Imaging multicolore simultaneo di strutture biologiche con microscopia di localizzazione con fotoattivazione a fluorescenza

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare più specie proteiche contemporaneamente con precisione nanometrica in cellule fisse o viventi. Ciò si ottiene regolando prima la posizione di una fotocamera e dell'ottica fino a quando un'immagine focalizzata dal microscopio non viene proiettata sul chip della fotocamera. Il secondo passo consiste nel disporre i raggi laser in modo che siano allineati direttamente su un campione sul tavolino del microscopio.

Successivamente, il campione di cellula preparato viene illuminato e viene scelta una cellula che esprime le proteine desiderate. Il passaggio finale consiste nell'visualizzare la cellula con la microscopia di localizzazione di fotoattivazione a fluorescenza illuminando il campione con i laser e quindi dirigendo la fluorescenza cellulare verso il chip della fotocamera per acquisire un set di set di dati. In definitiva, la microscopia di localizzazione con fotoattivazione a fluorescenza viene utilizzata per mostrare la localizzazione di più specie proteiche su scala spaziale nanometrica in cellule fisse o viventi e in campo ampio o quando si utilizza la fluorescenza a riflessione interna totale per isolare una regione sottile del campione.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia confocale o elettronica, è che è possibile visualizzare più proteine contemporaneamente con risoluzione nanometrica in cellule fisse o viventi. I passaggi seguenti si riferiscono a un sistema di numerazione come mostrato qui, che è uno schema per la configurazione F Om multicolore fornita come figura uno nel protocollo di testo allegato per allineare il microscopio Iniziare posizionando una scala di calibrazione o radicale sul tavolino del microscopio con un obiettivo 10 x in posizione e la lampada impostata per la luce trasmessa. Centrare la verticale al centro del campo visivo.

Quindi, regolare il microscopio per l'illuminazione del coer chiudendo l'apertura di campo e guardando attraverso gli oculari in verticale. Se i bordi dell'apertura di campo non sono a fuoco, regolare l'altezza del condensatore fino a quando sia l'apertura di campo che il rosso sono a fuoco. Quindi regolare la posizione laterale dell'apertura del campo fino a quando non è centrata rispetto al campo visivo e chiudere l'apertura del campo fino a quando non si illumina solo la griglia centrale sul redle.

La prima volta che questi componenti vengono assemblati, regolare la lunghezza del percorso di ciascun canale in modo che sia uguale. Per realizzare questo progetto, il redle sul chip della fotocamera regola gli specchi sette e nove e chiude l'apertura di rilevamento per evitare sovrapposizioni spaziali tra i due canali. Quindi mettere a fuoco l'immagine del radicale nel canale della luce riflessa e verificare se è a fuoco anche nel canale della luce trasmessa.

Se l'immagine nel canale della luce trasmessa non è a fuoco, traslare lo specchio nove fino a quando l'immagine radicale non è a fuoco contemporaneamente in entrambi i canali. Iniziare ad allineare i laser rimuovendo la lente uno dal percorso del laser e bloccando i raggi di attivazione e lettura. Quindi posiziona una carta bianca a filo contro lo specchio quattro, apri l'otturatore del microscopio e metti a fuoco fino a quando l'immagine radicale non viene proiettata sulla carta di fronte allo specchio quattro.

Quindi, sblocca il raggio di lettura e regola lo specchio uno per centrare il laser di lettura sul mirino dell'immagine radicale sullo specchio quattro. Una volta centrato, proietta l'immagine radicale sullo specchio cinque e regola lo specchio quattro fino a quando il raggio non è centrato sul mirino dell'immagine dello specchio cinque. Il raggio di lettura dovrebbe ora essere centrato sia su M quattro che su M cinque.

Quindi bloccare il raggio di lettura chiudendo l'otturatore uno. Quindi, proietta l'immagine radicale sullo specchio tre. Rimuovere l'espansore del raggio dal percorso del laser e sbloccare il laser di attivazione.

Ora regola lo specchio due per centrare il raggio di attivazione sul mirino dell'immagine radicale sullo specchio tre. Una volta centrato, sostituire l'espansore del raggio tra gli specchi due e tre e regolare la posizione dell'espansore del raggio fino a quando il raggio non è centrato sul mirino dell'immagine radicale. Sullo specchio tre, proietta l'immagine radicale sullo specchio cinque e metti a fuoco.

Utilizzando la manopola di messa a fuoco del microscopio, regolare l'angolo dello specchio dicroico numero uno fino a quando il raggio di attivazione non è centrato sull'immagine rossa. Quindi bloccare l'attivazione del laser chiudendo l'otturatore due senza obiettivo in posizione e l'otturatore del microscopio aperto. Aprire l'otturatore di lettura e proiettare il laser attraverso l'apertura posteriore del microscopio.

Regolare lo specchio cinque finché il raggio non esce dal microscopio, in modo che il raggio esca dal microscopio verticalmente con la lente uno e l'obiettivo di nuovo in posizione. Posizionare un campione contenente 100 micromolari di bromo B sul tavolino con il laser di attivazione bloccato. Proiettare il laser di lettura attraverso un obiettivo 60 x e nel colorante.

Con il guadagno di moltiplicazione degli elettroni disabilitato. Invia questa immagine alla fotocamera. Quindi, focalizzare l'obiettivo nel campione.

Aprire l'apertura abbastanza ampia da consentire l'imaging del profilo dell'intero raggio. Quindi traslare lateralmente l'apertura in modo che il centro del profilo del fascio e l'apertura siano concentrici. Utilizzando il software della fotocamera, scegliere la regione di interesse per consentire la più piccola regione di lettura della telecamera che incapsula entrambi i canali e registrare queste coordinate.

A questo punto, registrare una singola istantanea per rappresentare il profilo del raggio di lettura. Quindi, bloccare il laser di lettura chiudendo l'otturatore uno e aprendo l'otturatore due. Per iniziare a misurare il profilo del raggio di attivazione, proiettare il laser di attivazione sul campione, se necessario, utilizzare un guadagno moltiplicatore di elettroni inferiore a 100 e regolare il primo specchio dicroico fino a quando il raggio non è centrato in ciascun campo visivo.

Quindi registrare un'istantanea del profilo del raggio di attivazione per iniziare ad acquisire immagini multicolore del palmo F. Elimina tutta l'illuminazione della stanza. Quindi proiettare la lampada al mercurio tramite la montatura flip su celle trasfettate e sostituire il cubo del filtro con uno contenente la lunghezza d'onda di eccitazione appropriata del pre interruttore foto. Stato.

Una volta scelta una cella, spostare la montatura ribaltabile verso il basso per consentire ai laser di passare nel microscopio, cambiare la torretta del filtro con quella contenente lo specchio dicroico appropriato per l'imaging come descritto nel protocollo di testo allegato. Quindi proietta questa immagine sulla fotocamera per distinguere le cellule trasfettate dalla fluorescenza di fondo e per confermare che le molecole sono fotocapaci. Illuminare brevemente il campione con una bassa potenza inferiore a 10 microwatt dal laser di attivazione.

Successivamente, preparare il software della fotocamera per l'acquisizione in serie cinetica impostando il gioco di moltiplicazione degli elettroni su 200 e il numero di fotogrammi desiderato tra cinque e 10.000. Impostare inoltre l'esposizione tra 10 e 30 millisecondi. Quindi bloccare il raggio di attivazione, sbloccare il raggio di lettura e proiettare l'immagine della cella illuminata sulla telecamera.

Scegli un piano focale vicino alla membrana cellulare inferiore spostando la messa a fuoco verso il basso fino a quando le singole molecole non sono più visibili. Quindi sposta gradualmente la messa a fuoco verso l'alto fino a quando le molecole diventano visibili per la prima volta. Ora sblocca il raggio di attivazione e illumina il campione con meno di un watt per centimetro quadrato di intensità.

Inizia ad acquisire questi dati attraverso il software della fotocamera mantenendo una densità di 0,1 a una molecola fotovisibile per micron quadrato regolando dinamicamente il filtro a densità neutra davanti al laser di attivazione. Per la fluorescenza a riflessione interna totale, la montatura per immagini è a specchio cinque e la lente uno su un unico tavolino di traslazione da spostare lateralmente proprio dietro l'ingresso del microscopio. Man mano che lo specchio cinque e la lente uno vengono traslati, i laser che escono dall'obiettivo verso l'alto attraverso il campione si inclineranno gradualmente da un lato, continuando a traslare il tavolino fino a quando l'angolo dei laser raggiunge i 90 gradi dalla verticale.

A questo punto, il laser emergente stesso svanirà e il laser in arrivo tornerà riflesso nell'apertura viaggiando in modo antiparallelo al raggio in arrivo e spostato lateralmente. Al termine delle acquisizioni delle immagini, si dovrebbe notare una riduzione dello sfondo quando il campione entra in fluorescenza a riflessione interna totale, chiudere immediatamente l'otturatore del microscopio e bloccare entrambi i raggi. Disabilita il guadagno di moltiplicazione degli elettroni.

Impostare la fotocamera per registrare un fotogramma e impostare la regione di lettura della fotocamera sulla dimensione massima. Infine, bloccare un canale posizionando una scheda su F tre o F quattro con un filtro passa lungo montato sulla lampada del microscopio. Illumina il campione e proietta questa immagine sulla fotocamera.

Registra un'istantanea della cella per rappresentare l'intera cella in luce trasmessa. Qui è mostrato un esempio di acquisizione di un palmo F a due colori di una cellula NIH a tre cellule T che esprimono sia DENDRA due emoagglutinina che PAM Cherry actina. Il canale trasmesso a sinistra contiene lunghezze d'onda più lunghe rispetto al canale riflesso a destra.

Qui sono mostrate le istantanee della stessa acquisizione F OM a due colori che seguono lo sfondo, la sottrazione e la trasformazione per sovrapporre i canali sinistro e destro. Le singole molecole possono essere identificate e localizzate. Alcune molecole appaiono più luminose nel canale trasmesso e alcune hanno una distribuzione più uniforme dell'emissione tra i due canali.

Questo indica la differenza negli spettri di emissione tra la ciliegia PAM e la DENDRA due rispettivamente e viene utilizzato in analisi per identificare queste due specie. L'istogramma mostrato qui indica un rapporto tra l'intensità del canale di trasmissione del rosso diviso per l'intensità totale per tutte le molecole localizzate dopo l'applicazione delle tolleranze. I pixel appaiono bianchi nell'immagine in basso a sinistra e appaiono rossi nell'immagine finale unita mostrata in basso a destra, mentre quelli nella regione verde vengono visualizzati come bianchi nell'immagine in alto a destra e appaiono verdi nell'immagine finale unita mostrata in basso a destra.

I livelli di soglia scelti durante il rendering influiscono notevolmente sul grado di disturbo e sull'aspetto della colocalizzazione. Mostrato. Di seguito sono riportate tre diverse opzioni per il rendering che comportano vari gradi di smarginatura attraverso i livelli di soglia più conservativi mostrati nelle due parti inferiori. Gli istogrammi alfa del palmo F a colori sono i migliori da interpretare quando ci sono due picchi distinguibili nell'immagine.

Mentre l'istogramma a sinistra è un buon candidato per ulteriori analisi, le immagini risultanti dagli altri due istogrammi saranno molto più difficili da interpretare Seguendo questa procedura. Metodi come la riflessione interna totale, la microscopia e l'imaging di cellule vive possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande come il modo in cui le proteine sono organizzate su scala nanometrica nelle membrane cellulari viventi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come configurare il tuo microscopio FAR e usarlo per acquisire dati.

Non dimenticare che lavorare con i laser può essere estremamente pericoloso e che la formazione sulla sicurezza dovrebbe essere completata prima di tentare questa procedura.