Name: Microscopia di multi-colore localizzazione delle proteine di membrana singola in organelli delle cellule di mammiferi dal vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Scopri la localizzazione multicolore di singole proteine di membrana in organelli cellulari di mammiferi vivi. Questa tecnica raggiunge una risoluzione di circa 18 nm per studiare la dinamica proteica.

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Gli autori vorrei ringraziare il gruppo di biofisica e Jacob Piehler presso l'Università di Osnabrück per supporto continuo, Wladislaw Kohl per assistenza tecnica e preparazione del materiale e il Consiglio di CellNanOs per la fornitura di microscopi per l'uso. Il progetto è stato finanziato il 944 SFB.

<ol><li>Appelhans, T., Richter, C., Wilkens, V., Hess, S., Piehler, J., Busch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+organization+of+mitochondrial+microcompartments+revealed+by+combining+tracking+and+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Nanoscale organization of mitochondrial microcompartments revealed by combining tracking and localization microscopy.</a> Nano Letters. 12 (2), 610-616 (2012).</li>
<li>Appelhans, T., Busch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Tracking+and+Localization+of+Mitochondrial+Protein+Complexes+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Tracking and Localization of Mitochondrial Protein Complexes in Live Cells.</a> Methods Mol Biol. 1567, 273-291 (2017).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biological+structures+with+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Nat Protoc. 4 (3), 291-308 (2009).</li>
<li>Pennacchietti, F., Gould, T. J., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Probe+Photophysics+in+Localization-Based+Superresolution+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The Role of Probe Photophysics in Localization-Based Superresolution Microscopy.</a> Biophys J. 113 (9), 2037-2054 (2017).</li>
<li>Wegel, E., Göhler, A., Lagerholm, B. C., Wainman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM%2C+STED+and+Localisation+Microscopy%3A+A+practical+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific reports. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/srep27290?WT.feed_name=subjects_physical-sciences ">https://www.nature.com/articles/srep27290?WT.feed_name=subjects_physical-sciences </a> (2016).</li>
<li>Pellett, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+STED+microscopy+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Two-color STED microscopy in living cells.</a> Biomedical Optics Express. 2 (8), (2011).</li>
<li>Ishigaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+super-resolution+imaging+of+mitochondria+labeled+with+TMRM+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells.</a> Mitochondrion. 28, 79(2016).</li>
<li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy%2C+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740(2015).</li>
<li>Sergé, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+multiple-target+tracing+to+probe+spatiotemporal+cartography+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.</a> Nat Methods. 5 (8), (2008).</li>
<li>Appelhans, T., Busch, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+mitochondrial+membrane+proteins+in+specific+sub-organelle+membrane+locations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+reviews%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of mitochondrial membrane proteins in specific sub-organelle membrane locations.</a> Biophysical reviews. 9 (4), 345-352 (2017).</li>
<li>Wilmes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple-color+super-resolution+imaging+of+live+cells%3A+resolving+submicroscopic+receptor+organization+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Triple-color super-resolution imaging of live cells: resolving submicroscopic receptor organization in the plasma membrane.</a> Angewandte Chemie. 51 (20), 4868-4871 (2012).</li>
<li>Niewidok, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+reveals+dynamic+biphasic+partition+of+RNA-binding+proteins+in+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging reveals dynamic biphasic partition of RNA-binding proteins in stress granules.</a> J Cell Biol. , (2018).</li>
<li>Wurm, C. A., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+protein+distributions+define+two+sub-compartments+of+the+mitochondrial+inner+membrane+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Differential protein distributions define two sub-compartments of the mitochondrial inner membrane in yeast.</a> FEBS Lett. 580 (24), 5628-5634 (2006).</li>
<li>Schmidt, R., Wurm, C. A., Punge, A., Egner, A., Jakobs, S., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+cristae+revealed+with+focused+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial cristae revealed with focused light.</a> Nano Lett. 9 (6), 2508-2510 (2009).</li>
<li>Kukat, C., Wurm, C. A., Spahr, H., Falkenberg, M., Larsson, N. G., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+reveals+that+mammalian+mitochondrial+nucleoids+have+a+uniform+size+and+frequently+contain+a+single+copy+of+mtDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).</li>
<li>Beinlich, F., Drees, C., Piehler, J., Busch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shuttling+of+PINK1+between+Mitochondrial+Microcompartments+Resolved+by+Triple-Color+Superresolution+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Shuttling of PINK1 between Mitochondrial Microcompartments Resolved by Triple-Color Superresolution Microscopy.</a> ACS chemical biology. 10 (9), 1970-1976 (2015).</li>
<li>Shim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li>
<li>Sbalzarini, I., Mezzacasa, A., Helenius, A., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Organelle+Shape+on+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effects of Organelle Shape on Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Biophysical Journal. 89 (3), 1482-1492 (2005).</li>
<li>Reits, E., Neefjes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+fixed+to+FRAP%3A+measuring+protein+mobility+and+activity+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells.</a> Nature Cell Biology. 3 (6), E145-E147 (2001).</li>
<li>Goehring, N., Chowdhury, D., Hyman, A., Grill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+Analysis+of+Membrane-Associated+Proteins%3A+Lateral+Diffusion+and+Membrane-Cytoplasmic+Exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">FRAP Analysis of Membrane-Associated Proteins: Lateral Diffusion and Membrane-Cytoplasmic Exchange.</a> Biophysical Journal. 99 (8), 2443-2452 (2010).</li>
<li>Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2014 (7), 709-725 (2014).</li>
<li>Sukhorukov, V., Dikov, D., Busch, K., Strecker, V., Wittig, I., Bereiter-Hahn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+protein+mobility+in+mitochondrial+membranes+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Determination of protein mobility in mitochondrial membranes of living cells.</a> Biochimica et biophysica acta. 1798 (11), 2022-2032 (2010).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Graham, F. L., van der Eb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+the+assay+of+infectivity+of+human+adenovirus+5+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA.</a> Virology. 52 (2), 456-467 (1973).</li>
<li>Wedeking, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+Controlled+Reorganization+of+Signaling+Complexes+in+the+Plasma+Membrane+of+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally Controlled Reorganization of Signaling Complexes in the Plasma Membrane of Living Cells.</a> Small. 11 (44), 5912-5918 (2015).</li>
<li>Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BCa2%2B%5Di+signaling+between+mitochondria+and+endoplasmic+reticulum+in+neurons+is+regulated+by+microtubules.+From+mitochondrial+permeability+transition+pore+to+Ca2%2B-induced+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">[Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release.</a> J Biol Chem. 280 (1), 715-721 (2005).</li>
<li>Poot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+morphology+and+function+with+novel+fixable+fluorescent+stains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains.</a> J Histochem Cytochem. 44 (12), 1363-1372 (1996).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nmeth1171">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells (vol 5, pg 159).</a> Nature Methods. 5 (5), 455(2008).</li>
<li>Elmokadem, A., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+Drift+Correction+for+Superresolution+Localization+Microscopy+with+Bayesian+Inference%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Optimal Drift Correction for Superresolution Localization Microscopy with Bayesian Inference.</a> Biophys J. 109 (9), 1772-1780 (2015).</li>
<li>Barlag, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+super-resolution+imaging+of+proteins+in+living+Salmonella+enterica+using+self-labelling+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Single molecule super-resolution imaging of proteins in living Salmonella enterica using self-labelling enzymes.</a> Sci Rep. 6, 31601(2016).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li>
<li>Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+localization+analysis+for+single-molecule+tracking+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy.</a> Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).</li>
<li>Jin, S., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-+and+Parkin-Mediated+Mitophagy+at+a+Glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">PINK1- and Parkin-Mediated Mitophagy at a Glance.</a> Journal of Cell Science. 125, 795-799 (2013).</li>
<li>Yamano, K., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1+is+degraded+through+the+N-end+rule+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">PINK1 is degraded through the N-end rule pathway.</a> Autophagy. 9 (11), 1758-1758 (2013).</li>
<li>Wiedemann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machinery+for+protein+sorting+and+assembly+in+the+mitochondrial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Machinery for protein sorting and assembly in the mitochondrial outer membrane.</a> Nature. 424 (6948), 565-571 (2003).</li>
<li>Thompson, R., Larson, D., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui, una tecnica per la localizzazione di singola molecola di colore doppio delle proteine della membrana cellulare è stata presentata. Seguendo il protocollo, le proteine di membrana sono fuse a proteine che reagiscono con le tinture della rodamina TMR e SiR coniugato ai loro rispettivi substrati con etichetta automatica. Rodamina coloranti sono luminose e fotostabili e pertanto consentono di imaging ripetitivo1. Per performance di successo, alcuni condizioni e argomenti critici devono essere ten...

L'obiettivo del presente protocollo è quello di fornire un metodo di imaging per localizzare e tenere traccia di proteine di membrana singola all'interno di cellule vive. Noi chiamiamo questo metodo di rilevamento e localizzazione microscopia (TALM)1,2. Come microscopia di ricostruzione ottica stocastica (tempesta)3 e microscopia a fluorescenza fotoattivazione localizzazione ((F) PALM)4,5, TALM è una tecnica di localizzazione singola molecola-basato fluorescenza. Tuttavia, è distinto in modo che la mobilità delle proteine di membrana in combinazione con formazione immagine ripetitiva dello stesso etichettato molecola alle diverse posizioni rivela la microcompartment che è accessibile per la proteina mobile. In altre parole, le possibili localizzazioni della proteina sono impostate dall'architettura dell'organello e dalla mobilità della proteina1. Il metodo è complementare a vari altri super-risoluzione tecniche6,7,8 , perché rivela la localizzazione e la traiettoria mappe dalle proteine mobile imaging. L'etichettatura è basato sull'utilizzo di proteine di fusione geneticamente ingegnerizzati che sono di per sé non fluorescenti. Queste proteine di fusione sono enzimi che reagiscono in modo covalente con un substrato coniugato a un colorante con etichetta automatica. Questa procedura ha il vantaggio che il grado d'etichettatura può essere controllata dalla quantità di substrato aggiunto. Inoltre, permette di variare il colore della fluorescenza, a seconda il colorante coniugato selezionato. Diversi auto-etichettatura degli enzimi-tag sono disponibili9. Un altro vantaggio dell'utilizzo di self-etichettatura degli enzimi-tag è, che le tinture coniugate sono solitamente più stabile e più proteine fluorescenti1 e singole proteine pertanto possono essere registrati più brillante e più precisamente fino a quando essi vengono sbiancati. Questo consente la registrazione delle traiettorie delle proteine cellulari e l'estrazione di diffusione coefficienti10,11.
Qui, noi dimostrare la fattibilità di TALM con proteine di membrana mitocondriale, ma può essere applicato anche per altre proteine di membrana intra - ed extracellulari, compresi tipi differenti delle cellule12,13. Mostriamo che multi-colore TALM ulteriormente consente la distinzione simultanea delle proteine in diversi subcomparti a complementazione a esistente super-risoluzione fluorescenza microscopia tecniche14,15, 16. TALM è compatibile con live cell imaging17. La foto-fisica del rhodamines selezionate tetrametilrodamina (TMR) e silicio-Rhodamien (SiR), in particolare loro luminosità e stabilità, permette di proteine di membrana singolo record in più fotogrammi fornendo mappe di localizzazione (e traiettoria). Tuttavia, TALM è limitata per la localizzazione delle proteine solubili con i coefficenti di diffusione alta poiché il motion blur è troppo alto e i fotoni raccolti per ogni frame sono troppo bassi per la corretta localizzazione. Inoltre, TALM richiede meno energia di eccitazione di ad esempio tempesta o svuotamento di emissione stimolata (STED) microscopia6,7, la riduzione di effetti fototossici. Questo è importante, poiché lo stress fototossico colpisce spesso organellari morfologia18 e così mobilità analisi19. In somma, presentiamo TALM multicolore in cellule viventi come una tecnica che colma una lacuna tra i metodi di microscopia di localizzazione STORM/STED/PALM (F) e le tecniche che analizzano la mobilità di proteine come il recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP)20 ,21, fluorescenza correlazione spettroscopia (FCS)22e fluorescenza cross correlazione spettroscopia (FCC)11,23.

<table><tbody><tr><td>(acido 2-(4-(2-idrossietil)-1-piperazinil)-etansolfonico, 1 M) (HEPES)</td><td>Biochrom</td><td>#1104E</td><td></td></tr><tr><td>DC1: divisore di fascio dicroide&nbsp;</td><td>Chroma</td><td>640 dcxr</td><td>NC506031</td></tr><tr><td>DC2: Specchio policroico, beamsplitter</td><td>Chroma</td><td>zt405/488/561/640rpc</td><td>fuori produzione</td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x (senza Ca & </td><td>Sigma-Aldrich & Co.</td><td></td><td></td>#RNBF8311</tr><tr><td>Earle&acute; s MEM senza rosso fenolo, senza L-Glutammina e senza NaHCO3 contenente l'1% di FBS, lo 0,1% di HEPES, lo 0,1% di NEAA, lo 0,1% di Alanil-L-Glutammina e il 34,78% di carbonato acido di sodio (NaHCO3 0,75g/l)</td><td></td><td></td><td>Terreno di imaging</td></tr><tr><td>Earle&acute; s terreno essenziale minimo (MEM) con rosso fenolo, contenente l'1% di siero fetale bovino superiore (FBS), lo 0,1% di HEPES (acido 2-(4-(2-idrossietil)-1-piperazinil)-etansolfonico, 1 M) e lo 0,1% di aminoacidi non essenziali (NEAA)</td><td></td><td></td><td>Terreno di crescita</td></tr><tr><td>EF: filtro di emissione passa-banda</td><td>quadbandpass AHF analysentechnik</td><td>F72-866</td><td>Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm</td></tr><tr><td>Telecamera EMCCD</td><td>Andor</td><td>Andor iXON 897</td><td>Telecamera EMCCD</td></tr><tr><td>Filtro di emissione Cubetti filtranti QuadView, arancione</td><td>AHF analysentechnik</td><td>F39-637</td><td>passa-banda 582 - 619 nm</td></tr><tr><td>Filtro di emissione Cubetti filtranti QuadView, rosso</td><td>Chroma</td><td></td><td>passa-banda 655 - 725 nm (HQ 690/70)</td></tr><tr><td>FBS (Siero fetale bovino) superiore</td><td>Biochrom</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>Perle fluorescenti: TetraSpeck&trade; Microsfere, 0,1 & micro; m, fluorescente blu/verde/arancione/rosso scuro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T7279</td><td>microsfere fluorescenti</td></tr><tr><td>Glutammina</td><td>Biochrom</td><td>#0951C</td><td></td></tr><tr><td>cellule HeLa&nbsp;</td><td>DSMZ</td><td>ACC-57</td><td>Cellule di carcinoma cervicale dalla paziente Henrietta Lacks</td></tr><tr><td>Hela cells CI::p aGFP, stable</td><td>Muster et al., PLOSOne 2010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hela cells CV g::Halo7-Tag, stable</td><td>Appelhans et al., NanoLett 2012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hela cells Tom20::Halo7-Tag, stable</td><td>Appelhans et al., NanoLett 2012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image splitter</td><td>Photometrics</td><td>Dual-View Software</td><td></td></tr><tr><td>di elaborazione delle immagini</td> a emissione di splitter QV2<td>ImageJ2 / Fiji</td><td>freeware</td><td></td></tr><tr><td>Olio da immersione - ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45)</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td>444960-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a epifluorescenza invertita</td><td>Olympus IX-71/73/83</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser 561 nm, 200 mW</td><td>CrystaLaser</td><td>CL-561-200</td><td>Laser a emissione 561</td></tr><tr><td>nm 642 nm, 140 mW</td><td>Omicron</td><td>Luxx-642-140</td><td>642 nm emissione</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>versione R2013a</td><td></td></tr><tr><td>MEM con soluzione salina bilanciata di Earle 2,2 g/L di NaHCO3, glutammina stabile senza PR</td><td>Biochrom</td><td>FG-0385</td><td></td></tr><tr><td>MEM con soluzione salina bilanciata di Earle con 2,2 g/L di NaHCO3, glutammina stabile, fenolo Biochrom</td><td></td><td>FG-0325</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker. Colorante rosso profondo FM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M22426</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker&reg; Colorante FM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M7514</td><td></td>verde</tr><tr><td>Polarizzazione ottica multimodale che mantiene la fibra monomodale</td><td>Pointsource/Qioptiq</td><td></td><td>KineFLEX</td></tr><tr><td>NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer&nbsp;</td><td>Rapp Polymere GmbH T&uuml; Bingen</td><td></td><td>rivestimento vetrino coprioggetti</td></tr><tr><td>aminoacidi non essenziali (NEAA)</td><td>Biochrom</td><td>#0802E</td><td></td></tr><tr><td>PEG 800 (Polietilenglicole) 10 %</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>Codice 0263.1</td><td>rivestimento vetrino coprioggetti</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Biochrom</td><td>#0122E</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide per l'espressione PINK1-Halo7-Tag</td><td>Beinlich et al., ACS Chemical Biology 2015</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina (1,2 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich & Co.</td><td>gatto. No.P9155</td><td>rivestimento vetrino coprioggetto</td></tr><tr><td>RGD Peptide (Ac-CGRGDS-COOH)</td><td>Coring System Diagnostix GmbH, Gernsheim</td><td></td><td>rivestimento vetrino coprioggetto / Motivo del recettore Intergrin</td></tr><tr><td>Silicio Rodamina legata a HaloTag&reg;-Ligando (SiRHTL)&nbsp;</td><td>regalo personale da Kai Johnson</td><td></td><td>tintura</td></tr><tr><td>Software analisi plugin</td><td>auto-scritto C. P. Richter, Biophysik Osnabr&uuml; ck</td><td>SLIMFAST 16g</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametilrodamina / SNAP-Cell&reg; TMR-Star collegato a SNAP-Ligand (TMRstar)&nbsp;</td><td>New England Biolab&reg;</td><td>S9105S</td><td>colorante</td></tr><tr><td>Tetrametilrodamina legato a HaloTag&reg;-Ligando (TMRHTL)&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G8251</td><td>colorante</td></tr><tr><td>TIRF</td><td>condensatore Olympus</td><td>Cell^TIRF MITICO System</td><td>TIRF condensatore</td></tr><tr><td>TIRF software di controllo del microscopio</td><td>Olympus cellSens 1.12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TIRF obiettivo</td><td>Olympus</td><td>150x oil objective (N.A. 1.45; Olympus UAPO)</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA 10x</td><td>Biochrom</td><td>#0266</td><td></td></tr><tr><td>Acqua H2O 99,5 % Rotipuran&reg; Basso organico&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>Art. No. HN57.1</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopia di multi-colore localizzazione delle proteine di membrana singola in organelli delle cellule di mammiferi dal vivo

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

Conoscenza circa la localizzazione delle proteine in subcomparti cellulare è fondamentale per capire la loro funzione specifica. Qui, presentiamo una tecnica di Super-risoluzione che permette per la determinazione del microcompartments che sono accessibili per le proteine generando localizzazione e tracciamento di mappe di queste proteine. Inoltre, da microscopia localizzazione multi-colore, la localizzazione e tracciamento profili delle proteine in diversi subcomparti sono ottenuti simultaneamente. La tecnica è specifica per le cellule vive e si basa sull'imaging ripetitivo delle proteine di membrana mobile singolo. Le proteine di interesse sono geneticamente fuso con specifici, i cosiddetti self-etichettatura tag. Questi tag sono enzimi che reagiscono con un substrato in modo covalente. Coniugato di questi substrati sono coloranti fluorescenti. Reazione delle proteine enzima-etichetta con la fluorescenza etichettato risultati di substrati in proteine con etichettate. Qui, tetrametilrodamina (TMR) e silicio rodamina (SiR) vengono utilizzati come coloranti fluorescenti attaccati ai substrati degli enzimi. Utilizzando concentrazioni di substrato nel pM a Nm, Sub-stechiometrico etichettatura è raggiunto che si traduce in segnali distinti. Questi segnali sono localizzati con ~ 15 – 27 nm precisione. La tecnica permette per l'imaging multi-colore di singole molecole, per cui il numero di colori è limitato dalla disponibili coloranti membrana permeabile e il repertorio di enzimi con etichetta automatica. Per determinare la localizzazione dell'enzima di controllo di qualità (Pten) mostreremo la fattibilità della tecnica-indotta della chinasi 1 (PINK1) in diversi compartimenti mitocondriali durante l'elaborazione in relazione alle altre proteine di membrana. Il test per vere interazioni fisiche tra proteine diversamente con etichetta singole di singola molecola FRET o co-rilevamento è limitato, però, perché i gradi d'etichettatura Bassi diminuiscono la probabilità di avere due proteine adiacenti con l'etichetta allo stesso tempo. Mentre la tecnica è forte per l'imaging di proteine nei compartimenti di membrana, nella maggior parte dei casi non è opportuno determinare la localizzazione delle proteine solubili altamente mobile.

Analisi di imaging e colocalizzazione di multi-colore può contribuire a determinare la localizzazione sub-organellari delle proteine. Abbiamo dimostrato questo in precedenza con la fosfatasi citosolica e tensin omologo, PINK1, che ha diverse sedi sub-mitocondriali dovute alla sua lavorazione da proteasi mitocondriale17. PINK1 è un fattore importante, garantendo la funzionalità mitocondriale34,35. Per determ...

Qui, presentiamo un protocollo per la localizzazione di multi-colore delle proteine di membrana singola in organelli delle cellule vive. Per allegare fluorofori, proteine self-etichettatura sono usate. Proteine, trova in scomparti di diverse membrane dell'organello stesso, possono essere localizzati con una precisione di ~ 18 nm.

Microscopia di multi-colore localizzazione delle proteine di membrana singola in organelli delle cellule di mammiferi dal vivo

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a ...

Questa tecnica può rispondere a domande chiave nei processi regolatori, come il ruolo che la dinamica e l'organizzazione delle proteine svolgono nell'adattamento funzionale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere eseguita in cellule viventi, rivelando così la dinamica delle proteine a livello di singola molecola. Sebbene questo metodo sia stato originariamente implementato per fornire informazioni sull'organizzazione spazio-temporale delle proteine di membrana mitocondriali, può essere applicato anche ad altri organelli e ad altre proteine di membrana.A dimostrare la tecnica sarà Timo Appelhans, uno studente laureato del mio laboratorio. Dopo aver trasfettato e preparato i campioni cellulari e il microscopio secondo il protocollo di testo, montare il campione preparato con perline fluorescenti nel supporto del campione tra l'anello in PTFE e l'anello di gomma rossa. Avviare il microscopio, tutti i componenti hardware e tutto il software necessario per la microscopia.Utilizzare un fazzoletto fresco e privo di lanugine spruzzato con isopropanolo per pulire la lente dell'obiettivo e la parte inferiore del vetrino coprioggetti. Quindi posizionare una goccia di olio

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Time-lapse microscopia di marcatori autofagia fluorescente permette il monitoraggio della risposta autofagia dinamica con alta risoluzione temporale. Utilizzando l'autofagia specifico e marcatori di organelli in una combinazione di 3 colori diversi, siamo in grado di seguire il contributo di una proteina di formazione dell'autofagosoma in un contesto spaziale e temporale robusto.

Imaging cellulare dal vivo dei primi autofagia Eventi: Omegasomes e oltre

Dimostriamo l'uso della microscopia di localizzazione per fotoattivazione a fluorescenza (FPALM) per visualizzare simultaneamente più tipi di molecole marcate in fluorescenza all'interno delle cellule. Le tecniche descritte producono la localizzazione di migliaia o centinaia di migliaia di singole proteine marcate con fluorescenza, con una precisione di decine di nanometri all'interno di singole cellule.

Imaging multicolore simultaneo di strutture biologiche con microscopia di localizzazione con fotoattivazione a fluorescenza

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire un'analisi quantitativa del livello di associazione di membrana plasmatica per etichetta fluorescente marginalmente-collegata della proteina. Il metodo si basa sulla decomposizione computazionale della membrana e citoplasmatico componente del segnale osservato in cellule identificate con marcatore fluorescente della membrana plasmatica.

Determinazione della membrana plasmatica di partizionamento per marginalmente-associated Proteins

Questo articolo fornisce una guida passo-passo per studiare le dinamiche di localizzazione subcellulare delle proteine e per monitorare i cambiamenti morfologici utilizzando la microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione in Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus.

Microscopia a fluorescenza a cellule vive per studiare la localizzazione delle proteine subcellulari e i cambiamenti della morfologia cellulare nei batteri

I coniugati BODIPY convenzionali possono essere utilizzati per la microscopia per la localizzazione a singola molecola a cellule vive (SMLM) attraverso lo sfruttamento dei loro dimeri di stato del suolo con formazione transitoria e spostata verso il rosso. Vi presentiamo un protocollo SMLM ottimizzato per tracciare e risolvere i lipidi neutri subcellulari e gli acidi grassi nelle cellule viventi di mammiferi e lieviti alla scala nanoscopica della lunghezza.

Convenzionale BODIPY Coniugato per la microscopia a super-risoluzione a celle vive e il tracciamento a singola molecola

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro per la propagazione, la differenziazione e la colorazione di cellule SH-SY5Y in coltura e neuroni ippocampali primari di ratto per la visualizzazione e l'analisi dell'ultrastruttura mitocondriale utilizzando la microscopia a deplezione di emissione stimolata (STED).

Utilizzo dell'imaging STED su cellule vive per visualizzare l'ultrastruttura della membrana interna mitocondriale in modelli di cellule neuronali

Questo protocollo descrive un meccanismo per l'utilizzo della microscopia ottica ed elettronica correlativa per visualizzare l'interazione di mitocondri e lisosomi marcati rispettivamente con mEosEM e APEX2.

Microscopia correlativa a luce ed elettronica a due colori per la visualizzazione delle interazioni tra mitocondri e lisosomi

Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata di come creare campioni per il tracciamento a singola proteina in bistrati lipidici supportati da solidi. Spiega anche un microscopio a fluorescenza semplice con sensibilità a singola molecola e un frame rate elevato. Infine, delineiamo la procedura per estrarre traiettorie a singola proteina.

Tracciamento di singole proteine nei bilayer lipidici tramite microscopia a fluorescenza

Questo protocollo descrive l'espressione e la quantificazione delle sottounità dei recettori neuronali dell'acetilcolina nicotinica utilizzando la linea cellulare Neuro-2a dei mammiferi. I tag fluorescenti sensibili al pH e la microscopia confocale permettono una valutazione precisa della localizzazione dei recettori nella membrana plasmatica rispetto a quelli espressi nei compartimenti intracellulari a pH neutro, facilitando lo studio del traffico e della modulazione farmacologica della nAChR.

Localizzazione della membrana plasmatica e dei recettori intracellulari dell'acetilcolina nicotinica tramite imaging quantitativo nelle cellule di mammiferi

Questo protocollo descrive la marcatura a singolo anticorpo (SAL) per risolvere l'organizzazione spaziale su scala nanometrica delle proteine della membrana plasmatica. Sfruttando le interazioni cumulative anticorpo-epitopo a livello di singola molecola, il SAL di membrana (mSAL) mappa le distribuzioni locali degli epitopi catturando contemporaneamente il comportamento di legame degli anticorpi nell'ambiente cellulare nativo.

Microscopia di localizzazione a singola molecola delle proteine di membrana utilizzando la marcatura a singolo anticorpo

Scopri la localizzazione multicolore di singole proteine di membrana in organelli cellulari di mammiferi vivi. Questa tecnica raggiunge una risoluzione di circa 18 nm per studiare la dinamica proteica.

Microscopia di multi-colore localizzazione delle proteine di membrana singola in organelli delle cellule di mammiferi dal vivo

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