del microscopio TIRF per creare un angolo di incidenza più piccolo dell'angolo critico, o la modalità TIR, per eccitare la regione specifica di interesse tramite un foglio HILO.

L'adattamento dell'illuminazione del microscopio TIRF per eccitare gli organelli cellulari utilizzando l'illuminazione HILO richiede una rapida valutazione del rapporto segnale/fondo e l'esperienza nella microscopia TIRF, nonché la conoscenza della morfologia cellulare. Imposta il guadagno EM e scegli un tempo di esposizione adatto all'esperimento che raccolga un numero sufficiente di fotoni per fotogramma. Quindi regolare la potenza del laser per ottenere un elevato rapporto segnale/rumore, poiché questo rapporto corrisponde direttamente alla precisione di localizzazione.

Trova un'area nella periferia cellulare con mitocondri allungati e non sovrapposti e segnali a singola molecola. Se non sono visibili singoli segnali in uno o entrambi i canali, attendere che lo sbiancamento provochi la comparsa di segnali a singola molecola. Nel caso in cui sia necessario sbiancare un solo canale, spegnere il laser dell'altro canale, per evitare lo sbiancamento, prima di registrare questo canale.

Registrare fino a quando il numero di segnali non è troppo basso per una ragionevole continuazione. Avviare il software di elaborazione delle immagini e verificare la presenza di strutture mitocondriali generando un'immagine cumulativa renderizzata di almeno 1.000 fotogrammi registrati. Avvia il plug-in di analisi del software.

Per eseguire l'elaborazione dei dati per la localizzazione e il tracciamento, caricare i dati grezzi. Controlla il multicolore. Scegliere l'orientamento corretto di entrambi i canali.

Quando viene richiesto Calibra immagini, caricare la matrice di trasformazione. I canali verranno visualizzati separatamente. Aprire i dati non elaborati dal contenitore di immagini facendo clic su Mostra.

Quindi apri il gestore delle unità nella scheda in alto e definisci i fattori di conversione delle unità in ciascun canale. Aprire il gestore di localizzazione nella scheda superiore e definire la casella di valutazione e il numero di cicli di sgonfiaggio. Fare clic su Raggio PSF per aprire lo stimatore PSF.

Impostare l'apertura numerica e il massimo di emissione per ottenere il valore PSF teorico. Premere Accetta. Ripetere l'operazione per tutti i canali.

Quindi premere Localizza per avviare la localizzazione di singole particelle per i segnali registrati in entrambi i canali. Attendi il completamento del software. Ora, un'immagine super-risolta per ogni canale viene ottenuta nel contenitore di immagini del plug-in di analisi del software.

PINK1 è un fattore importante che garantisce la funzionalità mitocondriale. Per determinare la localizzazione di PINK1 rispetto a Tom20 nei mitocondri funzionali e disfunzionali, è stata registrata una serie temporale di 1.000 fotogrammi. L'immagine cumulativa di tutti i segnali nel tempo provenienti da un canale ha mostrato che PINK1 era localizzato nel citosol, nella membrana esterna e all'interno dei mitocondri in condizioni normali, ma preferenzialmente nella membrana esterna dei mitocondri depolarizzati.

Come mostrano le immagini sommate delle particelle localizzate, PINK1 è distribuito principalmente all'interno dei mitocondri polarizzati, mentre Tom20 è localizzato nella membrana mitocondriale esterna. Questo diventa ancora più chiaro nell'immagine unita delle particelle localizzate Tom20 e PINK1, che mostra che la distribuzione della proteina di membrana esterna Tom20 è molto più ampia. Per verificare la localizzazione di PINK1 all'interno dei mitocondri, la subunità da 30 kilodalton del complesso respiratorio uno è stata fusa con GFP fotoattivabile e registrata mediante microscopia di localizzazione con fotoattivazione a fluorescenza.

L'immagine cumulativa a tre colori e la distribuzione della sezione trasversale mostrano la sovrapposizione del complesso uno e di PINK1, confermando l'importazione di PINK1 a figura intera. Questi dati dimostrano che le sottopopolazioni di PINK1 occupano diversi micro-compartimenti mitocondriali. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 20 ore, inclusa la registrazione e la post-elaborazione dei dati, se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di verificare il movimento degli organelli. Seguendo questa procedura, è possibile determinare la localizzazione relativa delle proteine. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del tracciamento di singole particelle di proteine mitocondriali per osservare il loro comportamento in Z2 e in diverse condizioni metaboliche e sotto stress.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la microscopia a doppia colonna delle proteine mitocondriali per rivelare la loro posizione e il traffico dei sottoorganelli.