Cella Co-cultura Patterning Uso acquose due sistemi monofase

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di modellare direttamente le cellule in ambienti completamente acquosi. Ciò si ottiene sciogliendo prima i polimeri a catena lunga, come il polietilenglicole e la destrina, in provette separate contenenti terreno di coltura cellulare. Il secondo passo consiste nel triplicare l'anice, raccogliere il pellet e risospendere le cellule alla densità di semina desiderata in una o entrambe le soluzioni polimeriche.

Successivamente, le soluzioni polimeriche vengono dispensate su una piastra di coltura cellulare. L'incompatibilità dei due polimeri consente la modellazione spaziale dei due liquidi completamente acquosi. Le celle possono essere incluse in una soluzione polimerica o in entrambe le soluzioni polimeriche per produrre una varietà di modelli.

Il passaggio finale consiste nel rimuovere le soluzioni polimeriche una volta che le cellule sono state lasciate aderire per quattro ore o più e sostituirle con un terreno di coltura. In definitiva, la microscopia a campo chiaro o a fluorescenza può essere utilizzata per confermare il pattern cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la micro stampa a contatto, è che le celle sono modellate in un ambiente completamente acquoso con strumenti semplici come i modelli di micro tubi.

Questo metodo può essere utilizzato per l'ingegneria tissutale per valutare la migrazione cellulare e per studiare la segnalazione pericrina e autocrina da cellula a cellula, dimostrando che le procedure saranno un Abraham, uno studente universitario, e Joshua White, uno studente laureato del laboratorio di Takayama. Inizia sciogliendo i due diversi polimeri nel mezzo specifico che verrà utilizzato nei tuoi esperimenti. In questo esempio, il polietilenglicole, noto anche come PEG e la destrina, nota anche come Dex, hanno pesi molecolari rispettivamente di 35 kilodalton e 500 kilodalton.

Preparare 16 campioni da due millilitri in provette coniche da 15 millilitri, ciascuna con diverse concentrazioni di PEG e dex, simili alla tabella mostrata qui. Per fare ciò, pesare le quantità appropriate di PEG e dex secondo la tabella e mescolarle nel terreno facendole oscillare delicatamente fino a quando entrambi i polimeri non sono completamente disciolti. Questo può richiedere diverse ore dopo che i polimeri sono completamente disciolti.

La soluzione dovrebbe essere torbida. Confermare la separazione di fase centrifugando i campioni a 1000 Gs per cinque minuti. La fase inferiore più densa sarà ricca di dex.

La fase superiore sarà ricca di peg. Quindi, aggiungere lentamente 0,1 millilitri di terreno aggiuntivo alle provette e agitare i campioni per 20 secondi. Quindi centrifugare nuovamente i campioni per verificare la separazione di fase.

La soluzione è limpida dopo che sono stati aggiunti ulteriori volumi di terreno, ripetere questo passaggio aggiungendo altri 0,1 millilitri di terreno mescolando e centrifugando i campioni fino a quando la soluzione diventa limpida e non si separa più in fase. Ciò indica che la soglia del punto critico è stata raggiunta per quella specifica miscela. A questo punto registrare il peso finale di ogni tubo.

Infine, determinare la percentuale di peso per peso dei due polimeri nel punto di separazione frontale. Tracciare la curva nodale del contenitore, posizionando la percentuale di peso per perno di peso sull'asse y e la percentuale di peso per i piani di peso sull'asse X. Questa curva è la soglia di concentrazione per la separazione facciale di PEG e dex in questo mezzo.

Per iniziare il pattern di esclusione delle cellule, preparare soluzioni separate di PEG e dex al doppio dei loro valori di punto critico, come determinato dalla soglia nodale bin. Per questi esperimenti, i deck PEG del 5% in peso e del 12,8% in peso per peso vengono aggiunti al DMEM con il 10% di FBS e l'1% di antibiotici. I tubi sono posizionati su un bilanciere per farli sciogliere completamente.

Successivamente, raccogliere le cellule da utilizzare per il modello di esclusione per questo esperimento, le cellule hela all'80% di confluenza vengono tripizzate utilizzando lo 0,5% di tripsina per tre minuti. Una volta raccolte, contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro, quindi pellettare e risospendere le cellule a 375.000 cellule per millilitro in terreno con l'aggiunta del 5% di PEG. Questa concentrazione produrrà campioni che, una volta coltivati, diventeranno confluenti il giorno successivo.

Successivamente, utilizzando un micropipettatore, erogare 0,5 microlitri di goccioline della soluzione del deck al 12,8% su una piastra asciutta a 96 pozzetti per il pattern di esclusione. Le goccioline Dex possono essere lasciate asciugare in condizioni sterili per un uso successivo. Quindi erogare lentamente 200 microlitri di sospensione di cellule PEG hela nel pozzetto.

Per coprire le goccioline D, è importante coprire prima la gocciolina D con la soluzione PEG prima di riempire le aree circostanti in quanto ciò impedisce che interrompa la gocciolina quando si diffonde attraverso il pozzetto. Una volta che tutti i pozzetti sono stati modellati e seminati con cura, posizionare la piastra di coltura cellulare in un incubatore umidificato. Assicurarsi che la capsula non sia inclinata durante la manipolazione e che sia posizionata su un ripiano livellato dell'incubatrice per evitare di interrompere i modelli dopo che le celle sono state lasciate aderire per 12 ore.

Rimuovere la soluzione PEG e lavare tre volte con 200 microlitri di terreno di coltura per rimuovere eventuali polimeri residui. Quindi aggiungere 200 microlitri di terreno di coltura fresco e rimettere la piastra nell'incubatore. Monitorare periodicamente le colture per osservare la proliferazione cellulare e la migrazione nelle zone di esclusione per iniziare il patterning dell'isola.

Preparare soluzioni con deck PEG al 5% in peso e 12,8% in peso per peso in terreno di coltura cellulare. Raccogli anche le cellule hela da utilizzare per il patterning dell'isola e, ancora una volta, determina il numero totale di cellule disponibili utilizzando un emocitometro. Successivamente pellet e resus.

Far girare le cellule a 5 milioni di cellule per millilitro in terreno. Continuando con il 12,8% di dex, potrebbe essere necessaria una maggiore concentrazione di cellule per raggiungere la confluenza in 24 ore se le cellule non aderiscono bene come le cellule heela. Quindi, pipettare 200 microlitri di soluzione PEG in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti.

Quindi aggiungere lentamente una goccia da 0,5 microlitri di sospensione di cellule del ponte in ciascun pozzetto contenente la soluzione PEG. Le goccioline affonderanno sul fondo e entreranno in contatto con la superficie della coltura. Quindi trasferire con cura la piastra nell'incubatrice, facendo attenzione a non inclinare la piastra in nessun punto, che potrebbe interrompere i modelli dopo 12 ore.

Rimuovere la soluzione PEG e lavare tre volte con 200 microlitri di terreno di coltura. Quindi aggiungere 200 microlitri di terreno di coltura fresco e rimettere la piastra nell'incubatore. Monitora periodicamente le colture per osservare la proliferazione cellulare e la migrazione verso l'esterno dalle isole.

Iniziare il patterning di co-coltura preparando soluzioni di mazzi di PEG del 5% in peso e del 12,8% in peso per peso in DMEM con 10% FPS e 1%Gli antibiotici crescono anche i due tipi di cellule da utilizzare nel pattern di esclusione e di isola in modo che siano vicini alla confluenza. Allo stesso tempo, utilizzeremo l'Hep G, due isole di epatociti C3 a, con NIH tre T e tre fibroblasti che li circondano. Quindi raccogliere i due tipi di cellule e contarli separatamente utilizzando un emocitometro.

Questi due tipi di cellule possono essere facilmente distinti utilizzando un pellet per microscopia in campo chiaro, l'Hep G due epatociti C3 A per il patterning dell'isola e la spesa in resur in ponti del 12,8%. Quindi pellettare i fibroblasti per l'esclusione, il patterning e la sospensione in sospensione al 5%. Quindi, erogare 0,5 microlitri di sospensione di cellule D su una piastra asciutta a 96 pozzetti e coprire delicatamente le goccioline di dex con 200 microlitri di sospensione di cellule peg.

Quindi trasferire la piastra in un'incubatrice dopo 12 ore. Rimuovere il terreno e risciacquare tre volte con 200 microlitri di terreno di coltura. Quindi aggiungere 200 microlitri di terreno di coltura fresco e rimettere la piastra nell'incubatore.

Infine, il monitoraggio dell'intensità di colorazione dell'albumina delle cocolture può essere utilizzato per valutare gli effetti benefici della cocoltura di fibroblasti. Le concentrazioni di polimeri necessarie per formare una varietà di sistemi acquosi a due fasi sono qui descritte dalle curve nodali bin a concentrazioni superiori alla curva nodale bin. Il sistema forma due fasi al di sotto della curva nodale del bin.

La soluzione è un sistema bifase monofase trasparente di almeno due volte. Le concentrazioni di quelle che si trovano sulla curva binale sono sufficienti per l'uso nei sistemi acquosi a due fasi descritti in questo video. Il primo esempio del loro utilizzo è un modello di esclusione in cui piccole aree possono essere lasciate prive di cellule.

Il modello a isola crea l'esatto opposto del modello di esclusione in cui piccole regioni possono essere posizionate con celle. La combinazione di queste due procedure può essere utilizzata per formare una co-coltura unica in cui un'isola di cellule può essere circondata da un altro tipo di cellula, come mostrato qui. Le cellule Hela placcate utilizzando il modello di esclusione prolifereranno e migreranno per riempire il vuoto.

Nel tempo. La dimensione del vuoto può essere monitorata per fornire preziose informazioni sulla migrazione e la crescita cellulare in condizioni variabili. Il pattern a isola, d'altra parte, può essere utilizzato per misurare la crescita cellulare.

La combinazione di modelli di isola ed esclusione produce regioni ben definite di co-cultura. Qui sono mostrate isole di epatociti circondati da cellule fibroblastiche. Si è scoperto che queste colonie mantengono la loro organizzazione per almeno quattro giorni in coltura.

Utilizzando questo sistema, è possibile coltivare più isole di cellule sulla stessa piastra. Quando cresciuti come isole da soli, gli epatociti hanno prodotto leggermente meno albumina rispetto a quando sono cresciuti in co-coltura con fibroblasti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare concentrazioni di polimeri al doppio della concentrazione critica per formare soluzioni a due fasi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come formulare un sistema acquoso a due fasi e usarlo per modellare le celle e definire le geometrie.