Patterning cellulare su fotolitograficamente Definito parylene-C: SiO 2 Substrati

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di modellare le celle sui servizi di biossido di silicio secondo un design sottostante predefinito della paralina. Ciò si ottiene creando prima una maschera fotografica del modello desiderato. Il secondo passaggio consiste nell'ossidare e quindi rivestire un wafer di silicio con paralina.

Successivamente, i processi fotolitografici eseguiti in una camera bianca di microelettronica vengono utilizzati per incidere selettivamente il rivestimento paraline per rivelare il design desiderato. Il passaggio finale consiste nell'attivare i chip utilizzando prima l'acido piranha e quindi incubare nel siero di vitello fetale per tre-12 ore, dopodiché è possibile applicare una sospensione cellulare per la coltura. In definitiva, il patterning cellulare può essere valutato mediante imaging di cellule vive utilizzando un microscopio da dissezione o dopo la fissazione utilizzando la microscopia a fluorescenza confocale.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto a diverse piattaforme di patterning cellulare esistenti è che non è necessario portare agenti biologici nella camera bianca. Inoltre, i chip del modello possono essere conservati a tempo indeterminato fino a quando non vengono attivati prima con par acido e poi con il siero. Per progettare la configurazione C paralinea desiderata, utilizzare un pacchetto software per l'editor di layout in grado di leggere, scrivere e scrivere due file CIF o GDS.

Esternalizzare il produttore di maschere fotografiche a un impianto di microelettronica appropriato o realizzarlo internamente. Se esistono strutture, ossidare un wafer di silicio in un forno orizzontale atmosferico a 950 gradi Celsius per 40 minuti per produrre uno strato di biossido di silicio a 200 nanometri. Successivamente, conferma lo spessore con un piccolo punto.

Riflettometro spettroscopico. Posizionare i wafer nel sistema di deposizione sottovuoto, applicare il promotore di adesione sinusoidale all'interno del coperchio della camera. Durante il ciclo di pump down, il promotore di adesione sinusoidale riveste la paralina di carico del wafer ossidato nella paralina C del deposito del forno a temperatura ambiente a una velocità di 1,3 nanometri per milligrammo di dimero utilizzando un sistema di deposizione sotto vuoto.

Successivamente, depositare il promotore di adesione HMDS sul wafer rivestito di paraline. Utilizzando un sistema di rivestimento con fotoresist adatto, centrifugare il wafer a 4.000 giri/min per 30 secondi applicando un fotoresist positivo per ottenere uno spessore di un micron utilizzando il sistema di rivestimento con fotoresist, quindi cuocere delicatamente il wafer per 60 secondi a 90 gradi Celsius. Ora inserisci sia il wafer che la maschera fotografica prefabbricata in un allineatore di maschere.

Esporre il wafer rivestito di fotoresist con luce UV in modo da trasferire il modello desiderato nel fotoresist. Successivamente, cuocere il wafer esposto per 60 secondi a 110 gradi Celsius. Quindi rimuovere tutto il fotoresist esposto dal wafer sviluppandolo in una soluzione di sviluppo appropriata a Hoff, la paralina non protetta, utilizzando un sistema di incisione al plasma di ossigeno per rivelare il biossido di silicio sottostante.

Quindi conservare le patatine dopo averle tagliate a dadini in scatole prive di polvere fino al momento del bisogno. In questa procedura, rimuovere il fotoresist residuo dai trucioli lavando con un acetone per 10 secondi. Quindi sciacquarli in H2O distillato deionizzato tre volte, preparare l'acido piranha fresco in una cappa acida dopo, pulire e incidere le patatine immergendole in acido piana per 10 minuti.

Quindi sciacquare i chip tre volte in H2O deionizzato e trasferirli in una piastra di coltura sterile in una cappa di coltura tissutale a flusso laminare. Attivare i chip per la modellazione cellulare inserendo due chip per pozzetto in una piastra a sei pozzetti. Successivamente, aggiungi due millilitri di siero fetale bovino in modo da immergere completamente tutte le patatine.

Incubare le patatine nel siero per tre-12 ore a 37 gradi Celsius. Ora rimuovi i chip dalla loro soluzione di attivazione. Lavare una volta per 10 secondi nella soluzione salina bilanciata di Hank.

Quindi posizionare i chip in un pozzetto di coltura e placcare il tipo di cellula scelto come sospensione nel suo solito terreno di coltura. La densità ottimale della placcatura delle celle dipende sia dal tipo di cella che dal modello geometrico della paralina C sul chip. Una densità di cinque volte 10 per la quarta cellula per millilitro è un punto di partenza sensato.

L'imaging è adattato alla motivazione sottostante per il patterning cellulare, ma il comportamento delle cellule vive può essere facilmente valutato utilizzando un microscopio da dissezione e una fotocamera digitale con una lente relè adatta. Ecco l'imaging su cellule vive di cellule HEC 2 93 coltivate su biossido di silicio C paralina dopo tre giorni. In vitro, le navi erano state incubate per tre ore in siero fetale bovino e le cellule erano state piastrate in sospensione a una concentrazione di cinque volte 10 per quarto di cellule per millilitro.

La paralina C favorisce l'adesione cellulare mentre il biossido di silicio nudo respinge le cellule. Questa figura mostra le immagini in immunofluorescenza di cellule staminali primarie derivate dal glioma umano cresciute su vari modelli di paralina C su biossido di silicio. Qui lo schema illustra il design reticolare della paralina, la micrografia a fluorescenza di cellule fissate colorate per la proteina acida fibrillare gliale e la micrografia a luce di cellule vive sullo stesso chip.

Ecco un'immagine fluorescente che illustra le cellule colorate con GFAP su un diverso design della paralinea e l'immagine della riflettanza del nodo nel design della paralina a raggi. E questa figura mostra l'imaging di tre cellule T e tre L 1 coltivate su biossido di silicio C paralina. Dopo quattro giorni in vitro, i chip erano stati attivati per tre ore nel siero fetale bovino e le cellule erano state piastrate in sospensione a una concentrazione di cinque volte 10 delle quarte cellule per millilitro.

In questo caso, la piattaforma non consente il patterning con le celle che diventano ugualmente confluenti nelle regioni di Lene C e biossido di silicio. Quando si esegue questo protocollo, è importante ricordare che l'attivazione del siero deve avvenire immediatamente dopo il trattamento con i piranha. In caso contrario, il processo di creazione dei modelli viene compromesso.

Non dimenticare che lavorare con l'acido piranha può essere estremamente pericoloso. Prepara e usa l'acido piranha in una cappa chimica e assicurati di indossare occhiali, camici da laboratorio e guanti adeguati.