La creazione di substrati Patterned bidimensionali per confinamento di proteine ​​e cellule

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di sviluppare un substrato bidimensionale per il controllo dell'assorbimento delle proteine e della crescita cellulare. Ciò si ottiene utilizzando la fotolitografia per fabbricare un master modellato, che viene utilizzato per produrre timbri A-P-D-M-S per la stampa a micro contatto. Come seconda fase, viene preparato il substrato d'oro modellato, che prevede la micro stampa a contatto per produrre un modello con regioni che assorbono e resistono alle proteine.

Successivamente, la proteina e le cellule vengono aggiunte al substrato per visualizzare il modello e studiare. Si ottengono risultati di crescita cellulare e comportamento che mostrano un buon confinamento proteico e cellulare su questi substrati di pattern basati sulla fluorescenza e sulla microscopia a contrasto facciale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi esistenti, come la stampa MicroCon di proteine, è che il monostrato terminato con glicole resiste all'assorbimento di proteine e cellule non specifiche sullo sfondo del modello.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché la corretta tecnica di timbratura deve essere ottimizzata per ogni modello stampato. Per iniziare la preparazione del centro master modellato, il wafer di silicio sullo spin coder e durante la fase iniziale del programma di centrifuga a due cicli, sciacquare il wafer con acetone. Durante la seconda fase del programma di centrifuga, l'acetone evaporerà lasciando un wafer pulito e asciutto all'inizio della centrifuga, applicherà il fotoresist al wafer e quindi centrifugherà utilizzando le condizioni descritte in precedenza.

Cuocere delicatamente il wafer rivestito con fotoresist a 110 gradi Celsius per due minuti utilizzando una piastra riscaldante ad alta uniformità. Prossimo modello fotografico. Il wafer rivestito con fotoresist utilizza un sistema di allineatori a maschera e una maschera appropriata.

Innanzitutto, posizionare il substrato sul carrello dell'aspirapolvere dell'allineatore della maschera. Quindi inserire la maschera nel vassoio del supporto e accendere l'aspirapolvere per tenere la maschera in posizione per confermare un buon contatto tra la maschera e il substrato. Sollevare il substrato fino a quando non incontra la maschera.

Utilizzare l'ottica dell'allineatore per verificare che sia stato effettuato un buon contatto. Infine, accendere la lampada per esporre il substrato alla luce UV attraverso la maschera litografica. Sviluppare il wafer modellato nello sviluppatore per un minuto e 45 secondi con una leggera agitazione.

Sciacquare abbondantemente con acqua deionizzata di grado semiconduttore e asciugare con un flusso di azoto gassoso per lo sviluppo del pattern di controllo utilizzando un microscopio con filtro UV. Inizia questa procedura preparando un indurente per resina 10 a uno in peso. Miscela di sigaro 180 2 completamente.

Coprire la cialda con il motivo fotografico con la miscela in una capsula di Petri usa e getta in un essiccante sottovuoto Degas, il master coperto PDMS fino a quando non sono visibili bolle. Dopo esserti assicurato che il master sia sul fondo del piatto, lascia indurire il timbro in forno a 65 gradi Celsius per 1,5 ore. Quando il timbro PDMS è indurito, ritagliare il timbro dal master e rifilarlo alla dimensione appropriata.

Conservare il timbro in un contenitore coperto con il lato rivolto verso l'alto per proteggerlo da polvere e detriti. Per preparare i substrati per la deposizione del metallo, trattare prima i vetrini rotondi con plasma di ossigeno per 10 minuti. Quindi sciacquare due volte i vetrini coprioggetto con acqua deionizzata, asciugando con il flusso di azoto gassoso tra i risciacqui dopo il risciacquo con acqua, risciacquare due volte con etanolo, asciugando nuovamente con il flusso di azoto gassoso tra i risciacqui.

Utilizzando un sistema di deposizione di fasci di elettroni a tasca moltiplicata, depositare 50 angstrom di titanio seguiti da 150 angstrom d'oro. Non chiudere l'evaporatore tra la deposizione dello strato di titanio e dello strato d'oro. Sciacquare il timbro PDMS con etanolo e asciugarlo accuratamente.

Con azoto gassoso, applicare la soluzione di stampaggio sul timbro goccia a goccia fino a ricoprirlo completamente. Asciugare accuratamente il timbro con azoto gassoso. La stampa a micro contatto del file HEXA Decane dipende dalle caratteristiche del timbro PDMS ed è uno degli aspetti più difficili di questa procedura.

Il successo dello stampaggio richiede lo sviluppo di una buona tecnica che applichi una pressione uniforme. Durante lo stampaggio. Per la stampa convenzionale a micro contatto in aria, premere delicatamente il timbro sul substrato d'oro e lasciare che il monostrato si formi per 15 secondi.

In alternativa, per modelli composti da caratteristiche molto piccole e rapporti d'aspetto elevati, posizionare il substrato d'oro in una capsula di Petri contenente 18,2 mega om di acqua deionizzata, assicurandosi che il substrato sia sommerso. Quindi premere delicatamente il timbro sul substrato d'oro e lasciare che si formi lo strato mono a per 15 secondi. Quindi, sciacquare due volte il substrato stampato con etanolo essiccante con azoto gassoso.

Dopo ogni risciacquo, posizionare il substrato in una capsula di Petri e coprire il substrato con una soluzione di riempimento. Sigillare la pirofila con dei param per evitare l'evaporazione. Lasciare che il monostrato di sfondo si formi al buio per 12-14 ore.

Infine, rimuovere il vetrino coprinte modellato dalla soluzione di riempimento posteriore e risciacquare due volte con etanolo asciugando con azoto gassoso dopo ogni risciacquo. Per applicare le proteine al vetrino coprioggetti modellato, posizionare il vetrino coprioggetto in una piccola capsula di Petri o in una camera di coltura cellulare Coprire con 500 microlitri a un millilitro di soluzione salina tamponata con fosfato delcos. Il DPBS deve coprire completamente il substrato durante l'incubazione delle proteine.

Per garantire una copertura proteica uniforme, aggiungere una soluzione concentrata di proteine al DPBS e miscelare la soluzione pipettandola più volte. Incubare la miscela proteica con il substrato a 37 gradi Celsius per un'ora. Dopo l'incubazione, sciacquare accuratamente il substrato con DPBS per rimuovere le proteine non legate, facendo attenzione a non asciugare il substrato o a farlo passare attraverso l'interfaccia aria-acqua.

Dopo tre risciacqui, aspirare il DPBS. Quindi aggiungere circa 500 microlitri di terreno di coltura cellulare completo per mantenere un substrato umido. Sostituire il terreno di coltura utilizzato per risciacquare il substrato.

Con i terreni freschi, il substrato è ora pronto per la placcatura con le celle. In genere sul substrato vengono placcate da 30 a 200 celle per millimetro quadrato. Questa immagine mostra il timbro A-P-D-M-S visualizzato al microscopio posizionando la caratteristica del timbro con il lato rivolto verso il basso su un vetrino coprioggetti in vetro, la barra della scala è di 100 micrometri.

Una corretta marcatura si traduce in un pattern proteico nitido e chiaro che può essere visualizzato mediante l'applicazione di una proteina marcata in fluorescenza come la fibronectina marcata con LOR 6 47. Il confinamento delle cellule chk one al pattern proteico è mostrato qui. Le barre della scala sono di 100 micrometri in queste immagini.

In alternativa, l'immunoistochimica può essere utilizzata per visualizzare il pattern proteico dopo la fissazione dell'SU. Qui, LOR 3 50 coniugato anticorpo anti laminato viene utilizzato per visualizzare il laminato modellato seminato con E 18 neuroni ippocampali di topo mostrati a quattro giorni in vitro E 18 neuroni ippocampali di topo colorati con MIT tracker red five 80 mostrano che la crescita cellulare è ben confinata al pattern proteico. Sebbene questa tecnica sia facilmente padroneggiabile, possono sorgere diversi problemi comuni, come illustrato da queste preparazioni di substrati di pattern visualizzate dall'assorbimento di fibronectina coniugata LOR 6 47.

L'applicazione di proteine senza una sufficiente miscelazione della soluzione proteica concentrata nella DPBS può portare a modelli proteici irregolari. Una timbratura impropria può portare al trasferimento parziale del modello o al collasso del timbro. Inoltre, l'esposizione all'aria del substrato del modello contenente le proteine assorbite può interrompere il monostrato causando una diminuzione della resistenza.

Sullo sfondo, la modellazione sommersa può produrre modelli con piccole caratteristiche che sono difficili da stampare con la stampa convenzionale a micro contatto e ad aria. Queste due immagini mostrano diverse regioni dello stesso modello stampato con lo stesso timbro PDMS in aria o le linee di supporto dell'acqua deionizzata sono mostrate nell'immagine a sinistra per dimostrare che solo le piccole caratteristiche del modello non sono riuscite a stampare correttamente. Le barre della scala sono 20 micrometri Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 18-24 ore se eseguita correttamente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come fabbricare un substrato per motivi. Produci il timbro A-P-D-M-S. Utilizza la micro stampa a contatto per preparare un substrato d'oro del modello e visualizza questo modello utilizzando proteine e cellule.