Preparazione di segmentate microtubuli allo Studio Proposte guidato dal Smontaggio microtubuli Ends

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare i movimenti delle molecole proteiche e delle perle rivestite di proteine con le estremità dei microtubuli depolimerizzanti. Ciò si ottiene assemblando una camera di flusso riutilizzabile con un vetrino di copertura di dimensioni pulite. Successivamente vengono preparati i semi dei microtubuli attaccati al vetrino coprioggetto e utilizzati per nucleare i microtubuli, che vengono poi stabilizzati temporaneamente con cappucci fotodistruttibili.

Quindi le proteine marcate con GFP o le perle rivestite di proteine vengono introdotte nella camera di flusso e si legano ai microtubuli segmentati. La depolimerizzazione della micro vasca viene quindi attivata rimuovendo i tappi mediante fotoablazione. Le immagini vengono analizzate con CH per determinare se le proteine marcate mostrano un comportamento di tracciamento della punta, che è il movimento con le estremità dei microtubuli depolimerizzanti.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di innescare la microtubazione con un'elevata risoluzione temporale e speciale. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale. Il protocollo inizia con la preparazione e l'assemblaggio della camera di flusso mediante fresatura a ultrasuoni.

Modificare i normali vetrini da microscopio in modo che abbiano due scanalature. Fai le scanalature a 14 millimetri di distanza. Più o meno un millimetro, che è ottimale per le camere assemblate utilizzando vetrini di copertura quadrati da 22 millimetri.

Quindi posizionare un tubo di polietilene lungo 100 millimetri in ciascuna scanalatura della guida, lasciando sporgenze di circa cinque millimetri alle estremità interne delle scanalature. Fissare i tubi all'interno delle scanalature con colla cianoacrilica, inglobando i tubi completamente all'interno delle scanalature. Riempire accuratamente le scanalature con colla epossidica senza fuoriuscire.

Lascialo asciugare per un giorno. Il giorno dopo. Usa una lama di rasoio affilata per tagliare la colla solidificata, a tre o quattro millimetri dall'estremità distale di ciascun sito di attacco.

Rimozione delle parti prossimali al centro della slitta. I tubi devono rimanere nelle loro scanalature e i tagli devono creare superfici piatte con aperture per tubi. Quindi, riempi una siringa con acqua e verifica se i tubi funzionano correttamente.

Se il liquido scorre liberamente, metti una goccia di colla epossidica di circa cinque millimetri di diametro alle estremità esterne delle scanalature e lasciala asciugare per circa un giorno. Le camere di flusso completate sono quindi durevoli e possono essere utilizzate ripetutamente per molti mesi. Questo protocollo di tre ore prepara 12 vetrini di copertura.

Richiede una cappa aspirante, un supporto per vetrino coprioggetto in ceramica, tre barattoli da 15 millilitri e 1 barattolo di vetro da 250 millilitri con coperchio. I barattoli di colorazione devono contenere quattro vetrini di copertura da 22 millimetri di numero regolare in una pila. Inizia con una pila di 12 vetrini coprioggetti pre-puliti e asciugati nel supporto in ceramica.

Riempi il barattolo con più una soluzione di repulsione di silene, e abbassa lentamente i vetrini. Chiudi il barattolo e incubalo per cinque minuti a temperatura ambiente. Il passo più critico per garantire una civiltà uniforme dei vetrini coprioggetti è evitare qualsiasi traccia d'acqua durante l'incubazione dei vetrini coprioggetti in soluzione di Selene.

Questo passaggio è essenziale per l'attaccamento stretto dei semi microtubalici. Più avanti in un protocollo, quando i vetrini coprioggetto sono pronti, rimuovere il supporto in ceramica dal barattolo. Quindi trasferire i vetrini coprioggetto singolarmente utilizzando una pinzetta rivestita in teflon dal supporto in ceramica ai barattoli di colorazione caricati con metanolo.

Ora carica i tre barattoli nel serbatoio dell'acqua di un bagno sonico con un piedistallo di metallo o vetro. Il livello dell'acqua dovrebbe essere a due terzi dell'altezza dei barattoli, sonicare i barattoli a 70 watt per 20 minuti. Durante la sonicazione, cambiare la soluzione di metanolo ogni cinque minuti.

Al termine della sonicazione, risciacquare, il coperchio scivola 10 volte con acqua deionizzata. Se la siloizzazione ha funzionato correttamente, i vetrini coprioggetti appariranno asciutti Una volta rimossi dall'acqua, indipendentemente dall'aspetto, rimuovere accuratamente l'acqua residua. Utilizzando il trasferimento di azoto gassoso, il coperchio essiccato scivola in un contenitore sigillabile essiccato con azoto.

Intercalare Kim asciuga tra i vetrini di copertura. Possono essere conservati in questo modo per diverse settimane a temperatura ambiente. Questo protocollo richiede da una a due ore, una camera di flusso e semi micro tubali stabilizzati G-M-P-C-P-P preparati.

Innanzitutto, assemblare la camera di flusso. Attaccare due pezzi di nastro biadesivo lungo l'area centrale larga cinque millimetri del vetrino preparato e premere con decisione il vetrino coprioggetto sul nastro. Utilizzando una siringa da un millilitro, riempire la camera con 100 microlitri di soluzione di B rrb 80 tramite un tubo.

Quindi, spremere una piccola goccia di sigillante a colata rapida di due colori sopra una piccola capsula di Petri di plastica. Mescolalo velocemente e accuratamente con uno stuzzicadenti. Diventerà verde.

Applicare immediatamente il sigillante lungo tutti i bordi del vetrino coprioggetto. Controllare se il sigillante penetra troppo in profondità sotto il vetrino coprioggetto. Se un tubo è ostruito, scollegare la siringa e sollevare il tubo per applicare una leggera pressione per evitare perdite di sigillante Dopo 10 minuti, assicurarsi che il flusso della soluzione non sia limitato.

Quindi trasferire la camera in un tavolino da microscopio riscaldato a 32 gradi Celsius. Collegare uno dei tubi a una pompa per la rimozione della soluzione. Immergere l'estremità libera del tubo di ingresso in una fiala da 0,5 millimetri con tampone BRB 80 caldo.

Impostare la pompa a 100 microlitri al minuto e, se necessario, utilizzarla per espellere delicatamente le bolle d'aria. Questo può essere fatto anche manualmente. Ora usa la pompa per caricare 30 microlitri di anticorpi antigenici caldi.

Spegnere la pompa e attendere cinque minuti. Spegnere la pompa durante tutte le incubazioni. Successivamente, lavare le camere con circa 100 microlitri di b rrb 80 caldo.

Quindi perfondere 50 microlitri di 1%onic F1 27 in BRB 80. Attendere 10 minuti affinché ostruisca la superficie idrofobica del vetrino coprioggetti siloizzato. Lavare ora le camere con 100 microlitri di tampone di motilità.

Successivamente, ridurre la velocità della pompa a 15 microlitri al minuto e perfondere la camera con 30-40 microlitri di semi di microtubuli diluiti da uno a 200 a uno a 600 in tampone di motilità. Incubare i semi per 15 minuti, quindi lavare la camera con 400 microlitri di tampone di motilità a 100 microlitri al minuto per rimuovere qualsiasi materiale non legato. Successivamente, ridurre la velocità della pompa a 30 microlitri al minuto e perfondere la camera con una soluzione di tubulina non etichettata preriscaldata.

Gli aspetti più critici di questo protocollo sono evitare le bolle d'aria. Utilizzare soluzioni di tubulina appena preparate e seguire i tempi esatti del protocollo, soprattutto durante la tappatura microtubulare. Monitorare la crescita delle micro tubali utilizzando l'ottica DIC durante l'incubazione di cinque-sette minuti.

I microtubuli di solito crescono di circa 10 micron, scambiano rapidamente la soluzione con la miscela di rumina tubulina prebellica e consentono da otto a 10 minuti in più di tempo di incubazione. Lavare bene la camera con 100 microlitri di tampone di motilità a 20 microlitri al minuto per rimuovere turbolenze e nucleotidi, nonché frammenti solubili di micro tubuli. Successivamente, perfondere la camera con una soluzione riscaldata di proteina marcata con GFP o perle rivestite di proteine e procedere con l'imaging del componente cinetico del lievito DAM uno marcato con GFP è stato purificato da cellule batteriche e utilizzato come controllo positivo per i saggi di tracciamento della punta.

Tali proteine seguono l'estremità depolimerizzante di un micro tubulo e si muovono costantemente verso il seme attaccato al vetrino. Queste proteine appaiono come una linea obliqua su un grafico corrispondente, che può quindi essere analizzato per determinare il numero di molecole proteiche nel complesso di tracciamento della punta. Questa analisi è dettagliata nel protocollo di testo.

Al contrario, le proteine che non riescono a tracciare la punta non mostrano un arricchimento del segnale di fluorescenza all'estremità micro di disassemblaggio. Questo si vede con la proteina umana NDC 80 GFP. Il legame tra le perle rivestite di proteine e i microtubuli è solitamente piuttosto forte, quindi quando le perle sono state aggiunte alla camera di microscopia, si sono legate facilmente ai microtubuli segmentati attaccati al vetrino coprioggetti.

Quando l'inseguimento delle perle è processuale, è possibile effettuare molte osservazioni. Le perle che si attaccavano a un microtubulo mostravano un movimento simile a un arco mentre i microtubuli ruotavano leggermente attorno al sito della loro crescita. Quando il cappuccio stabilizzatore è illuminato, se è possibile vedere solo un segmento rosso distale dal seme e dal perline, il cordone è attaccato a un micro tubulo.

Il cappuccio può spesso essere visto seguire il movimento delle perle allo stesso modo fino a quando il cappuccio non viene sbiancato Il movimento delle perle poco dopo lo sbiancamento appare coerente con l'orientamento dei microtubuli. Man mano che il micro tubiale si accorcia e il cordone si muove verso il seme, l'ampiezza delle oscillazioni ad arco diminuisce. Se le perle non riescono a formare attacchi duraturi ai microtubuli stabili.

L'intrappolamento laser può essere utilizzato perle con diversi costrutti proteici di chinesina diretta all'estremità positiva SE E ha richiesto questa tecnica per lanciare le perle sulle pareti micro tubali segmentate in presenza di un TP. Queste perle si sono spostate rapidamente verso le estremità più del micro tubiale con cappuccio su un grafico. Questo movimento ha portato a una linea obliqua diretta verso il tappo dopo che il tappo è stato distrutto. Le perle rivestite con proteina spia tronca si sono staccate dal micro tubulo come indicato dalla freccia verde.

Al contrario, le perle con proteina B a tutta lunghezza potrebbero sostenere il movimento nella direzione opposta. Questo è visto come un modello a zigzag sul grafico chm dovuto al movimento in direzioni opposte all'estremità più e o meno dei microtubuli. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare le camere di flusso e far crescere i microtubuli segmentati per studiare i movimenti guidati dallo smontaggio delle microtube.