Name: Imaging multicolore simultaneo di strutture biologiche con microscopia di localizzazione con fotoattivazione a fluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-09T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 51 s
Description: Impara la microscopia FPALM per l'imaging multicolore di proteine con precisione nanometrica in cellule fisse o vive. Questa tecnica supera il limite di diffrazione per studiare la localizzazione molecolare.

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Gli autori desiderano ringraziare Philip Andresen, Matthew Parent e Sean Carter per la programmazione informatica, l'assistenza tecnica e le utili conversazioni e Pat Byard per l'assistenza amministrativa. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH Career Award K25-AI65459, NIH R15 GM094713, NSF MRI CHE-0722759, Maine Technology Institute MTAF 1106 e 2061 e dal Maine Economic Improvement Fund.

<ol><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+Opt.+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic Opt. reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Sci. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biological+structures+with+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Nat. Protoc. 4, 291-308 (2009).</li>
<li>Gould, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+molecular+positions+and+anisotropies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of molecular positions and anisotropies.</a> Nat. Methods. 5, 1027-1030 (2008).</li>
<li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat Meth. 5, 527-529 (2008).</li>
<li>Kanchanawong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+architecture+of+integrin-based+cell+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat%22%5BJournal%5D)">Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions.</a> Nat. 468, 580-584 (2010).</li>
<li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3125-3130 (2009).</li>
<li>Huang, B., Wang, W. Q., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+Opt.+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic Opt. reconstruction microscopy.</a> Sci. 319, 810-813 (2008).</li>
<li>Hess, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clustered+distribution+of+hemagglutinin+resolved+at+40+nm+in+living+cell+membranes+discriminates+between+raft+theories%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamic clustered distribution of hemagglutinin resolved at 40 nm in living cell membranes discriminates between raft theories.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17370-17375 (2007).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nat. Methods. 5, 417-423 (2008).</li>
<li>Sengupta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+protein+heterogeneity+in+the+plasma+membrane+using+PALM+and+pair+correlation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis.</a> Nat. Methods. 8, 969-975 (2011).</li>
<li>Shroff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+superresolution+imaging+of+genetically+expressed+probes+within+individual+adhesion+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dual-color superresolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20308-20313 (2007).</li>
<li>Bock, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+far-field+fluorescence+nanoscopy+based+on+photoswitchable+emitters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+B%22%5BJournal%5D)">Two-color far-field fluorescence nanoscopy based on photoswitchable emitters.</a> Appl. Phys. B. 88, 161-165 (2007).</li>
<li>Bossi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+far-field+fluorescence+nanoscopy+through+isolated+detection+of+distinct+molecular+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Multicolor far-field fluorescence nanoscopy through isolated detection of distinct molecular species.</a> Nano Lett. 8, 2463-2468 (2008).</li>
<li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+Imaging+of+Multiple+Fluorescent+Proteins+with+Highly+Overlapping+Emission+Spectra+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Superresolution Imaging of Multiple Fluorescent Proteins with Highly Overlapping Emission Spectra in Living Cells.</a> Biophys. J. 101, 1522-1528 (2011).</li>
<li>Wilmes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple-Color+Super-Resolution+Imaging+of+Live+Cells%3A+Resolving+Submicroscopic+Receptor+Organization+in+the+Plasma+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Triple-Color Super-Resolution Imaging of Live Cells: Resolving Submicroscopic Receptor Organization in the Plasma Membrane.</a> Angewandte Chemie Int. Ed. 51, 4868-4871 (2012).</li>
<li>Gudheti, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+mediates+the+nanoscale+membrane+organization+of+the+clustered+membrane+protein+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Actin mediates the nanoscale membrane organization of the clustered membrane protein influenza hemagglutinin.</a> Biophys. J. , (2013).</li>
<li>Tanaka, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+molecules+mobile+even+after+chemical+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Membrane molecules mobile even after chemical fixation.</a> Nat. Methods. 7, 865-866 (2010).</li>
<li>Beisker, W., Dolbeare, F., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+immunocytochemical+procedure+for+high-sensitivity+detection+of+incorporated+bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">An improved immunocytochemical procedure for high-sensitivity detection of incorporated bromodeoxyuridine.</a> Cytometry. 8, 235-239 (1987).</li>
<li>Koehler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Method+of+Illumination+for+Photomicrographical+Purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">New Method of Illumination for Photomicrographical Purposes.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 Forthcoming.</li>
<li>Self, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+of+Spherical+Gaussian+Beams%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Focusing of Spherical Gaussian Beams.</a> Appl. Opt. 22, 658-661 (1983).</li>
<li>Annibale, P., Scarselli, M., Greco, M., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+factors+affecting+co-localization+precision+for+quantitative+multicolor+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Nanoscopy%22%5BJournal%5D)">Identification of the factors affecting co-localization precision for quantitative multicolor localization microscopy.</a> Opt. Nanoscopy. 1, (2012).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat. Methods. 8, 1027(2011).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).</li>
<li>Subach, F. V., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromophore+Transformations+in+Red+Fluorescent+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Chromophore Transformations in Red Fluorescent Proteins.</a> Chem. Rev. 112, 4308-4327 (2012).</li>
<li>Simpson-Holley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+link+between+the+actin+cytoskeleton+and+lipid+rafts+during+budding+of+filamentous+influenza+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Virol%22%5BJournal%5D)">A functional link between the actin cytoskeleton and lipid rafts during budding of filamentous influenza virions.</a> Virol. 301, 212-225 (2002).</li>
<li>Sternberg, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+Image+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Computer%22%5BJournal%5D)">Biomedical Image Processing.</a> IEEE Computer. , 22-34 (1983).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys. J. 82, 2775-2783 (2002).</li>
<li>Juette, M. F., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Tracking+of+Single+Fluorescent+Particles+with+Submillisecond+Temporal+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution.</a> Nano Lett. 10, 4657-4663 (2010).</li>
<li>Gould, T. J., Hess, S. T. Biophysical Tools for Biologists, Vol 2: In Vivo Techniques. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGould%2C+TJ+%22Methods+Cell+Biol%22">Methods Cell Biol</a>. 89, 329-358 (2008).</li>
<li>Enderlein, J., Toprak, E., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+effect+on+position+accuracy+of+fluorophore+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Polarization effect on position accuracy of fluorophore localization.</a> Opt Express. 14, 8111-8120 (2006).</li>
<li>Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+three-dimensional+super-resolution+imaging+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells.</a> Nat. Methods. 8, 499-U496 (2011).</li>
<li>Mlodzianoski, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+drift+correction+in+3D+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Sample drift correction in 3D fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Opt Express. 19, 15009-15019 (2011).</li>
<li>Kim, D., Curthoys, N. M., Parent, M., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleed-through+correction+for+rendering+and+correlation+analysis+in+multi-colour+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt%22%5BJournal%5D)">Bleed-through correction for rendering and correlation analysis in multi-colour localization microscopy.</a> J. Opt. , (2013).</li>
</ol>

S.T.H. e M.J.M. detengono brevetti nel campo della microscopia a super-risoluzione. S.T.H. fa parte del comitato consultivo scientifico di Vutara, Inc.

L'imaging a super-risoluzione basato sulla localizzazione offre molte potenti funzionalità per l'imaging biologico. Il percorso dai singoli componenti ottici posizionati sul tavolo a un microscopio funzionale a super-risoluzione in grado di visualizzare simultaneamente più specie fluorescenti in un campione biologico presenta una serie di sfide. Alcuni aspetti dell'allineamento sono più critici di altri; Di seguito ci sforziamo di fornire una guida ai potenziali utenti che affrontano gli aspetti più difficili del percors...

Sebbene esistano strutture cellulari su un'ampia gamma di scale spaziali, l'imaging a fluorescenza dell'organizzazione cellulare su scale di lunghezza inferiori a ~250 nm è limitato nella microscopia convenzionale a causa del vincolo fisico del limite di diffrazione. Questo limite è stato superato con l'avvento della microscopia di localizzazione per fotoattivazione a fluorescenza (FPALM1) e tecniche simili2,3, in grado di localizzare un gran numero di singole molecole con precisione di ~10 nm, per generare immagini con risoluzione di poche decine di nanometri. FPALM si basa sull'utilizzo del controllo ottico per attivare e inattivare sottoinsiemi di molecole (per una descrizione completa di FPALM e istruzioni su come implementare questo sistema di imaging, vedi Gould et al.4). Questa tecnica consente di mappare le distribuzioni spaziali di intere popolazioni di singole molecole, chiarendo così le strutture biologiche su scale di lunghezza che vanno da decine di nanometri a decine di micron. La microscopia a super-risoluzione basata sulla localizzazione (di seguito denominata microscopia di localizzazione) è stata ora adattata per affrontare una serie di questioni biologiche, con sviluppi tecnologici che permettono, ad esempio, l'imaging di singoli orientamenti molecolari con polarizzazione FPALM, o P-FPALM5, l'imaging a fluorescenza di singole molecole in tre dimensioni con Biplane FPALM6 o altre tecniche7-9e l'imaging a fluorescenza a super-risoluzione di singole molecole in cellule viventi10-12. La microscopia di localizzazione è stata applicata anche all'imaging di più specie in cellule fissate13-16. Recentemente, tre specie proteiche sono state visualizzate simultaneamente con FPALM sia in cellule fisse che in cellule viventi17. La microscopia di localizzazione può visualizzare campioni marcati in vari modi: gli esempi includono proteine espresse con tag di fusione PAFP o PSFP, anticorpi o molecole marcate con coloranti organici in gabbia o coloranti organici convenzionali. Mentre l'uso di coloranti fluorescenti convenzionali consente la marcatura delle proteine in assenza di un tag di proteina di fusione, le condizioni generalmente richieste per l'uso di coloranti organici non in gabbia nell'imaging a super-risoluzione richiedono che i campioni siano immersi in tamponi riducenti2. Inoltre, la somministrazione intracellulare di coniugati anticorpo-colorante richiede tipicamente che le cellule siano fissate e le loro membrane permeabilizzate, o richiede che le cellule viventi siano rese permeabili attraverso l'elettroporazione o altri mezzi. I requisiti per la riduzione delle condizioni tampone e la permeabilizzazione della membrana limitano l'idoneità dei coloranti organici per l'imaging di cellule vive, sebbene i recenti sviluppi abbiano consentito un uso efficace di HaloTag e FPALM per l'imaging delle strutture di membrana18.
FPALM è stata la prima tecnica di microscopia di localizzazione ad essere applicata alle cellule vive10. Nelle cellule vive, oltre a fornire una mappa spaziale dipendente dal tempo delle posizioni delle molecole marcate, FPALM può tracciare singole molecole su più fotogrammi e traiettorie molecolari determinate su scale temporali dimillisecondi 19. Pertanto, FPALM fornisce l'accesso a scale temporali abbastanza brevi e risoluzione su scala nanometrica.
Multicolor FPALM può essere utilizzato per una varietà di sonde diverse, comprese proteine fotoattivabili e coloranti organici in gabbia o non in gabbia. Forniamo qui dettagli sul protocollo e sulla configurazione per l'imaging simultaneo di due specie proteiche fluorescenti, Dendra2 e PAmCherry. Riportiamo i risultati dell'imaging PAmCherry coniugato a beta actina (PAmCherry-actin) e Dendra2 coniugato a emoagglutinina influenzale (Dendra2-HA) in fibroblasti NIH-3T3. I componenti descritti nella configurazione possono essere sostituiti con altro hardware più adatto all'imaging di altre sonde. In questo caso, abbiamo cercato di essere espliciti nel testo.
Multicolor FPALM è ideale per riportare le distribuzioni spaziali di più specie proteiche in cellule viventi o fisse. Questa tecnica è particolarmente adatta per studiare relazioni spaziali e/o dinamiche su scale spaziali di lunghezza nanometrica, anche se le immagini riporteranno la localizzazione su una gamma di scale di lunghezza, da decine di nanometri fino a decine di micron. Uno dei principali vantaggi di FPALM multicolore è che la configurazione è relativamente economica da costruire e molto flessibile per l'uso con varie combinazioni di sonde. Il processo di costruzione e calibrazione del sistema a partire dai componenti fornisce anche una notevole comprensione dei fattori che possono compromettere la qualità e l'interpretabilità dei dati, e quindi l'esito della ricerca. Qui descriviamo in dettaglio i metodi per la configurazione ottica, la preparazione del campione e l'acquisizione dei dati di più specie proteiche, con costrutti di fusione PSFP e PAFP, utilizzando FPALM. Sebbene questo protocollo descriva l'analisi delle cellule fissate, queste procedure sono facilmente applicabili all'imaging delle cellule viventi.
La configurazione ottica qui descritta è ideale per l'imaging simultaneo del PSFP Dendra2 e del PAmCherry PAFP. Molte altre sonde possono essere utilizzate per l'imaging multicolore; Tuttavia, i componenti precisi richiesti possono variare, a seconda degli spettri di eccitazione ed emissione delle sonde scelte. Le scelte degli specchi dicroici, dei filtri e delle lunghezze d'onda del laser dovrebbero essere fatte sulla base di queste considerazioni.

<table><tbody><tr><td>Camere LabTek II</td><td>Nunc</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Perline fluorescenti</td><td>Invitrogen</td><td>F-8801</td><td>Perline per calibrazione</td></tr><tr><td>Perline Tetraspeck</td><td>Invitrogen</td><td>T-7279</td><td>Perline a quattro colori per la calibrazione</td></tr><tr><td>Olio da immersione per obiettivo</td><td>Zeiss</td><td>518F</td><td>Olio da immersione per obiettivo ad alta NA (a seconda della scelta dell'obiettivo)</td></tr><tr><td>Acqua HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td> </td></tr><tr><td>Media</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>O Cellgro 10-090</td></tr><tr><td>Antibiotici</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td> </td></tr><tr><td>siero</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30087.03</td><td> </td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td>52887</td><td> </td></tr><tr><td>Optimem I</td><td>GIBCO</td><td>11058-021</td><td> </td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>MPBiomedicals</td><td></td><td> </td>1689149</tr> <tr><td>paraformaldeide</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA433689M</td><td>ATTENZIONE: Tossico</td></tr></tbody></table>

imaging multicolore simultaneo di strutture biologiche con microscopia di localizzazione con fotoattivazione a fluorescenza

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

La microscopia a super risoluzione basata sulla localizzazione può essere applicata per ottenere una mappa spaziale (immagine) della distribuzione di singole molecole marcate in fluorescenza all'interno di un campione con una risoluzione spaziale di decine di nanometri. Utilizzando proteine fluorescenti fotoattivabili (PAFP) o fotocommutabili (PSFP) fuse a proteine di interesse, o coloranti organici coniugati ad anticorpi o altre molecole di interesse, la microscopia di localizzazione della fotoattivazione della fluorescenza (FPALM) può visualizzare simultaneamente più specie di molecole all'interno di singole cellule. Utilizzando il seguente approccio, popolazioni di grandi numeri (da migliaia a centinaia di migliaia) di singole molecole vengono visualizzate in singole cellule e localizzate con una precisione di ~10-30 nm. I dati ottenuti possono essere applicati alla comprensione delle distribuzioni spaziali su scala nanometrica di più tipi di proteine all'interno di una cellula. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è il notevole aumento della risoluzione spaziale: mentre la diffrazione limita la risoluzione a ~200-250 nm nella microscopia ottica convenzionale, FPALM può visualizzare scale di lunghezza più piccole di un ordine di grandezza. Poiché molte ipotesi biologiche riguardano le relazioni spaziali tra diverse biomolecole, la migliore risoluzione di FPALM può fornire informazioni su questioni di organizzazione cellulare che in precedenza erano inaccessibili alla microscopia a fluorescenza convenzionale. Oltre a descrivere in dettaglio i metodi per la preparazione del campione e l'acquisizione dei dati, descriviamo qui la configurazione ottica per FPALM. Un'ulteriore considerazione per i ricercatori che desiderano eseguire la microscopia a super-risoluzione è il costo: le configurazioni interne sono significativamente più economiche della maggior parte delle macchine di imaging disponibili in commercio. I limiti di questa tecnica includono la necessità di ottimizzare l'etichettatura delle molecole di interesse all'interno dei campioni cellulari e la necessità di software di post-elaborazione per visualizzare i risultati. Descriviamo qui l'uso di PAFP e dell'espressione di PSFP per visualizzare due specie proteiche in cellule fissate. Viene anche descritta l'estensione della tecnica alle cellule viventi.

L'emagglutinina (HA) dell'influenza forma ammassi dell'ordine di decine di nanometri fino al micrometro, e questi ammassi colocalizzano in modo variabile con l'actina (Figura 5). Queste distribuzioni spaziali confermano immagini su scala più ampia di queste due proteine28 e la dipendenza delle distribuzioni spaziali dell'HA dall'actina19. Le immagini multicolore ottenute con la tecnica FPALM possono essere ulteriormente utilizzate per descrivere la densità, l'area e il perimetro di ...

Dimostriamo l'uso della microscopia di localizzazione per fotoattivazione a fluorescenza (FPALM) per visualizzare simultaneamente più tipi di molecole marcate in fluorescenza all'interno delle cellule. Le tecniche descritte producono la localizzazione di migliaia o centinaia di migliaia di singole proteine marcate con fluorescenza, con una precisione di decine di nanometri all'interno di singole cellule.

Imaging multicolore simultaneo di strutture biologiche con microscopia di localizzazione con fotoattivazione a fluorescenza

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere immagini di più specie proteiche simultaneamente con precisione nanometrica in cellule fissate o vive. Questo risultato si ottiene innanzitutto regolando la posizione della telecamera e dell'ottica finché un'immagine a fuoco proveniente dal microscopio viene proiettata sul sensore della telecamera. Il secondo passaggio consiste nell'allineare i fasci laser in modo che siano direttamente allineati sul campione posto sul piatto del microscopio.Successivamente, il campione cellulare preparato viene illuminato e viene selezionata una cellula che esprime le proteine desiderate. L'ultimo passaggio consiste nell'acquisire un'immagine della cellula mediante microscopia a localizzazione mediante attivazione fotoindotta della fluorescenza, illuminando il campione con laser e quindi indirizzando la fluorescenza cellulare verso il sensore della telecamera per ottenere un insieme di dati. In definitiva, la microscopia a localizzazione mediante attivazione fotoindotta della fluorescenza viene utilizzata per mostrare la localizzazione di molteplici specie proteiche su scala spaziale nanometrica in cellule fissate o vive, sia in campo chiaro sia utilizzando la fluorescenza da riflessione totale interna per isolare una sottile regione del campione.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la microscopia confocale o elettronica, è la possibilità di acquisire immagini di più proteine contemporaneamente con risoluzione nanometrica in cellule fissate o vive. I seguenti passaggi si riferiscono a un sistema di numerazione mostrato qui, che rappresenta uno schema dell'allestimento F Om multicolore fornito come figura uno nel protocollo testuale allegato per allineare il microscopio: iniziare posizionando una scala di calibrazione o un reticolo sullo stage del microscopio con un obiettivo 10x inserito e la lampada impostata per luce trasmessa. Centrare la linea verticale al centro del campo visivo.Successivamente, regolare il microscopio per l'illuminazione critica chiudendo il diaframma del campo e osservando attraverso gli oculari in senso verticale. Se i bordi del diaframma del campo sono fuori fuoco, regolare l'altezza del condensatore finché sia il diaframma del campo che il reticolo risultino a fuoco. Quindi regolare la posizione laterale del diaframma del campo fino a centrarlo rispetto al campo visivo e chiudere il diaframma del campo fino a illuminare soltanto la griglia centrale del reticolo.La prima volta che questi componenti vengono assemblati, regolare le lunghezze dei percorsi di ogni canale in modo che siano uguali. Per realizzare questo progetto, riflettere la luce rossa sul chip della telecamera regolando gli specchi sette e nove e chiudere l'apertura di rilevamento per prevenire sovrapposizioni spaziali tra i due canali. Quindi mettere a fuoco l'immagine del radicale nel canale della luce riflessa e verificare se è anche a fuoco nel canale della luce trasmessa.Se l'immagine nel canale della luce trasmessa non è a fuoco, spostare lo specchio nove finché l'immagine del radicale non risulta a fuoco simultaneamente in entrambi i canali. Iniziare allineando i laser rimuovendo la lente uno dal percorso del laser e bloccando i fasci di attivazione e di lettura. Quindi posizionare una scheda bianca a filo contro lo specchio quattro, aprire lo sportello del microscopio e mettere a fuoco finché l'immagine del radicale non si proietta sulla scheda davanti allo specchio quattro.Successivamente, sbloccare il fascio di lettura e regolare lo specchio uno in modo da centrare il laser di lettura sulle croci del'immagine del radicale presente sullo specchio quattro. Una volta centrato, proiettare l'immagine del radicale sullo specchio cinque e regolare lo specchio quattro finché il fascio non risulta centrato sulle croci dell'immagine dello specchio cinque. Il fascio di lettura ora dovrebbe essere centrato sia su M quattro che su M cinque.Quindi bloccare il fascio di lettura chiudendo l'otturatore uno. Successivamente, proiettare l'immagine del radicale sullo specchio tre. Rimuovere l'espansore del fascio dal percorso del laser e sbloccare il laser di attivazione.Ora regolare lo specchio due per centrare il fascio di attivazione sul crocicchio dell'immagine del radicale presente sullo specchio tre. Una volta centrato, sostituire l'espansore del fascio tra gli specchi due e tre e regolare la posizione dell'espansore del fascio finché il fascio non risulta centrato sul crocicchio dell'immagine del radicale. Sullo specchio tre, proiettare l'immagine del radicale sullo specchio cinque e mettere a fuoco.Utilizzando la manopola di messa a fuoco del microscopio, regolare l'angolo del primo specchio dicromatico finché il fascio di attivazione non risulta centrato sull'immagine redle. Quindi bloccare il laser di attivazione chiudendo l'otturatore due, senza obiettivo posizionato e con l'otturatore del microscopio aperto. Aprire l'otturatore del fascio di lettura, ossia l'otturatore uno, e proiettare il laser attraverso l'apertura posteriore del microscopio.Regolare lo specchio cinque finché il fascio non esce dal microscopio, in modo che il fascio emerga verticalmente dal microscopio con la lente uno e l'obiettivo nuovamente in posizione. Posizionare un campione contenente bromo B a 100 micromolari sulla piastra con il laser di attivazione bloccato. Proiettare il laser di lettura attraverso un obiettivo 60x e all'interno del colorante.Con il guadagno di moltiplicazione degli elettroni disabilitato. Invia questa immagine alla fotocamera. Successivamente, metti a fuoco l'obiettivo all'interno del campione.Aprire l'apertura in modo sufficientemente ampio da consentire l'acquisizione dell'intero profilo del fascio. Successivamente, spostare lateralmente l'apertura in modo che il centro del profilo del fascio e l'apertura siano concentrici. Utilizzando il software della telecamera, selezionare la regione di interesse in modo da ottenere la più piccola area di lettura della telecamera che racchiuda entrambi i canali e registrare queste coordinate.A questo punto, registrare un'unica immagine per rappresentare il profilo del fascio di lettura. Successivamente, bloccare il laser di lettura chiudendo l'otturatore uno e aprire l'otturatore due. Per iniziare a misurare il profilo del fascio di attivazione, proiettare il laser di attivazione sul campione; se necessario, utilizzare un guadagno a moltiplicazione elettronica inferiore a 100 e regolare il primo specchio dicromatico finché il fascio non risulta centrato in ogni campo visivo.Quindi registrare un'istantanea del profilo del fascio di attivazione per iniziare ad acquisire immagini multicolore di F palm. Eliminare tutta l'illuminazione ambientale. Successivamente, proiettare la lampada a mercurio tramite il supporto girevole sulle cellule transfezionate e sostituire il cubetto del filtro con uno contenente la lunghezza d'onda di eccitazione appropriata dello stato pre-switch fotoinducibile.Una volta scelta una cellula, abbassare il supporto girevole per consentire ai laser di passare nel microscopio, quindi ruotare la torretta dei filtri su quella contenente lo specchio dicotroico appropriato per l'acquisizione dell'immagine, come descritto nel protocollo testuale allegato. Proiettare quindi l'immagine sulla telecamera per distinguere le cellule transfezionate dalla fluorescenza di fondo e confermare che le molecole siano fotoattivabili. Illuminare brevemente il campione con una potenza bassa, inferiore a 10 microwatt, proveniente dal laser di attivazione.Successivamente, preparare il software della telecamera per l'acquisizione di serie cinetiche impostando il guadagno a moltiplicazione elettronica a 200 e il numero desiderato di fotogrammi tra cinque e 10.000. Impostare inoltre l'esposizione tra 10 e 30 millisecondi. Quindi bloccare il fascio di attivazione, sbloccare il fascio di lettura e proiettare l'immagine della cellula illuminata sulla telecamera.Scegliere un piano focale vicino alla membrana cellulare inferiore spostando il fuoco verso il basso finché le singole molecole non sono più visibili. Successivamente, spostare gradualmente il fuoco verso l'alto finché le molecole non diventano visibili per la prima volta. A questo punto, rimuovere il blocco del fascio di attivazione e illuminare il campione con un'intensità inferiore a un watt per centimetro quadrato.Iniziare ad acquisire questi dati tramite il software della telecamera, mantenendo una densità compresa tra 0,1 e una molecola fotoabile visibile per micrometro quadrato, regolando dinamicamente il filtro neutro posto davanti al laser di attivazione. Per l'immagine a fluorescenza mediante riflessione totale interna, montare lo specchio cinque e la lente uno su un singolo stadio di traslazione da spostare lateralmente appena dietro l'ingresso del microscopio. Man mano che lo specchio cinque e la lente uno vengono traslati, i laser che escono verso l'alto attraverso il campione dall'obiettivo tenderanno progressivamente a inclinarsi da un lato; continuare a traslare lo stadio fino a quando l'angolo dei laser raggiunge i 90 gradi rispetto alla verticale.A questo punto, il laser emergente scomparirà e il laser in entrata verrà riflesso all'indietro all'interno dell'apertura, viaggiando in senso antiparallelo al fascio in entrata e spostato lateralmente. Si dovrebbe osservare una riduzione del fondo quando il campione entra nella fluorescenza per riflessione totale interna al termine delle acquisizioni delle immagini; chiudere immediatamente lo scatto del microscopio e bloccare entrambi i fasci. Disattivare il guadagno di moltiplicazione elettronica.Impostare la fotocamera per acquisire un singolo fotogramma e regolare la regione di lettura della fotocamera alla dimensione massima. Infine, bloccare un canale posizionando una scheda su F tre o F quattro con un filtro passa-alto montato sulla lampada del microscopio. Illuminare il campione e proiettare questa immagine sulla fotocamera.Registrare un'immagine della cellula per rappresentare l'intera cellula in luce trasmessa. Qui viene mostrato un esempio di acquisizione F palm a due colori di una cellula NIH 3T3 che esprime sia DENDRA2 emagglutinina sia actina PAM Cherry. Il canale trasmesso a sinistra contiene lunghezze d'onda più lunghe rispetto al canale riflesso a destra.Qui vengono mostrate immagini provenienti dalla stessa acquisizione a due colori in microscopia a fluorescenza, a seguito della sottrazione del fondo, della trasformazione e della sovrapposizione dei canali sinistro e destro. È possibile identificare e localizzare singole molecole. Alcune molecole appaiono più brillanti nel canale trasmesso, mentre altre presentano una distribuzione dell'emissione più uniforme tra i due canali.Questo indica la differenza negli spettri di emissione tra PAM cherry e DENDRA due rispettivamente ed è utilizzato nell'analisi per identificare queste due specie. L'istogramma mostrato qui indica il rapporto tra l'intensità del canale rosso trasmesso e l'intensità totale per tutte le molecole localizzate, dopo l'applicazione delle tolleranze. I pixel appaiono bianchi nell'immagine in basso a sinistra e appaiono rossi nell'immagine finale fusa mostrata in basso a destra, mentre quelli nella regione verde sono mostrati come bianchi nell'immagine in alto a destra e appaiono verdi nell'immagine finale fusa mostrata in basso a destra.I livelli di soglia scelti durante la rappresentazione influenzano notevolmente il grado di rumore e l'aspetto della codistribuzione. Qui vengono mostrate tre diverse opzioni di rappresentazione che producono diversi gradi di sovrapposizione; i livelli di soglia più conservativi sono mostrati nei due casi inferiori. Gli istogrammi di colore F palm alpha sono più facili da interpretare quando nell'immagine sono presenti due picchi distinti.Mentre l'istogramma a sinistra è un buon candidato per ulteriori analisi, le immagini risultanti dagli altri due istogrammi saranno molto più difficili da interpretare seguendo questa procedura. Metodi come la microscopia a riflessione totale e l'imaging di cellule vive possono essere eseguiti per rispondere ad altre domande, ad esempio su come le proteine sono organizzate a livello nanometrico nelle membrane delle cellule vive. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come allestire il proprio microscopio FAR e utilizzarlo per acquisire dati.Non dimenticare che lavorare con i laser può essere estremamente pericoloso e che è necessario completare una formazione sulla sicurezza prima di tentare questa procedura.

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