Generazione di Linfonodo grassi Pad Chimere per lo studio del linfonodo stromale origine cellulare

L'obiettivo generale di questa procedura è generare una chimera del cuscinetto adiposo linfonodale per valutare il contributo del tessuto adiposo alla formazione della stroma dei linfonodi. Questo viene ottenuto innanzitutto isolando linfonodi da topi neonati e cuscinetti adiposi da embrioni di topo al giorno 18,5. Il linfonodo viene rimosso dal cuscinetto adiposo embrionale e sostituito con il linfonodo neonato.

Il chimera del cuscinetto adiposo linfonodale viene assemblato ricombinando e successivamente coltivando in vitro un linfonodo neonatale con un cuscinetto adiposo embrionale. Il chimera viene quindi trapiantato sotto la capsula renale di un topo ospite. Dopo tre settimane dal trapianto, il rene viene prelevato e il chimera viene recuperato.

In definitiva, il contributo delle cellule derivate dal cuscinetto adiposo alla stroma dei linfonodi può essere valutato mediante analisi citofluorimetrica e microscopia a fluorescenza. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando stavamo cercando un modo per verificare se le cellule del cuscinetto adiposo contribuissero alla formazione dei linfonodi. Per isolare i linfonodi inguinali di neonati, dopo aver sezionato la testa, utilizzare un paio di forbici per aprire il corpo dell'animale dalla parte superiore della regione toracica fino alla parte inferiore dell'addome.

Dopo aver rimosso con attenzione tutte le viscere dalla cavità addominale, posizionare il corpo in una piastra di Petri da 90 millimetri contenente mezzo RF 10. Collocare la piastra in un'incubatrice sterile per colture tessutali e quindi trasferire il corpo in una nuova piastra di Petri sterile da 90 millimetri contenente RF 10 fresco. Successivamente, staccare con cura il peritoneo dalla pelle nella regione inguinale e individuare i linfonodi inguinali situati all'incrocio di tre vasi sanguigni nel tessuto adiposo.

Rimuovere con attenzione i linfonodi, assicurandosi di eliminare tutto il tessuto adiposo. Successivamente, posizionare i linfonodi in una piastra di Petri da 50 millimetri contenente mezzo RF 10 su ghiaccio per isolare i cuscinetti adiposi inguinali da embrioni al giorno 18,5. Dopo aver rimosso le viscere come appena dimostrato, lavare i corpi in PBS sterile per eliminare ogni traccia di sangue.

Trasferire i corpi puliti in una nuova piastra di Petri da 90 millimetri, quindi staccare il peritoneo, localizzare il linfonodo inguinale e rimuoverlo come appena dimostrato. Scartare il tessuto isolato. Prestare attenzione a rimuovere l'intero linfonodo per evitare contaminazione del chimera del cuscinetto adiposo.

Quindi rimuovere il cuscinetto adiposo inguinale e posizionarlo in una piastra di Petri da 50 millimetri contenente mezzo RF 10 su ghiaccio. Per allestire il sistema di coltura organica in vitro, tagliare innanzitutto alcune spugne Vulcan in pezzi di uno a 1,5 centimetri quadrati. Successivamente, far bollire le spugne per due ore e i filtri per 20 minuti in acqua distillata e lasciarli asciugare per diverse ore in un capo a flusso laminare per colture cellulari.

Una volta che i materiali sono asciutti, inserire una spugna ciascuna in una piastra di Petri da 50 millimetri contenente due millilitri di terreno. Immergere ogni spugna nel terreno per inumidire entrambi i lati, quindi posizionare un filtro per ciascun sistema di coltura organica in vitro all'interfaccia liquido-aria. Successivamente, ricombinare con attenzione un cuscinetto adiposo embrionale con un linfonodo neonatale direttamente sulla parte superiore di ciascun filtro.

Trasferire le piastre di Petri in una scatola di plastica rettangolare contenente acqua sul fondo e fori nel coperchio. Fissare il coperchio alla scatola con del nastro, lasciando i fori aperti. Successivamente, posizionare la scatola in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e 5% CO2.

Lasciare stabilizzare la scatola per due ore, quindi sigillare i fori nel coperchio con del nastro adesivo. Incubare i tessuti per almeno due giorni per consentire ai linfonodi di attaccarsi ai cuscinetti adiposi prima del trapianto sotto la capsula renale, tre o quattro settimane dopo il trapianto. Isolare ogni chimera composta da linfonodo e cuscinetto adiposo all'interno di ciascun rene ed estrarre i linfonodi mediante dissezione.

Quindi, per ciascun linfonodo, utilizzare un piccolo paio di forbici per effettuare un singolo taglio nel tessuto al fine di facilitare la digestione enzimatica. Successivamente, posizionare un linfonodo in ciascuna provetta da 1,5 millilitro contenente 600 microlitri di buffer di digestione. Incubare le provette per 30 minuti a 37 gradi Celsius su un blocco termico agitato, aspirando e dispensando il liquido ogni 10 minuti per favorire la dissociazione del tessuto.

Quindi aggiungere sei microlitri di EDTA nei tubi e pipettare più volte la sospensione cellulare per completare la dissociazione. Le cellule possono quindi essere marcate con gli anticorpi desiderati e analizzate mediante citometria a flusso per valutare l'espressione della proteina fluorescente gialla potenziata o EYFP. Fissare i linfonodi per tre-quattro ore.

Quindi, per ciascun linfonodo, posizionare una singola goccia di composto OCT freddo su un piccolo pezzo di carta d'alluminio. Evitando con cura la formazione di bolle d'aria, posizionare un linfonodo al centro di ciascuna goccia, quindi appoggiare la carta d'alluminio sul ghiaccio secco per congelare i tessuti. I linfonodi possono quindi essere sezionati, colorati e analizzati mediante microscopia fluorescente.

Un'accurata isolazione del linfonodo consente un'ulteriore analisi della progenie delle cellule derivate dal tessuto adiposo positive per EYFP. L'analisi mediante sezioni crio e immunofluorescenza del linfonodo rivela che le cellule derivate dal tessuto adiposo positive per EYFP migrano nel linfonodo, dove contribuiscono alla rete di cellule stromali linfonodali positive per GP38 ed ERTR7. L'analisi in citometria a flusso conferma che una frazione significativa delle cellule stromali del linfonodo deriva da precursori locali del tessuto adiposo positivi per EYFP, contribuendo al 30% della frazione fibroblastica CD45 negativa, GP38 positiva, CD31 negativa e al 10% della frazione di cellule endoteliali sanguigne CD45 negativa, GP38 negativa, CD31 positiva. Fino all'80% della frazione fibroblastica CD45 negativa, GP38 positiva, CD31 negativa può derivare da cellule precursori del tessuto adiposo, dimostrando il ruolo cruciale svolto dal tessuto adiposo nel sostenere la crescita dello stroma linfonodale. Una volta padroneggiata questa tecnica, un ricercatore nel campo dell'organogenesi linfoidale potrà esplorare il ruolo di diverse molecole coinvolte nella formazione dei traumi linfoidi.