Name: Patterning cellulare su fotolitograficamente Definito parylene-C: SiO 2 Substrati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Scopri il patterning cellulare su substrati SiO₂ con parylene-C mediante fotolitografia. Questo metodo consente il controllo dell'adesione cellulare senza agenti biologici in clean room.

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Questo lavoro è stato supportato da una Wellcome Trust Clinical PhD fellowship (ECAT).

1. Fabbricazione di Patterns parilene su SiO 2: Flusso di processo (vedi figura 1) <ol><li> Disegno desiderato configurazione parylene-C utilizzando un pacchetto software editor di layout, in grado di leggere / scrivere CIF (Caltech forma intermedia) o file GDS-II (Database Graphic System-II). CIF e GDS-II sono formati di file standard di settore per la disposizione del materiale illustrativo circuito integrato. </li><li> Maschera photo Commissione produzione di un impianto di microelettronica appropriate, o fare in casa se esistono strutture. </li><li> Ossidare un wafer di silicio in un forno orizzontale atmosferica (H 2 1.88 SLM e O 2 1.25 SLM) a 950 ° C per 40 minuti per produrre un 200 nm SiO 2 strati (spessore terminare con una piccola macchia spettroscopica riflettometro). </li><li> Prime wafer ossidato con un promotore di adesione silano. Ora depositare parylene-C a 22 ° C ad una velocità di 1.298 nm / mg di dimero utilizzando un sistema di deposizione sotto vuoto creato appositamente per depositare parylene. A 100Rivestimento parylene-C spessore nm è stato usato per tutti gli esempi riportati di seguito. </li><li> Prossimo deposito esametildisilazano (HMDS) promotore di adesione sul wafer parylene rivestite di un sistema idoneo rivestimento foto-resist. </li><li> Ora ruotare il wafer a 4.000 rpm per 30 sec, nell&#39;applicazione positivo foto-resist (risultante in uno spessore teorico di 1 micron), utilizzando lo stesso sistema di rivestimento photoresist come sopra. </li><li> Morbido cuocere il wafer per 60 sec a 90 ° C. </li><li> Inserire sia il wafer e fotomaschera preconfezionati in un allineatore maschera. </li><li> Esporre il wafer photoresist rivestite con una rappresentazione negativa UV della configurazione parylene-C desideri. </li><li> Cuocere wafer esposto per 60 sec a 110 ° C. </li><li> Rimuovere tutti esposti photo-resist dal wafer sviluppando in una soluzione di sviluppo adeguato. </li><li> Etch fuori dal parilene non protetto. Utilizzare un sistema etch plasma di ossigeno (ad una pressione della camera 50 mTorr, 49 sccm O 2, 100 W di potenza RF a 13,56 MHz, euna velocità di incisione di 100 nm / min) per rivelare sottostante SiO 2. </li><li> Tagliare il wafer utilizzando un appropriato sega di suddivisione in piastrine (velocità del mandrino 30.000 rpm, velocità di avanzamento 7 millimetri / sec). </li><li> Sciacquare chips in H 2 O deionizzata e asciugare con azoto. </li><li> Il negozio di chip (a tempo indeterminato) in scatole di polvere libera fino al momento. </li></ol> 2. Chip di pulizia e attivazione: Protocollo <ol><li> Rimuovere photoresist residuo da trucioli mediante lavaggio in acetone per 10 sec. </li><li> Sciacquare con acqua deionizzata distillata H 2 O 3x. </li><li> Portare acido Piranha fresco (un rapporto di 05:03 di 30% di perossido di idrogeno e 98% di acido solforico). ATTENZIONE: Preparare acido piranha con grande cura. È un ossidante estremamente potente, è fortemente acido, e mescolando perossido di idrogeno con acido solforico è una reazione esotermica. Eseguire questa fase in una cappa di acido. Lasciare due minuti per passare dopo la miscelazione l&#39;acido piranha ma utilizzano meno di 20 min. </li><li> Patatine pulite e etch per immersione in piL&#39;acido ranha per 10 min. </li><li> Sciacquare chip 3x in H 2 O deionizzata e trasferire ad un piatto di coltura sterile. </li><li> Ora attivare chip per patterning cellulare. Ad esempio, aggiungere due chip per pozzetto di una piastra da 6 pozzetti e poi aggiungere 2 ml di siero fetale bovino in modo da immergere completamente tutti i chip. Eseguire questa, e tutte le fasi successive di coltura cellulare, in condizioni sterili in una cappa di coltura tissutale a flusso laminare. </li><li> Incubare chip nel siero per 3-12 ore a 37 ° C. NOTA: I passaggi 2,4-2,7 devono essere eseguiti in sequenza e senza ritardi tra i passaggi. Se l&#39;attivazione del siero viene ritardata da ≥ 24 ore dopo il piranha-trattamento, patterning cellulare è compromessa a causa della ridotta repulsione cellulare da SiO 2 regioni. Soluzioni di attivazione alternativa contenenti proteine ​​di adesione cellulare specifici possono essere utilizzati al posto di siero fetale bovino. Tali soluzioni alterano le caratteristiche di adesione cellulare dei due substrati contrastanti (cfr. risultati rappresentativi per un esempio). </li&gt; </ol> 3. Placcatura Linee Cellulari On-chip: Protocollo <ol><li> Rimuovere il chip dalla loro soluzione di attivazione e lavare una volta per 10 secondi in soluzione salina bilanciata di Hank. </li><li> Posizionare circuito integrato in una cultura ben e piastra tipo di cellula scelto come sospensioni in terreni di crescita usuale. Ottimale densità di placcatura cella dipende sia dal tipo di cellula e disegno geometrico di parylene-C on-chip. Una densità di 5 x 10 4 cellule / ml è un punto di partenza ragionevole. </li><li> Imaging è su misura per la motivazione di fondo per patterning cellulare, ma il comportamento cellulare diretta può essere facilmente valutata utilizzando un microscopio da dissezione e una fotocamera digitale con una lente relay adatto. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Immersione di chip in acido piranha non serve solo a rimuovere qualsiasi materiale organico residuo, ma anche attacca le superfici di substrato. Questa è la chiave per consentire l&#39;attivazione efficace con siero fetale bovino. In caso contrario, impedisce cellula-patterning e profondamente altera il comportamento delle cellule on-chip. Non vi è alcun obbligo di sterilizzare i chip dopo la pulizia con acido piranha. Infatti sterilizzazione mediante raggi UV ha dimostrato di minare patterning cellulare in modo dose-dipendente 13. Bisogna fare attenzione a lavare tutto photoresist residuo dopo il processo fotolitografico. Persistenza fotosensibile può agire come strato cito-adesivo indesiderato che sostituisce patterning dettata da parylene-C/SiO 2 geometria. L&#39;acetone è efficace quando si utilizza il processo fotolitografico descritto sopra e con i reagenti specificati. Tuttavia, altri tipi di photoresist possono richiedere un solvente diverso. Per valutare l&#39;impatto e il successo della different fasi di fabbricazione, l&#39;angolo di contatto dei due substrati contrastanti possono essere misurati. figura 2 illustra le alterazioni che si verificano durante il processo di attivazione chip. È probabile, tuttavia, che adesivo specifico e componenti proteiche repulsive nel siero definitiva abilitare il chip parilene-modellata per esercitare le rispettive caratteristiche cito-adesive o cito-repellente. Tutti i risultati rappresentativi utilizzati chips con uno spessore parylene di 100 nm, se abbiamo modellato con successo utilizzando sia più spessi e sottili strati parilene. È importante sottolineare che questa tecnica di incisione fotolitografica permette un maggiore controllo tridimensionale della configurazione parylene quello illustrato qui. Ad esempio, utilizzando una combinazione di fotomaschere, è possibile creare aree parylene di spessore misto. Questo apre la strada alla creazione di colture cellulari con definito topografia tridimensionale, andando oltre la semplice dettare le regioni di adesione cellulare / repulSion, potenzialmente offre un mezzo per integrare canali microfluidica nel costrutto. Come mostrato, tuttavia, questa piattaforma patterning non è universalmente efficace di tutti i tipi di cellule. Diverse linee cellulari, con i loro vari profili molecola di adesione cellulare, ovviamente si comportano diversamente quando coltivate su questa piattaforma. Non abbiamo ancora identificato i componenti chiave nel siero, né i recettori delle cellule membrana gratuiti, che sono alla base di questa piattaforma cellula-patterning. In questo modo in futuro promette di ampliare la sua utilità e specificità. Ad esempio, una linea cellulare di &#39;non-patterning&#39; potrebbe essere geneticamente modificato per esprimere la molecola di adesione necessaria e quindi promuovere patterning.

La comprensione dei meccanismi che determinano l&#39;adesione cellulare e patterning su materiali sintetici è importante per applicazioni come ingegneria dei tessuti, la scoperta di farmaci, e la fabbricazione di biosensori 1-3. Molte tecniche sono disponibili e in continua evoluzione, ogni approfittando dei fattori biologici, chimici e fisici che influenzano una miriade di adesione cellulare. Qui, descriviamo una tecnica di cell-patterning che utilizza i processi, inizialmente sviluppati per scopi di fabbricazione microelettroniche. Come tale, la piattaforma è ben posizionato per consentire l&#39;integrazione a valle delle tecnologie microelettroniche, come MEA, nella piattaforma patterning. L&#39;interfaccia tra una membrana cellulare ed un materiale adiacente è bidirezionale e complesso. In vivo, proteine ​​della matrice extracellulare forniscono la struttura e la forza e l&#39;impatto sul comportamento cellulare tramite interazione con recettori di adesione cellulare. Analogamente le cellule in vitro interagire con substrati sintetici via strati assorbite delle proteine ​​4, mentre le influenze fisico-chimiche anche modulano l&#39;adesione. Per esempio, una superficie polimerica può essere reso più &quot;bagnabile&quot; (idrofilo) da ioni o irradiazione di luce ultravioletta, o incisione mediante trattamento con acido o idrossido 5. Modalità stabilite per patterning cellulare approfittare di questi e di altri mediatori di adesione cellulare. Gli esempi includono la stampa a getto d&#39;inchiostro 6, microcontact stampaggio 7, immobilizzazione fisica 8, 9 microfluidica, manipolazione in tempo reale 10 e selettiva patterning assemblaggio molecolare (SMAP) 11. Ognuno ha vantaggi e limitazioni specifiche. Un fattore chiave nel nostro lavoro, tuttavia, è quello di integrare patterning cellulare con sistemi microelettromeccanici (MEMS). MEMS riferiscono a estremamente piccoli dispositivi meccanici azionati elettricamente. Questo si sovrappone con la scala nanometrica equivalente, nanoelectromechSistemi anical. Questo concetto è diventato pratica solo quando le strategie di semiconduttori hanno consentito di fabbricazione che si terrà alla microscala. Tecniche di microfabbricazione sviluppate originariamente per elettronica dei semiconduttori sono state inavvertitamente trovato utile per altri usi quali elettrofisiologia cellulare, per esempio. Un obiettivo a valle fondamentale è quello di combinare tali tecnologie microelettroniche con un processo di patterning cellulare ad alta fedeltà (formando un dispositivo bioMEMS). Diverse tecniche cell-patterning esistenti e comunque affidabili e pratici sono incompatibili con questa idea. Ad esempio, l&#39;allineamento preciso delle eventuali microelettronica o biosensori embedded è fondamentale per la loro efficacia, ma è estremamente difficile da realizzare utilizzando una tecnica come timbratura a microcontatto. Per aggirare questo problema, stiamo lavorando su una piattaforma patterning basata su 2 SiO che utilizza fotolitograficamente stampato parilene-C. Fotolitografia comporta il trasferimento delle caratteristiche geometriche dauna maschera di un substrato mediante illuminazione UV. Una maschera è stata progettata con un adeguato programma di progettazione assistita da computer. Su una lastra di vetro, un sottile strato di cromo non trasparente rappresenta il disegno geometrico desiderato (risoluzione caratteristica di 1-2 mm è possibile). Il substrato deve essere modellato è rivestita con un sottile strato di photoresist (un polimero UV-sensitive). Il polimero rivestito viene poi allineato e portato in stretto contatto con la maschera. Una fonte UV viene applicato in modo tale che le aree non protette sono irradiati e quindi diventa solubile ed estraibile nella successiva fase di sviluppo, lasciando una rappresentazione parylene-C del modello di maschera dietro. Questo processo ha avuto origine durante lo sviluppo di dispositivi a semiconduttore. Come tale, wafer di silicio sono frequentemente utilizzati come substrato. Deposizione fotolitografica di parylene-C su SiO 2 è quindi un processo semplice e affidabile che si svolge abitualmente in strutture camera bianca microelettronici. Mentre parylene hadiverse caratteristiche desiderabili bioingegneria (chimicamente inerte, non bio-degradabile), un fattore limitante l&#39;uso diretto patterning cellulare è la sua adesività delle cellule innato poveri, attribuito in parte alla sua estrema idrofobicità. Tuttavia, parylene-C è stato usato in precedenza indirettamente per patterning cellulare, per esempio come modello cellulare pelabile 12,13. Questo approccio è limitata dalla scarsa risoluzione e richiede più passaggi. Il processo qui descritto invece utilizza un passo etch acido, seguito da incubazione del siero, per garantire che le regioni parylene-C diventano cellula-adesivo, attraverso una combinazione di riduzione idrofobicità e siero proteina legante. Il risultato finale è una costruzione composta da due substrati diversi, che, dopo l&#39;attivazione biologica, manifestano rispettive caratteristiche cito-adesivo o cito-repellente e quindi rappresenta una piattaforma picchiettare cella efficace. È importante sottolineare che non vi è alcuna necessità di introdurre ag biologicagenitori nella struttura camera bianca come i substrati fantasia possono essere conservati a tempo indefinito prima dell&#39;uso (dopo di che vengono attivati ​​con siero fetale bovino o un&#39;altra soluzione di attivazione). Questa piattaforma parylene-C/SiO 2 patterning è quindi un buon candidato per una coalizione con i componenti MEMS, i processi di fabbricazione così strettamente rispecchiano quelli utilizzati per la fabbricazione microelettronica.

<table><tbody><tr><td>Pacchetto software per l'editor di layout</td><td>CleWin 5.0 di WieWeb</td><td></td><td>In grado di leggere/scrivere file CIF o GDS-II. Utilizzato per creare un design in parylene per la produzione di maschere fotografiche. http://www.wieweb.com/ns6/index.html</td></tr><tr><td>Maschera fotografica su misura</td><td>Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scozia</td><td></td><td>O fabbricare internamente di strutture esistono o commissionare. www.compugraphics-photomasks.com</td></tr><tr><td>3 in wafer di silicio</td><td>Siltronix, Archamps, Francia</td><td></td><td>http://www.siltronix.com</td></tr><tr><td>Forno orizzontale atmosferico</td><td>Sandvik</td><td></td><td>Per ossidare il wafer di silicio. http://www.mrlind.com</td></tr><tr><td>Riflettoscopico spettroscopico a piccoli punti</td><td>Nanometria</td><td></td><td>Per misurare la profondità dello strato di biossido di silicio. www.nanometrics.com/</td></tr> <tr><td>Promotore di adesione del silano</td><td>Merck Chemicals</td><td>1076730050</td><td>Preapplicato al wafer per favorire la deposizione di parilene. www.merck-chemicals.de/</td></tr> <tr><td>Parylene-C</td><td>Ultra Electronics</td><td></td><td>www.ultra-cems.com</td></tr><tr><td>Unità di deposizione SCS Labcoter 2, modello PDS2010</td><td>SCS Equipment, Surrye, Regno Unito</td><td>Modello PDS2010</td><td></td></tr> <tr><td>promotore di adesione www.scscoatings.com/ Esametiltililazano (HMDS)</td><td>SpiChem</td><td></td><td>www.2spi.com</td></tr><tr><td>Sistema di tracciamento automatizzato per l'erogazione di fotoresist su wafer; 3 in pista di fotoresist</td><td>SVG (silicon Valley Group)</td><td></td><td>Sistema di binario automatizzato per l'erogazione di fotoresist su wafer. Un forno di prima cottura cuoce il wafer ed eroga il promotore di adesione, HMDS. Uno spinner combinato eroga fotoresist. Il forno precotto polimerizza la resistenza.</td></tr><tr><td>Fotoresist</td><td>Rohm & Haas</td><td>SPR350-1.2 fotoresist positivo</td><td>www.rohmhaas.com/</td></tr> <tr><td>MA/BA8 allineatore foto-maschera</td><td>Suss Microtech</td><td></td><td>www.suss.com</td></tr><tr><td>Microchem MF-26A sviluppatore</td><td>Microchem</td><td></td><td>Rimuove le regioni esposte del fotoresist. www.microchem.com</td></tr><tr><td>Sistema di incisione al plasma JLS RIE80</td><td>JLS Designs</td><td></td><td>JLS Rimuove le regioni esposte del parylene. www.jlsdesigns.co.uk</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>DISCO DAD 680 Sega per dadini di wafer</td><td>DISCO Corporation, Giappone</td><td></td><td>www.disco.co.jp</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929-4</td><td>Per lavare via il fotoresist residuo.</td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno al 30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>98% acido solforico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>435589</td><td>www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>10437</td><td>Attivazione chip standard. www.invitrogen.com</td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hank</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>14170</td><td>www.invitrogen.com</td></tr></tbody></table>

patterning cellulare su fotolitograficamente definito parylene-c: sio<sub&gt; 2</sub&gt; substrati

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Piattaforme patterning cellulare supportano gli obiettivi generali di ricerca, come la costruzione di reti predefiniti in vitro neuronali e l&#39;esplorazione di alcuni aspetti centrali della fisiologia cellulare. Per combinare facilmente patterning cellulare con Multi-Electrode Array (MEA) e la base di silicio &#39;lab on a chip&#39; tecnologie, è necessario un protocollo compatibile microfabbricazione. Descriviamo un metodo che utilizza la deposizione del polimero parylene-C su SiO 2 wafer. Fotolitografia consente di patterning accurate e affidabili di parylene-C con risoluzione a livello di micron. Attivazione successiva immersione in siero fetale bovino (o un&#39;altra soluzione attivazione specifica) determina un substrato in cui le cellule coltivate aderiscono, o sono respinti rispettivamente, parylene o SiO 2 regioni. Questa tecnica ha permesso patterning di una vasta gamma di tipi di cellule (comprese le cellule primarie murine ippocampali, HEK 293 linea cellulare, teratocarcinoma neurone umano similelinea cellulare, le cellule granulari del cervelletto di topo primarie e cellule primarie umane di glioma-derivati ​​gambo-like). È interessante notare, tuttavia, la piattaforma non è universale, che riflette l&#39;importanza di molecole di adesione cellula-specifici. Questo processo di patterning cellulare è conveniente, affidabile e soprattutto può essere incorporato in microfabbricazione di serie (produzione di chip) protocolli, aprendo la strada per l&#39;integrazione della tecnologia microelettronica.

Il processo di fotolitografia patterning SiO 2 con parylene-C è illustrato in Figura 1. Una volta preparata, l&#39;attivazione di chip nel siero fetale bovino consente una vasta gamma di tipi di cellule da ripetere in coltura. Il nostro gruppo ha modellato con successo le cellule primarie murine dell&#39;ippocampo 14-16, la linea HEK 293 cellule 17, il teratocarcinoma neurone umano tipo (HNT) linea cellulare 18, granuli cerebellari murine primarie e cellule primarie umane di glioma-derivati ​​gambo-like. Figura 3 illustra robusta patterning di cellule HEK 293 su un modello parylene costituito da nodi circolari con estensioni &quot;a croce&quot;. Attivazione Chip in questo esempio era con siero fetale bovino. Al contrario, la figura 4 illustra il potenziale per aumentare la piattaforma patterning utilizzando soluzioni di attivazione alternativa. Utilizzando una soluzione di albumina di siero bovino (3 mg / ml) e<html> fibronectina (1 mg / ml) in HBSS, il precedente patterning precetto è stata invertita. La Figura 5 illustra un tipo cellulare diverso (una linea di derivazione umana primaria staminali come cellula derivata da un glioma di alto grado). Qui, la geometria del comportamento cellulare impatti modello sottostante, con lo schema mostrato in Figura 4A promozione della crescita delle cellule processo lungo sottile parylene-C ascolti come illustrato nelle Figure 4B e 4C. Alcuni tipi di cellule non fanno del modello quando si utilizza il feto protocollo di attivazione siero bovino stabilito. Figura 6 illustra 3T3 L1 crescita a confluenza con nessuna differenza cito-ripugnante o cito-adesivo distinguibile tra le due regioni parylene-C e SiO. pload/50929/50929fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Schema di flusso che illustra il processo per la fabbricazione di modelli parylene-C su SiO 2. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2.jpg" /> Figura 2. Diagramma di flusso che illustra le variazioni di angolo di contatto per motivi geometrici parylene-C e SiO 2 domini durante le fasi di attivazione chip. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3.jpg" /> Figura 3. Imaging dal vivo di cellule HEK 293 cellule coltivate su parylene-C/SiO 2 dopo tre giorni in vitro. Chips incubate per 3 ore in siero fetale bovino, dopo di che le cellule eranoplaccato in sospensione ad una concentrazione di 5 x 10 4 cellule / ml. Parylene-C favorisce l&#39;adesione delle cellule mentre nudo SiO 2, respinge le cellule. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" target="_blank">cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4.jpg" /> Figura 4. Cellule vive di cellule HEK 293 coltivate su parylene-C/SiO 2 dopo tre giorni in vitro Chips attivate per 3 ore in diverse soluzioni di attivazione razionalizzata:. A: siero fetale bovino, B: vitronectina (1 mg / ml) in HBSS, C: Albumina di siero bovino (3 mg / ml) + vitronectina (1 mg / ml) in HBSS, D: sieroalbumina bovina (3 mg / ml) + fibronectina (156; g / ml) in HBSS. Cellule piastrate erano in sospensione ad una densità di 5 x 10 4 cellule / ml. Si noti come diverso trattamento del chip ha portato un&#39;inversione della precedente dogma patterning, con SiO 2 ora adesivo e parylene-C ripugnante. Parylene-C diametro nodo 250 micron, adattato da Hughes et al. 17 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5.jpg" /> Figura 5. Immagini immunofluorescenza di cellule primarie umane di glioma-derivati ​​gambo simile coltivate su vari modelli di parylene-C su SiO 2 A:. Schematicamente il disegno reticolare parylene mostrato in B e C </strong&gt; B:.. Fluorescenza microscopio di cellule fissate (dopo 4 giorni in vitro) tinto di proteina acidica fibrillare gliale (GFAP) C:. Luce microfotografia di cellule vive sullo stesso chip di D: l&#39;immagine di fluorescenza che illustra le cellule GFAP-colorate su un parylene diversa E il design:.. immagine riflettanza del nodo e ha parlato di design parylene ripreso in D <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6.jpg" /> Figura 6. L&#39;imaging cellulare dal vivo di 3T3 L1 coltivate su parylene-C/SiO 2 dopo quattro giorni in vitro. Chips attivati ​​per 3 ore nel siero fetale bovino dopo wuali cellule sono state piastrate in sospensione (3 x 10 4 cellule / ml). In questo caso, la piattaforma non consente patterning, con le cellule diventando altrettanto confluenti su parylene-C e SiO 2 regioni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo descrive un metodo compatibile microfabbricazione per patterning cellulare su SiO 2. Un disegno predefinito parylene-C è fotolitograficamente stampato su SiO 2 wafer. Dopo l&#39;incubazione con siero (o altra soluzione di attivazione) cellule aderiscono specificamente (e crescere secondo la conformità dei) sottostante parylene-C, pur essendo repulsione per SiO 2 regioni.

Patterning cellulare su fotolitograficamente Definito parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrati

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di disporre le cellule su superfici di biossido di silicio secondo un disegno sottostante predeterminato di paralina. Questo risultato si ottiene innanzitutto creando una maschera fotolitografica del modello desiderato. Il secondo passaggio consiste nell'ossidare e quindi ricoprire una fettuccia di silicio con paralina.I successivi processi di fotolitografia eseguiti in un impianto pulito per microelettronica vengono utilizzati per incidere selettivamente il rivestimento in paralene, rivelando così il disegno desiderato. L'ultimo passaggio consiste nell'attivare i chip prima con acido piranha e poi incubandoli nel siero fetale di vitello per un periodo compreso tra 3 e 12 ore, dopo il quale può essere applicata una sospensione cellulare per la coltura. Infine, il patterning cellulare può essere valutato mediante imaging di cellule vive utilizzando un microscopio stereoscopico oppure dopo fissazione mediante microscopia a fluorescenza confocale.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto a diverse piattaforme esistenti per il patterning cellulare è che non è necessario introdurre agenti biologici in camera bianca. Inoltre, le chip di patterning possono essere conservate indefinitamente fino all'attivazione con prima acido parafosforico e poi siero. Per progettare la configurazione desiderata di paraline C, utilizzare un software editor di layout in grado di leggere e scrivere file CIF o GDS due.Esternalizzare la produzione della maschera fotografica a un'apposita struttura microelettronica oppure realizzarla in sede. Se le strutture sono disponibili, ossidare una wafer di silicio in un forno orizzontale atmosferico a 950 gradi Celsius per 40 minuti al fine di produrre uno strato di biossido di silicio spesso 200 nanometri. Successivamente, verificare lo spessore in un piccolo punto.Reflectometro spettroscopico. Posizionare le wafer nel sistema di deposizione sotto vuoto e applicare il promotore di adesione sine all'interno del coperchio della camera. Durante il ciclo di pompaggio, il promotere di adesione sine ricopre il carico di wafer ossidate, depositando paraline C nel forno a temperatura ambiente, a un tasso di 1,3 nanometri per milligrammo di dimero, utilizzando un sistema di deposizione sotto vuoto.Dopo aver depositato il promotore di adesione HMDS sul wafer rivestito con paralina, utilizzare un'apposita sistema di rivestimento con resist foto-sensibile e far ruotare il wafer a 4.000 giri al minuto per 30 secondi, applicando nel contempo un resist foto-sensibile positivo al fine di ottenere uno spessore di un micron mediante il sistema di rivestimento con resist foto-sensibile; successivamente effettuare una cottura soft del wafer per 60 secondi a 90 gradi Celsius. A questo punto, inserire sia il wafer che la maschera fotolitografica prefabbricata in un allineatore di maschere.Esporre la wafer rivestita con photoresist alla luce UV in modo da trasferire il pattern desiderato nel photoresist. Successivamente, cuocere la wafer esposta per 60 secondi a 110 gradi Celsius. Poi rimuovere tutto il photoresist esposto dalla wafer sviluppandolo in una soluzione sviluppatrice appropriata, seguito dall'eliminazione della paralina non protetta mediante un sistema di incisione al plasma di ossigeno per rivelare il biossido di silicio sottostante.Quindi conservare le chip dopo il taglio in contenitori privi di polvere fino al momento dell'utilizzo. In questo procedimento, rimuovere il photoresist residuo dalle chip lavandole con acetone per 10 secondi. Successivamente risciacquarle tre volte con H2O deionizzata e distillata, preparare quindi l'acido piranha fresco in una cappa da acidi e infine pulire ed etcheggiare le chip immergendole nell'acido piranha per 10 minuti.Quindi risciacquare le chip tre volte in H2O deionizzata e trasferirle in una piastra sterile per colture in un'appaio di coltura laminare. Attivare le chip per il patterning cellulare posizionando due chip per pozzetto in una piastra a sei pozzetti. Successivamente, aggiungere due millilitri di siero fetale bovino in modo da immergere completamente tutte le chip.Incubare le lamelle nel siero per tre-dodici ore a 37 gradi Celsius. A questo punto rimuovere le lamelle dalla loro soluzione di attivazione. Lavare una volta per 10 secondi in soluzione salina equilibrata di Hank.Quindi posizionare i chip in una pozzetta di coltura e seminare il tipo cellulare scelto come sospensione nel relativo mezzo di crescita abituale. La densità ottimale di semina cellulare dipende sia dal tipo cellulare che dal pattern geometrico di paraline C sul chip. Una densità di cinque volte 10 alla quarta cellule per millilitro rappresenta un punto di partenza ragionevole.L'imaging viene adattato alla motivazione sottostante il patterning cellulare, ma il comportamento delle cellule vive può essere facilmente valutato utilizzando un microscopio stereoscopico e una fotocamera digitale dotata di un obiettivo di raccordo adeguato. Qui viene mostrato l'imaging in tempo reale di cellule HEC 2 93 coltivate su biossido di silicio paraline C dopo tre giorni. In vitro, le piastre erano state incubate per tre ore in siero fetale bovino, e le cellule erano state seminate in sospensione a una concentrazione di cinque volte 10 alla quarta cellule per millilitro.Paraline C promuove l'adesione cellulare, mentre il biossido di silicio nudo respinge le cellule. Questa figura mostra immagini di immunofluorescenza di cellule staminali simili a cellule staminali derivate da glioma umano primario coltivate su diversi modelli di paraline C su biossido di silicio. Qui lo schema illustra il disegno reticolare di paraline C, la microfotografia a fluorescenza di cellule fissate colorate per la proteina acida fibrillare gliale e la microfotografia in luce di cellule vive sullo stesso chip.Questa è un'immagine fluorescente che illustra le cellule colorate per GFAP su un diverso disegno di paraline e l'immagine di riflettanza del nodo in un disegno di paraline a raggi. Questa figura mostra l'immagine in tempo reale di tre cellule T tre L uno coltivate su diossido di silicio di paraline C. Dopo quattro giorni in vitro, i chip erano stati attivati per tre ore in siero fetale bovino e le cellule erano state seminate in sospensione a una concentrazione di cinque volte 10 alla quarta cellule per millilitro.In questo caso, la piattaforma non consente un patterning uniforme poiché le cellule diventano ugualmente confluenti sulle regioni di Lene C e di biossido di silicio. Eseguendo questo protocollo, è importante ricordare che l'attivazione con siero deve avvenire immediatamente dopo il trattamento con piranha. L'eventuale omissione comprometterebbe il processo di patterning.Ricordate che lavorare con l'acido piranha può essere estremamente pericoloso. Preparate e utilizzate l'acido piranha in una cappa chimica e assicuratevi di indossare occhiali protettivi, camici da laboratorio e guanti adeguati.

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