Generazione di Linfonodo grassi Pad Chimere per lo studio del linfonodo stromale origine cellulare

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare una chimera del cuscinetto adiposo linfonodale per valutare il contributo del tessuto adiposo alla formazione dello stroma dei linfonodi. Ciò si ottiene prima isolando i linfonodi dai topi neonati e i cuscinetti adiposi dagli embrioni di topo del giorno 18,5. Il linfonodo viene rimosso dal cuscinetto adiposo embrionale e sostituito dal linfonodo neonato.

La chimera del cuscinetto adiposo linfonodale viene assemblata riassociando e quindi coltivando un linfonodo neonato con un cuscinetto adiposo embrionale in vitro. La chimera viene quindi innestata sotto la capsula renale di un topo ospite. Tre settimane dopo il trapianto, il rene viene prelevato e la chimera viene recuperata.

In definitiva, il contributo delle cellule derivate dal cuscinetto adiposo allo stroma linfonodale può essere valutato mediante analisi citofluorimetriche e al microscopio a immunofluorescenza. Quindi abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando stavamo cercando un modo per valutare se le cellule del cuscinetto adiposo contribuiscono alla formazione dei linfonodi per isolare i linfonodi inguinali neonati. Dopo aver sezionato la testa, utilizzare un paio di forbici per aprire il corpo dell'animale dalla parte superiore della regione toracica alla parte inferiore dell'addome.

Dopo aver rimosso con cura tutti i visceri dalla cavità addominale, posizionare il corpo in una piastra di Petri da 90 millimetri contenente mezzi RF 10. Posizionare la piastra in una cappa di coltura tissutale sterile e quindi trasferire il corpo in una nuova piastra di Petri sterile da 90 millimetri contenente RF 10 fresco. Quindi staccare con cura il peritoneo dalla pelle nella regione inguinale e individuare i linfonodi inguinali situati all'intersezione di tre vasi sanguigni nel cuscinetto adiposo.

Rimuovere con cura i linfonodi, assicurandosi che tutto il tessuto adiposo sia stato rimosso. Quindi posizionare i linfonodi in una capsula di Petri da 50 millimetri contenente terreni RF 10 su ghiaccio per isolare i cuscinetti adiposi inguinali dagli embrioni del giorno 18,5. Dopo aver rimosso i visceri come appena dimostrato, lavare i corpi in PBS sterile per eliminare ogni traccia di sangue.

Trasferire i corpi puliti in una capsula di Petri fresca da 90 millimetri e poi staccare il peritoneo, localizzare il linfonodo inguinale e rimuoverlo come appena dimostrato. Scartare il tessuto isolato. Fare attenzione a rimuovere l'intero linfonodo per evitare la contaminazione della chimera del cuscinetto adiposo.

Quindi rimuovere il cuscinetto adiposo inguinale e inserirlo in una piastra di Petri da 50 millimetri contenente terreni RF 10 su ghiaccio. Per allestire il sistema di coltura di organi in vitro, tagliare prima un po' di Vulcan sotto l'involucro in pezzi da uno a 1,5 centimetri quadrati. Quindi far bollire le spugne per due ore e i filtri per 20 minuti in acqua distillata e lasciarli asciugare per diverse ore in una cappa di coltura cellulare.

Una volta che i materiali sono asciutti, posizionare una spugna ciascuno in una piastra di Petri da 50 millimetri contenente due millilitri di terreno. Immergere ogni spugna nel terreno per bagnare entrambi i lati, quindi posizionare un filtro per ogni sistema di coltura di organi in vitro all'interfaccia dell'aria liquida. Quindi, riassociare con cura un cuscinetto adiposo embrionale con un linfonodo neonato direttamente sulla parte superiore di ciascun filtro.

Trasferisci le piastre di Petri in una scatola di plastica rettangolare con acqua sul fondo e fori nel coperchio. Fissare il coperchio alla scatola con del nastro adesivo, lasciando i fori aperti. Quindi posizionare la scatola in un incubatore per colture cellulari al 5% di CO2 a 37 gradi Celsius.

Lasciare equilibrare la scatola per due ore e poi sigillare i fori del coperchio con del nastro adesivo. Incubare i tessuti per almeno due giorni per consentire ai linfonodi di attaccarsi ai cuscinetti adiposi prima del trasferimento sotto la capsula renale, tre o quattro settimane dopo il trapianto. Isolare ogni chimera del cuscinetto adiposo dei linfonodi all'interno di ciascun rene e sezionare i linfonodi.

Quindi, per ogni linfonodo, usa un piccolo paio di forbici per praticare una singola incisione nel tessuto per aiutare la digestione enzimatica. Successivamente, posizionare un linfonodo ciascuno in singole provette da 1,5 millilitri contenenti 600 microlitri di tampone digestivo. Incubare le provette per 30 minuti a 37 gradi Celsius su un blocco termico agitatore, pipettando su e giù ogni 10 minuti per aiutare a dissociare il tessuto.

Quindi aggiungere sei microlitri di EDTA alle provette e tritrare la sospensione cellulare alcune volte per completare la dissociazione. Le cellule possono quindi essere colorate con gli anticorpi desiderati di interesse e analizzate mediante citometria a flusso per preservare l'espressione potenziata della proteina fluorescente gialla o EYFP. Fissare i linfonodi per tre o quattro ore.

Quindi, per ogni linfonodo, posizionare una singola goccia di composto OCT freddo su un piccolo pezzo di foglio di alluminio. Evitando bolle d'aria, posizionare con cura un linfonodo al centro di ogni goccia e quindi posizionare la pellicola su ghiaccio secco per congelare i tessuti. I linfonodi possono quindi essere sezionati, colorati e analizzati al microscopio a fluorescenza.

P L'attento isolamento del linfonodo consente un'ulteriore analisi della progenie delle cellule di derivazione adiposa positive per EYFP. Le sezioni criogeniche e l'analisi immunofluorescente del linfonodo rivelano che le cellule di derivazione adiposa EYFP positive migrano nel linfonodo dove contribuiscono al flusso della rete di cellule stromali stromali GP 38 positive E RTR a sette linfonodi L'analisi citometrica conferma che un'importante frazione delle cellule stromali linfonodali deriva da cellule progenitrici del tessuto adiposo EYFP positive locali che contribuiscono al 30% del CD 45 negativo G 38 CD 31 negativo FIBROBLASTICO frazione di cellule endoteliali del sangue CD 45 negative GP 38 negative CD 31 fino all'80% della frazione fibroblastica negativa CD 45, G 38 negativa CD 31 negativa può essere derivata da cellule precursori del tessuto adiposo dimostrando il ruolo cruciale svolto dal tessuto adiposo nel sostenere la crescita dello stroma linfonodale. Quindi, una volta padroneggiata questa tecnica, con un ricercatore nel campo dell'organogenesi linfoide per esplorare il ruolo di diverse molecole coinvolte nel trauma dei linfoidi.