Imaging multicolore simultaneo di strutture biologiche con microscopia di localizzazione con fotoattivazione a fluorescenza

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere immagini di più specie proteiche simultaneamente con precisione nanometrica in cellule fissate o vive. Questo risultato si ottiene innanzitutto regolando la posizione della telecamera e dell'ottica finché un'immagine a fuoco proveniente dal microscopio viene proiettata sul sensore della telecamera. Il secondo passaggio consiste nell'allineare i fasci laser in modo che siano direttamente allineati sul campione posto sul piatto del microscopio.

Successivamente, il campione cellulare preparato viene illuminato e viene selezionata una cellula che esprime le proteine desiderate. L'ultimo passaggio consiste nell'acquisire un'immagine della cellula mediante microscopia a localizzazione mediante attivazione fotoindotta della fluorescenza, illuminando il campione con laser e quindi indirizzando la fluorescenza cellulare verso il sensore della telecamera per ottenere un insieme di dati. In definitiva, la microscopia a localizzazione mediante attivazione fotoindotta della fluorescenza viene utilizzata per mostrare la localizzazione di molteplici specie proteiche su scala spaziale nanometrica in cellule fissate o vive, sia in campo chiaro sia utilizzando la fluorescenza da riflessione totale interna per isolare una sottile regione del campione.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la microscopia confocale o elettronica, è la possibilità di acquisire immagini di più proteine contemporaneamente con risoluzione nanometrica in cellule fissate o vive. I seguenti passaggi si riferiscono a un sistema di numerazione mostrato qui, che rappresenta uno schema dell'allestimento F Om multicolore fornito come figura uno nel protocollo testuale allegato per allineare il microscopio: iniziare posizionando una scala di calibrazione o un reticolo sullo stage del microscopio con un obiettivo 10x inserito e la lampada impostata per luce trasmessa. Centrare la linea verticale al centro del campo visivo.

Successivamente, regolare il microscopio per l'illuminazione critica chiudendo il diaframma del campo e osservando attraverso gli oculari in senso verticale. Se i bordi del diaframma del campo sono fuori fuoco, regolare l'altezza del condensatore finché sia il diaframma del campo che il reticolo risultino a fuoco. Quindi regolare la posizione laterale del diaframma del campo fino a centrarlo rispetto al campo visivo e chiudere il diaframma del campo fino a illuminare soltanto la griglia centrale del reticolo.

La prima volta che questi componenti vengono assemblati, regolare le lunghezze dei percorsi di ogni canale in modo che siano uguali. Per realizzare questo progetto, riflettere la luce rossa sul chip della telecamera regolando gli specchi sette e nove e chiudere l'apertura di rilevamento per prevenire sovrapposizioni spaziali tra i due canali. Quindi mettere a fuoco l'immagine del radicale nel canale della luce riflessa e verificare se è anche a fuoco nel canale della luce trasmessa.

Se l'immagine nel canale della luce trasmessa non è a fuoco, spostare lo specchio nove finché l'immagine del radicale non risulta a fuoco simultaneamente in entrambi i canali. Iniziare allineando i laser rimuovendo la lente uno dal percorso del laser e bloccando i fasci di attivazione e di lettura. Quindi posizionare una scheda bianca a filo contro lo specchio quattro, aprire lo sportello del microscopio e mettere a fuoco finché l'immagine del radicale non si proietta sulla scheda davanti allo specchio quattro.

Successivamente, sbloccare il fascio di lettura e regolare lo specchio uno in modo da centrare il laser di lettura sulle croci del'immagine del radicale presente sullo specchio quattro. Una volta centrato, proiettare l'immagine del radicale sullo specchio cinque e regolare lo specchio quattro finché il fascio non risulta centrato sulle croci dell'immagine dello specchio cinque. Il fascio di lettura ora dovrebbe essere centrato sia su M quattro che su M cinque.

Quindi bloccare il fascio di lettura chiudendo l'otturatore uno. Successivamente, proiettare l'immagine del radicale sullo specchio tre. Rimuovere l'espansore del fascio dal percorso del laser e sbloccare il laser di attivazione.

Ora regolare lo specchio due per centrare il fascio di attivazione sul crocicchio dell'immagine del radicale presente sullo specchio tre. Una volta centrato, sostituire l'espansore del fascio tra gli specchi due e tre e regolare la posizione dell'espansore del fascio finché il fascio non risulta centrato sul crocicchio dell'immagine del radicale. Sullo specchio tre, proiettare l'immagine del radicale sullo specchio cinque e mettere a fuoco.

Utilizzando la manopola di messa a fuoco del microscopio, regolare l'angolo del primo specchio dicromatico finché il fascio di attivazione non risulta centrato sull'immagine redle. Quindi bloccare il laser di attivazione chiudendo l'otturatore due, senza obiettivo posizionato e con l'otturatore del microscopio aperto. Aprire l'otturatore del fascio di lettura, ossia l'otturatore uno, e proiettare il laser attraverso l'apertura posteriore del microscopio.

Regolare lo specchio cinque finché il fascio non esce dal microscopio, in modo che il fascio emerga verticalmente dal microscopio con la lente uno e l'obiettivo nuovamente in posizione. Posizionare un campione contenente bromo B a 100 micromolari sulla piastra con il laser di attivazione bloccato. Proiettare il laser di lettura attraverso un obiettivo 60x e all'interno del colorante.

Con il guadagno di moltiplicazione degli elettroni disabilitato. Invia questa immagine alla fotocamera. Successivamente, metti a fuoco l'obiettivo all'interno del campione.

Aprire l'apertura in modo sufficientemente ampio da consentire l'acquisizione dell'intero profilo del fascio. Successivamente, spostare lateralmente l'apertura in modo che il centro del profilo del fascio e l'apertura siano concentrici. Utilizzando il software della telecamera, selezionare la regione di interesse in modo da ottenere la più piccola area di lettura della telecamera che racchiuda entrambi i canali e registrare queste coordinate.

A questo punto, registrare un'unica immagine per rappresentare il profilo del fascio di lettura. Successivamente, bloccare il laser di lettura chiudendo l'otturatore uno e aprire l'otturatore due. Per iniziare a misurare il profilo del fascio di attivazione, proiettare il laser di attivazione sul campione; se necessario, utilizzare un guadagno a moltiplicazione elettronica inferiore a 100 e regolare il primo specchio dicromatico finché il fascio non risulta centrato in ogni campo visivo.

Quindi registrare un'istantanea del profilo del fascio di attivazione per iniziare ad acquisire immagini multicolore di F palm. Eliminare tutta l'illuminazione ambientale. Successivamente, proiettare la lampada a mercurio tramite il supporto girevole sulle cellule transfezionate e sostituire il cubetto del filtro con uno contenente la lunghezza d'onda di eccitazione appropriata dello stato pre-switch fotoinducibile.

Una volta scelta una cellula, abbassare il supporto girevole per consentire ai laser di passare nel microscopio, quindi ruotare la torretta dei filtri su quella contenente lo specchio dicotroico appropriato per l'acquisizione dell'immagine, come descritto nel protocollo testuale allegato. Proiettare quindi l'immagine sulla telecamera per distinguere le cellule transfezionate dalla fluorescenza di fondo e confermare che le molecole siano fotoattivabili. Illuminare brevemente il campione con una potenza bassa, inferiore a 10 microwatt, proveniente dal laser di attivazione.

Successivamente, preparare il software della telecamera per l'acquisizione di serie cinetiche impostando il guadagno a moltiplicazione elettronica a 200 e il numero desiderato di fotogrammi tra cinque e 10.000. Impostare inoltre l'esposizione tra 10 e 30 millisecondi. Quindi bloccare il fascio di attivazione, sbloccare il fascio di lettura e proiettare l'immagine della cellula illuminata sulla telecamera.

Scegliere un piano focale vicino alla membrana cellulare inferiore spostando il fuoco verso il basso finché le singole molecole non sono più visibili. Successivamente, spostare gradualmente il fuoco verso l'alto finché le molecole non diventano visibili per la prima volta. A questo punto, rimuovere il blocco del fascio di attivazione e illuminare il campione con un'intensità inferiore a un watt per centimetro quadrato.

Iniziare ad acquisire questi dati tramite il software della telecamera, mantenendo una densità compresa tra 0,1 e una molecola fotoabile visibile per micrometro quadrato, regolando dinamicamente il filtro neutro posto davanti al laser di attivazione. Per l'immagine a fluorescenza mediante riflessione totale interna, montare lo specchio cinque e la lente uno su un singolo stadio di traslazione da spostare lateralmente appena dietro l'ingresso del microscopio. Man mano che lo specchio cinque e la lente uno vengono traslati, i laser che escono verso l'alto attraverso il campione dall'obiettivo tenderanno progressivamente a inclinarsi da un lato; continuare a traslare lo stadio fino a quando l'angolo dei laser raggiunge i 90 gradi rispetto alla verticale.

A questo punto, il laser emergente scomparirà e il laser in entrata verrà riflesso all'indietro all'interno dell'apertura, viaggiando in senso antiparallelo al fascio in entrata e spostato lateralmente. Si dovrebbe osservare una riduzione del fondo quando il campione entra nella fluorescenza per riflessione totale interna al termine delle acquisizioni delle immagini; chiudere immediatamente lo scatto del microscopio e bloccare entrambi i fasci. Disattivare il guadagno di moltiplicazione elettronica.

Impostare la fotocamera per acquisire un singolo fotogramma e regolare la regione di lettura della fotocamera alla dimensione massima. Infine, bloccare un canale posizionando una scheda su F tre o F quattro con un filtro passa-alto montato sulla lampada del microscopio. Illuminare il campione e proiettare questa immagine sulla fotocamera.

Registrare un'immagine della cellula per rappresentare l'intera cellula in luce trasmessa. Qui viene mostrato un esempio di acquisizione F palm a due colori di una cellula NIH 3T3 che esprime sia DENDRA2 emagglutinina sia actina PAM Cherry. Il canale trasmesso a sinistra contiene lunghezze d'onda più lunghe rispetto al canale riflesso a destra.

Qui vengono mostrate immagini provenienti dalla stessa acquisizione a due colori in microscopia a fluorescenza, a seguito della sottrazione del fondo, della trasformazione e della sovrapposizione dei canali sinistro e destro. È possibile identificare e localizzare singole molecole. Alcune molecole appaiono più brillanti nel canale trasmesso, mentre altre presentano una distribuzione dell'emissione più uniforme tra i due canali.

Questo indica la differenza negli spettri di emissione tra PAM cherry e DENDRA due rispettivamente ed è utilizzato nell'analisi per identificare queste due specie. L'istogramma mostrato qui indica il rapporto tra l'intensità del canale rosso trasmesso e l'intensità totale per tutte le molecole localizzate, dopo l'applicazione delle tolleranze. I pixel appaiono bianchi nell'immagine in basso a sinistra e appaiono rossi nell'immagine finale fusa mostrata in basso a destra, mentre quelli nella regione verde sono mostrati come bianchi nell'immagine in alto a destra e appaiono verdi nell'immagine finale fusa mostrata in basso a destra.

I livelli di soglia scelti durante la rappresentazione influenzano notevolmente il grado di rumore e l'aspetto della codistribuzione. Qui vengono mostrate tre diverse opzioni di rappresentazione che producono diversi gradi di sovrapposizione; i livelli di soglia più conservativi sono mostrati nei due casi inferiori. Gli istogrammi di colore F palm alpha sono più facili da interpretare quando nell'immagine sono presenti due picchi distinti.

Mentre l'istogramma a sinistra è un buon candidato per ulteriori analisi, le immagini risultanti dagli altri due istogrammi saranno molto più difficili da interpretare seguendo questa procedura. Metodi come la microscopia a riflessione totale e l'imaging di cellule vive possono essere eseguiti per rispondere ad altre domande, ad esempio su come le proteine sono organizzate a livello nanometrico nelle membrane delle cellule vive. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come allestire il proprio microscopio FAR e utilizzarlo per acquisire dati.

Non dimenticare che lavorare con i laser può essere estremamente pericoloso e che è necessario completare una formazione sulla sicurezza prima di tentare questa procedura.