Name: Imaging multicolore simultaneo di strutture biologiche con microscopia di localizzazione con fotoattivazione a fluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-09T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 51 s
Description: Impara la microscopia FPALM per l'imaging multicolore di proteine con precisione nanometrica in cellule fisse o vive. Questa tecnica supera il limite di diffrazione per studiare la localizzazione molecolare.

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Gli autori desiderano ringraziare Philip Andresen, Matthew Parent e Sean Carter per la programmazione informatica, l'assistenza tecnica e le utili conversazioni e Pat Byard per l'assistenza amministrativa. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH Career Award K25-AI65459, NIH R15 GM094713, NSF MRI CHE-0722759, Maine Technology Institute MTAF 1106 e 2061 e dal Maine Economic Improvement Fund.

<ol><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+Opt.+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic Opt. reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Sci. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biological+structures+with+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Nat. Protoc. 4, 291-308 (2009).</li>
<li>Gould, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+molecular+positions+and+anisotropies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of molecular positions and anisotropies.</a> Nat. Methods. 5, 1027-1030 (2008).</li>
<li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat Meth. 5, 527-529 (2008).</li>
<li>Kanchanawong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+architecture+of+integrin-based+cell+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat%22%5BJournal%5D)">Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions.</a> Nat. 468, 580-584 (2010).</li>
<li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3125-3130 (2009).</li>
<li>Huang, B., Wang, W. Q., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+Opt.+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic Opt. reconstruction microscopy.</a> Sci. 319, 810-813 (2008).</li>
<li>Hess, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clustered+distribution+of+hemagglutinin+resolved+at+40+nm+in+living+cell+membranes+discriminates+between+raft+theories%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamic clustered distribution of hemagglutinin resolved at 40 nm in living cell membranes discriminates between raft theories.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17370-17375 (2007).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nat. Methods. 5, 417-423 (2008).</li>
<li>Sengupta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+protein+heterogeneity+in+the+plasma+membrane+using+PALM+and+pair+correlation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis.</a> Nat. Methods. 8, 969-975 (2011).</li>
<li>Shroff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+superresolution+imaging+of+genetically+expressed+probes+within+individual+adhesion+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dual-color superresolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20308-20313 (2007).</li>
<li>Bock, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+far-field+fluorescence+nanoscopy+based+on+photoswitchable+emitters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+B%22%5BJournal%5D)">Two-color far-field fluorescence nanoscopy based on photoswitchable emitters.</a> Appl. Phys. B. 88, 161-165 (2007).</li>
<li>Bossi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+far-field+fluorescence+nanoscopy+through+isolated+detection+of+distinct+molecular+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Multicolor far-field fluorescence nanoscopy through isolated detection of distinct molecular species.</a> Nano Lett. 8, 2463-2468 (2008).</li>
<li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+Imaging+of+Multiple+Fluorescent+Proteins+with+Highly+Overlapping+Emission+Spectra+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Superresolution Imaging of Multiple Fluorescent Proteins with Highly Overlapping Emission Spectra in Living Cells.</a> Biophys. J. 101, 1522-1528 (2011).</li>
<li>Wilmes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple-Color+Super-Resolution+Imaging+of+Live+Cells%3A+Resolving+Submicroscopic+Receptor+Organization+in+the+Plasma+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Triple-Color Super-Resolution Imaging of Live Cells: Resolving Submicroscopic Receptor Organization in the Plasma Membrane.</a> Angewandte Chemie Int. Ed. 51, 4868-4871 (2012).</li>
<li>Gudheti, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+mediates+the+nanoscale+membrane+organization+of+the+clustered+membrane+protein+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Actin mediates the nanoscale membrane organization of the clustered membrane protein influenza hemagglutinin.</a> Biophys. J. , (2013).</li>
<li>Tanaka, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+molecules+mobile+even+after+chemical+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Membrane molecules mobile even after chemical fixation.</a> Nat. Methods. 7, 865-866 (2010).</li>
<li>Beisker, W., Dolbeare, F., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+immunocytochemical+procedure+for+high-sensitivity+detection+of+incorporated+bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">An improved immunocytochemical procedure for high-sensitivity detection of incorporated bromodeoxyuridine.</a> Cytometry. 8, 235-239 (1987).</li>
<li>Koehler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Method+of+Illumination+for+Photomicrographical+Purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">New Method of Illumination for Photomicrographical Purposes.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 Forthcoming.</li>
<li>Self, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+of+Spherical+Gaussian+Beams%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Focusing of Spherical Gaussian Beams.</a> Appl. Opt. 22, 658-661 (1983).</li>
<li>Annibale, P., Scarselli, M., Greco, M., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+factors+affecting+co-localization+precision+for+quantitative+multicolor+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Nanoscopy%22%5BJournal%5D)">Identification of the factors affecting co-localization precision for quantitative multicolor localization microscopy.</a> Opt. Nanoscopy. 1, (2012).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat. Methods. 8, 1027(2011).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).</li>
<li>Subach, F. V., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromophore+Transformations+in+Red+Fluorescent+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Chromophore Transformations in Red Fluorescent Proteins.</a> Chem. Rev. 112, 4308-4327 (2012).</li>
<li>Simpson-Holley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+link+between+the+actin+cytoskeleton+and+lipid+rafts+during+budding+of+filamentous+influenza+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Virol%22%5BJournal%5D)">A functional link between the actin cytoskeleton and lipid rafts during budding of filamentous influenza virions.</a> Virol. 301, 212-225 (2002).</li>
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<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys. J. 82, 2775-2783 (2002).</li>
<li>Juette, M. F., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Tracking+of+Single+Fluorescent+Particles+with+Submillisecond+Temporal+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution.</a> Nano Lett. 10, 4657-4663 (2010).</li>
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<li>Enderlein, J., Toprak, E., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+effect+on+position+accuracy+of+fluorophore+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Polarization effect on position accuracy of fluorophore localization.</a> Opt Express. 14, 8111-8120 (2006).</li>
<li>Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+three-dimensional+super-resolution+imaging+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells.</a> Nat. Methods. 8, 499-U496 (2011).</li>
<li>Mlodzianoski, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+drift+correction+in+3D+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Sample drift correction in 3D fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Opt Express. 19, 15009-15019 (2011).</li>
<li>Kim, D., Curthoys, N. M., Parent, M., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleed-through+correction+for+rendering+and+correlation+analysis+in+multi-colour+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt%22%5BJournal%5D)">Bleed-through correction for rendering and correlation analysis in multi-colour localization microscopy.</a> J. Opt. , (2013).</li>
</ol>

S.T.H. e M.J.M. detengono brevetti nel campo della microscopia a super-risoluzione. S.T.H. fa parte del comitato consultivo scientifico di Vutara, Inc.

L'imaging a super-risoluzione basato sulla localizzazione offre molte potenti funzionalità per l'imaging biologico. Il percorso dai singoli componenti ottici posizionati sul tavolo a un microscopio funzionale a super-risoluzione in grado di visualizzare simultaneamente più specie fluorescenti in un campione biologico presenta una serie di sfide. Alcuni aspetti dell'allineamento sono più critici di altri; Di seguito ci sforziamo di fornire una guida ai potenziali utenti che affrontano gli aspetti più difficili del percors...

Sebbene esistano strutture cellulari su un'ampia gamma di scale spaziali, l'imaging a fluorescenza dell'organizzazione cellulare su scale di lunghezza inferiori a ~250 nm è limitato nella microscopia convenzionale a causa del vincolo fisico del limite di diffrazione. Questo limite è stato superato con l'avvento della microscopia di localizzazione per fotoattivazione a fluorescenza (FPALM1) e tecniche simili2,3, in grado di localizzare un gran numero di singole molecole con precisione di ~10 nm, per generare immagini con risoluzione di poche decine di nanometri. FPALM si basa sull'utilizzo del controllo ottico per attivare e inattivare sottoinsiemi di molecole (per una descrizione completa di FPALM e istruzioni su come implementare questo sistema di imaging, vedi Gould et al.4). Questa tecnica consente di mappare le distribuzioni spaziali di intere popolazioni di singole molecole, chiarendo così le strutture biologiche su scale di lunghezza che vanno da decine di nanometri a decine di micron. La microscopia a super-risoluzione basata sulla localizzazione (di seguito denominata microscopia di localizzazione) è stata ora adattata per affrontare una serie di questioni biologiche, con sviluppi tecnologici che permettono, ad esempio, l'imaging di singoli orientamenti molecolari con polarizzazione FPALM, o P-FPALM5, l'imaging a fluorescenza di singole molecole in tre dimensioni con Biplane FPALM6 o altre tecniche7-9e l'imaging a fluorescenza a super-risoluzione di singole molecole in cellule viventi10-12. La microscopia di localizzazione è stata applicata anche all'imaging di più specie in cellule fissate13-16. Recentemente, tre specie proteiche sono state visualizzate simultaneamente con FPALM sia in cellule fisse che in cellule viventi17. La microscopia di localizzazione può visualizzare campioni marcati in vari modi: gli esempi includono proteine espresse con tag di fusione PAFP o PSFP, anticorpi o molecole marcate con coloranti organici in gabbia o coloranti organici convenzionali. Mentre l'uso di coloranti fluorescenti convenzionali consente la marcatura delle proteine in assenza di un tag di proteina di fusione, le condizioni generalmente richieste per l'uso di coloranti organici non in gabbia nell'imaging a super-risoluzione richiedono che i campioni siano immersi in tamponi riducenti2. Inoltre, la somministrazione intracellulare di coniugati anticorpo-colorante richiede tipicamente che le cellule siano fissate e le loro membrane permeabilizzate, o richiede che le cellule viventi siano rese permeabili attraverso l'elettroporazione o altri mezzi. I requisiti per la riduzione delle condizioni tampone e la permeabilizzazione della membrana limitano l'idoneità dei coloranti organici per l'imaging di cellule vive, sebbene i recenti sviluppi abbiano consentito un uso efficace di HaloTag e FPALM per l'imaging delle strutture di membrana18.
FPALM è stata la prima tecnica di microscopia di localizzazione ad essere applicata alle cellule vive10. Nelle cellule vive, oltre a fornire una mappa spaziale dipendente dal tempo delle posizioni delle molecole marcate, FPALM può tracciare singole molecole su più fotogrammi e traiettorie molecolari determinate su scale temporali dimillisecondi 19. Pertanto, FPALM fornisce l'accesso a scale temporali abbastanza brevi e risoluzione su scala nanometrica.
Multicolor FPALM può essere utilizzato per una varietà di sonde diverse, comprese proteine fotoattivabili e coloranti organici in gabbia o non in gabbia. Forniamo qui dettagli sul protocollo e sulla configurazione per l'imaging simultaneo di due specie proteiche fluorescenti, Dendra2 e PAmCherry. Riportiamo i risultati dell'imaging PAmCherry coniugato a beta actina (PAmCherry-actin) e Dendra2 coniugato a emoagglutinina influenzale (Dendra2-HA) in fibroblasti NIH-3T3. I componenti descritti nella configurazione possono essere sostituiti con altro hardware più adatto all'imaging di altre sonde. In questo caso, abbiamo cercato di essere espliciti nel testo.
Multicolor FPALM è ideale per riportare le distribuzioni spaziali di più specie proteiche in cellule viventi o fisse. Questa tecnica è particolarmente adatta per studiare relazioni spaziali e/o dinamiche su scale spaziali di lunghezza nanometrica, anche se le immagini riporteranno la localizzazione su una gamma di scale di lunghezza, da decine di nanometri fino a decine di micron. Uno dei principali vantaggi di FPALM multicolore è che la configurazione è relativamente economica da costruire e molto flessibile per l'uso con varie combinazioni di sonde. Il processo di costruzione e calibrazione del sistema a partire dai componenti fornisce anche una notevole comprensione dei fattori che possono compromettere la qualità e l'interpretabilità dei dati, e quindi l'esito della ricerca. Qui descriviamo in dettaglio i metodi per la configurazione ottica, la preparazione del campione e l'acquisizione dei dati di più specie proteiche, con costrutti di fusione PSFP e PAFP, utilizzando FPALM. Sebbene questo protocollo descriva l'analisi delle cellule fissate, queste procedure sono facilmente applicabili all'imaging delle cellule viventi.
La configurazione ottica qui descritta è ideale per l'imaging simultaneo del PSFP Dendra2 e del PAmCherry PAFP. Molte altre sonde possono essere utilizzate per l'imaging multicolore; Tuttavia, i componenti precisi richiesti possono variare, a seconda degli spettri di eccitazione ed emissione delle sonde scelte. Le scelte degli specchi dicroici, dei filtri e delle lunghezze d'onda del laser dovrebbero essere fatte sulla base di queste considerazioni.

<table><tbody><tr><td>Camere LabTek II</td><td>Nunc</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Perline fluorescenti</td><td>Invitrogen</td><td>F-8801</td><td>Perline per calibrazione</td></tr><tr><td>Perline Tetraspeck</td><td>Invitrogen</td><td>T-7279</td><td>Perline a quattro colori per la calibrazione</td></tr><tr><td>Olio da immersione per obiettivo</td><td>Zeiss</td><td>518F</td><td>Olio da immersione per obiettivo ad alta NA (a seconda della scelta dell'obiettivo)</td></tr><tr><td>Acqua HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td> </td></tr><tr><td>Media</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>O Cellgro 10-090</td></tr><tr><td>Antibiotici</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td> </td></tr><tr><td>siero</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30087.03</td><td> </td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td>52887</td><td> </td></tr><tr><td>Optimem I</td><td>GIBCO</td><td>11058-021</td><td> </td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>MPBiomedicals</td><td></td><td> </td>1689149</tr> <tr><td>paraformaldeide</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA433689M</td><td>ATTENZIONE: Tossico</td></tr></tbody></table>

imaging multicolore simultaneo di strutture biologiche con microscopia di localizzazione con fotoattivazione a fluorescenza

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

La microscopia a super risoluzione basata sulla localizzazione può essere applicata per ottenere una mappa spaziale (immagine) della distribuzione di singole molecole marcate in fluorescenza all'interno di un campione con una risoluzione spaziale di decine di nanometri. Utilizzando proteine fluorescenti fotoattivabili (PAFP) o fotocommutabili (PSFP) fuse a proteine di interesse, o coloranti organici coniugati ad anticorpi o altre molecole di interesse, la microscopia di localizzazione della fotoattivazione della fluorescenza (FPALM) può visualizzare simultaneamente più specie di molecole all'interno di singole cellule. Utilizzando il seguente approccio, popolazioni di grandi numeri (da migliaia a centinaia di migliaia) di singole molecole vengono visualizzate in singole cellule e localizzate con una precisione di ~10-30 nm. I dati ottenuti possono essere applicati alla comprensione delle distribuzioni spaziali su scala nanometrica di più tipi di proteine all'interno di una cellula. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è il notevole aumento della risoluzione spaziale: mentre la diffrazione limita la risoluzione a ~200-250 nm nella microscopia ottica convenzionale, FPALM può visualizzare scale di lunghezza più piccole di un ordine di grandezza. Poiché molte ipotesi biologiche riguardano le relazioni spaziali tra diverse biomolecole, la migliore risoluzione di FPALM può fornire informazioni su questioni di organizzazione cellulare che in precedenza erano inaccessibili alla microscopia a fluorescenza convenzionale. Oltre a descrivere in dettaglio i metodi per la preparazione del campione e l'acquisizione dei dati, descriviamo qui la configurazione ottica per FPALM. Un'ulteriore considerazione per i ricercatori che desiderano eseguire la microscopia a super-risoluzione è il costo: le configurazioni interne sono significativamente più economiche della maggior parte delle macchine di imaging disponibili in commercio. I limiti di questa tecnica includono la necessità di ottimizzare l'etichettatura delle molecole di interesse all'interno dei campioni cellulari e la necessità di software di post-elaborazione per visualizzare i risultati. Descriviamo qui l'uso di PAFP e dell'espressione di PSFP per visualizzare due specie proteiche in cellule fissate. Viene anche descritta l'estensione della tecnica alle cellule viventi.

L'emagglutinina (HA) dell'influenza forma ammassi dell'ordine di decine di nanometri fino al micrometro, e questi ammassi colocalizzano in modo variabile con l'actina (Figura 5). Queste distribuzioni spaziali confermano immagini su scala più ampia di queste due proteine28 e la dipendenza delle distribuzioni spaziali dell'HA dall'actina19. Le immagini multicolore ottenute con la tecnica FPALM possono essere ulteriormente utilizzate per descrivere la densità, l'area e il perimetro di ...

Dimostriamo l'uso della microscopia di localizzazione per fotoattivazione a fluorescenza (FPALM) per visualizzare simultaneamente più tipi di molecole marcate in fluorescenza all'interno delle cellule. Le tecniche descritte producono la localizzazione di migliaia o centinaia di migliaia di singole proteine marcate con fluorescenza, con una precisione di decine di nanometri all'interno di singole cellule.

Imaging multicolore simultaneo di strutture biologiche con microscopia di localizzazione con fotoattivazione a fluorescenza

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere immagini di più specie proteiche simultaneamente con precisione nanometrica in cellule fissate o vive. Questo risultato si ottiene innanzitutto regolando la posizione della telecamera e dell'ottica finché un'immagine a fuoco proveniente dal microscopio viene proiettata sul sensore della telecamera. Il secondo passaggio consiste nell'allineare i fasci laser in modo che siano direttamente allineati sul campione posto sul piatto del microscopio.Successivamente, il campione cellulare preparato viene illuminato e viene selezionata una cellula che esprime le proteine desiderate. L'ultimo passaggio consiste nell'acquisire un'immagine della cellula mediante microscopia a localizzazione mediante attivazione fotoindotta della fluorescenza, illuminando il campione con laser e quindi indirizzando la fluorescenza cellulare verso il sensore della telecamera per ottenere un insieme di dati. In definitiva, la microscopia a localizzazione mediante attivazione fotoindotta della fluorescenza viene utilizzata per mostrare la localizzazione di molteplici specie proteiche su scala spaziale nanometrica in cellule fissate o vive, sia in campo c

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Biologia

Imaging multicromatica simultanea di strutture biologiche con microscopia di localizzazione di fotoattivazione della fluorescenza

Questo video descrive BiFC-PALM - una combinazione di microscopia di localizzazione fotoattivata e complementazione a fluorescenza bimolecolare - per valutare le interazioni proteina-proteina. La BiFC prevede la fusione di due frammenti proteici fluorescenti con due proteine di interesse interagenti. Quando le due proteine interagiscono, i frammenti vengono portati in prossimità, il che consente alle due parti di unirsi e ricostituire una proteina fluorescente funzionale. La fluorescenza di un...

Microscopia di localizzazione fotoattivata accoppiata a complementazione a fluorescenza bimolecolare

Masse di tessuto complesse, da organi di tumori, sono composti da vari elementi cellulari. Abbiamo chiarito il contributo di fenotipi cellulari all'interno di un tessuto utilizzando multi-etichettati topi transgenici fluorescenti in combinazione con multiparametrica immunofluorescenza seguita da unmixing spettrale di decifrare origine cellulare e caratteristiche cellulari basati su espressione della proteina.

Quantitative Analysis multispettrali Dopo tessuto fluorescente Trapianto per la visualizzazione delle origini cellulari, tipi e interazioni

Sistemi di suddivisione delle emissioni doppia fotocamera per due colori microscopia a fluorescenza generano in tempo reale sequenze di immagini con risoluzione ottica e temporale eccezionale, un requisito di alcuni saggi cellulari in tempo reale tra cui saggi di adesione cella di flusso piastra paralleli. Quando il software viene utilizzato per unire le immagini provenienti dai canali di emissione acquistati contemporaneamente, sequenze di immagini pseudocolored sono prodotti.

Contemporaneamente Catturare immagini in tempo reale in due canali di emissione Utilizzando un Splitting sistema Dual Camera Emissione: Applications to Cell Adhesion

Le interazioni proteina-proteina vengono visualizzate in cellule con risoluzione spaziale nanometrica combinando la complementazione a fluorescenza bimolecolare (BiFC) con la microscopia a localizzazione fotoattivata (PALM). Qui viene descritto l'uso di BiFC-PALM per l'imaging delle interazioni Ras-Raf nelle cellule U2OS per visualizzare il clustering e la diffusione su scala nanometrica di singoli complessi Ras-Raf.

Fotoattivato localizzazione Microscopia con complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC-PALM)

Abbiamo dimostrato un metodo per l'immagine di molteplici molecole all'interno di nano-strutture eterogenee alla precisione di una singola molecola utilizzando il legame sequenziale e l'eluzione di anticorpi a fluorescenza.

Molto multiplo, la risoluzione super-risoluzione delle celle T utilizzando la madSTORM

Qui, presentiamo un protocollo per la localizzazione di multi-colore delle proteine di membrana singola in organelli delle cellule vive. Per allegare fluorofori, proteine self-etichettatura sono usate. Proteine, trova in scomparti di diverse membrane dell'organello stesso, possono essere localizzati con una precisione di ~ 18 nm.

Microscopia di multi-colore localizzazione delle proteine di membrana singola in organelli delle cellule di mammiferi dal vivo

Qui vi presentiamo una guida pratica di costruzione di un sistema di microscopia integrato, che si fonde imaging epi-fluorescente convenzionale, singola molecola basata sul rilevamento di Super-risoluzione imaging e rilevamento di singola molecola multi-colore, tra cui trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza di singola molecola di imaging, in un set-up in modo efficiente.

Lo svolgimento di diverse modalità di Imaging con un microscopio a fluorescenza

Descriviamo un metodo di colorazione rapida per eseguire l'imaging multispettrale sui tessuti congelati.

Un metodo rapido per l'imaging della fluorescenza multispettrale delle sezioni dei tessuti congelati

Presentiamo un protocollo per l'implementazione della microscopia a riflessione di interferenza e della microscopia a riflessione totale interna-fluorescenza per l'imaging simultaneo di microtubuli dinamici e proteine associate a microtubuli marcati fluorescenti.

Microscopia a fluorescenza a riflessione interna simultanea e riflessione interna totale per l'imaging di microtubuli dinamici e proteine associate

Questo protocollo presenta una guida passo passo per la tecnica microscopica SLAM (Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic), inclusi dettagli su come generare la sorgente di luce laser, preparare un campione di tessuto, condurre l'imaging e analizzare i dati. SLAM fa progredire la microscopia non lineare misurando quattro contrasti complementari privi di marcatura per studiare il microambiente tissutale.

Microscopia multiarmonica simultanea ad autofluorescenza senza marcatura

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro efficiente per l'imaging microscopico di localizzazione a singola molecola di nuclei isolati di Arabidopsis, utilizzando isolamento, fissazione e marcatura ottimizzati per ottenere una visualizzazione affidabile su scala nanometrica della cromatina e della RNA Polimerasi II. Questo approccio può essere facilmente adattato ad altre proteine associate alla cromatina o modifiche agli istoni per immagini ad alta risoluzione.

Un protocollo semplificato per la microscopia di localizzazione a singola molecola nei nuclei di Arabidopsis

Impara la microscopia FPALM per l'imaging multicolore di proteine con precisione nanometrica in cellule fisse o vive. Questa tecnica supera il limite di diffrazione per studiare la localizzazione molecolare.

Imaging multicolore simultaneo di strutture biologiche con microscopia di localizzazione con fotoattivazione a fluorescenza

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