Name: Preparazione di segmentate microtubuli allo Studio Proposte guidato dal Smontaggio microtubuli Ends (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-15T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Scopri come preparare microtubuli segmentati con tappi fotoablabili per studiare il movimento di proteine e perline durante la depolimerizzazione controllata. Questo metodo consente analisi ad alta risoluzione delle dinamiche microtubulari.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori desiderano ringraziare FI Ataullakhanov per aver contribuito a progettare e realizzare camere di flusso riutilizzabili, N. Dashkevich, N. Gudimchuk e A. Korbalev per la fornitura di immagini per i personaggi, N. Gudimchuk e P. Zakharov per lo sviluppo di un protocollo e fornendo reagenti preparare semi microtubuli digossigenina, A. Potapenko aiuto con l&#39;editing del testo e gli altri membri del Grishchuk laboratorio per le punte e discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal NIH concedere GM R01-098.389 e una borsa di studio pilota della Pennsylvania Muscle Institute a ELG, che è un Kimmel Scholar, da RFBR concede 12-04-00111-una proprietà di 13 04-40.190-H e 13 -04-40188-H, Accademia Russa delle Scienze Presidio Grants (Meccanismi di sistemi molecolari di integrazione e programmi di biologia cellulare molecolare e molecolari) per FI Ataullakhanov, NIH concedere GM R01 GM033787 a JR McIntosh, e una borsa di studio della Dynasty Dmitry Zimin Fondazione VAV

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Molti saggi singola molecola al giorno d&#39;oggi usano abitualmente coprioggetto appositamente trattata per ridurre drasticamente aspecifica di proteine ​​attaccare. La procedura che descriviamo qui è una modifica del protocollo originale sviluppato in laboratorio Howard 32, e troviamo che silanizzante i coprioggetti è valsa la pena, anche con saggi di perline basati DIC, che non utilizzano la fluorescenza. Chambers assemblati con tali coprioggetto mostrano superfici più puliti, ed i risultati ottenuti in pr...

I microtubuli sono altamente conservate strutture citoscheletriche che sono importanti per l&#39;architettura cellulare, la motilità cellulare, divisione cellulare, e trasporto intracellulare 1. Questi polimeri dinamici assemblare da tubulina in presenza di GTP, e si passa spontaneamente tra crescita e accorciando 2. I microtubuli sono molto sottili (solo 25 nm di diametro) quindi particolari tecniche ottiche per migliorare il contrasto dovrebbe essere utilizzato per osservare microtubuli con un microscopio ottico. Il lavoro precedente di questi polimeri esaminato il comportamento dinamico con contrasto di interferenza differenziale (DIC) 3. Questo ed analoghi studi in vitro hanno rivelato che, in condizioni tipiche sperimentali, i microtubuli subiscono catastrofe e passare alla depolimerizzazione solo raramente, una volta ogni 5-15 minuti (questa frequenza è di 7-15 mM concentrazione di tubulina solubile esaminati a 28-32 ° C ) 4. Diverse tecniche sono state quindi proposto di induzionee depolimerizzazione dei microtubuli in modo controllato. Microtubulo accorciamento può essere attivato da lavando via tubulina solubile 5,6, il taglio microtubuli con un raggio laser 7, oppure utilizzando microtubuli segmentati 8, come descritto qui. Impieghi precedenti utilizzando microtubuli segmentati, così come polimeri stocasticamente commutazione, ha trovato che i piccoli carichi intracellulari, come cromosomi, vescicole, e perle rivestite con proteine, possono muoversi alle estremità dei microtubuli accorciamento 9-13. Questo fenomeno è pensato per avere un&#39;implicazione diretta per i movimenti cromosomiche nelle cellule in mitosi, ed i meccanismi di fondo sono attualmente sotto inchiesta attivo 14-16. Recentemente, tecniche fluorescenti-based, tra la fluorescenza totale interna riflessione (TIRF) microscopia, sono stati impiegati per studiare la motilità con microtubuli dinamica finisce 17-24. Il vantaggio di questo approccio è che consente l&#39;esame di interaziones tra i microtubuli e proteine ​​microtubuli vincolante in tempo reale utilizzando proteine ​​marcate con differenti fluorofori. Diversi complessi proteici sono stati trovati a muoversi processively con allungamento e / o accorciando le estremità del microtubulo. Essi comprendono le proteine ​​associate ai microtubuli Dam1 10,12,18, Ska1 19, e XMAP215 20, così come i motori chinesina Kif18A 21,22, MCAK 23 e CENP-E 24. Queste proteine ​​mostrano processive tip-tracking, che è fondamentalmente diversa da quella dei classici proteine ​​punta inseguimento come EB1 25. Anche se le molecole EB1 ei partner associati sembrano rimanere stabilmente associata a microtubuli dinamica finisce, le singole molecole rimangono vincolati alla punta microtubulo solo ~ 0,8 secondi, rapido scambio con la piscina solubile 26. Al contrario, processive punta-trackers, come Dam1, viaggiano con microtubuli finisce per molti micron, e la loro associazione con le punte dei microtubuli può durare per meventuali secondi. La punta associazione tempo, così come la velocità di inseguimento risultante, dipende fortemente dal numero di molecole che formano la punta inseguimento complesso 27. Ensemble di proteine ​​più grandi sono di solito molto migliori tip-trackers. Ad esempio, tali insiemi complessi come isolate cinetocori lievito possono rimanere agganciati al microtubulo estremità per 28 ore. Alcune proteine ​​microtubuli vincolante, ad esempio Ndc80 complesso proteico cinetocoro, sono stati trovati per essere in grado di monitorare con microtubuli termina a livello di singola molecola, ma Ndc80 è molto efficiente nel accoppiando il movimento del tallone carico 19,29-31. Così, per comprendere il meccanismo di ribaltamento inseguimento da diversi complessi proteici, così come i loro ruoli biologici, è importante esaminare punta-tracking in funzione del numero di molecole del complesso-punta inseguimento, nonché per determinare la capacità di questi complessi di esporre motilità collettiva sulla superficie del cordone carico. (Figura 1A). In primo luogo, i vetrini disponibili in commercio sono modificati per inserire tubo polietilene breve (protocollo 1). La camera di flusso microscopia riutilizzabile viene assemblato da un tale scorrimento e il plasma puliti e coprioggetto silanizzata (protocollo 2) 32-34 o chimicamente. Il volume della camera risultante è solo il 20-25 microlitri (o piccolo come 15 microlitri, vedere Nota 3 nel protocollo 1), compreso il volume del tubo di ingresso. Camere di flusso commercialmente disponibili possono anche essere utilizzati, ma il loro volume è di solito più grande, che porta alla inutile spreco di proteine. Se una camera più grande è impiegato, il volume di tutte le soluzioni nei protocolli indicati deve essere scalata proporzionalmente. Semi di microtubuli vengono poi preparati, ad esempio utilizzando lentamente idrolizzabile GTP analogico, GMPCPP (5&#39;-[(α, β)-methyleno] trifosfato) (protocollo 3, vedi anche Hyman &lt;em&gt; et al. 35). I semi vengono immobilizzati su un vetrino pulito e la superficie viene successivamente bloccate per impedire l&#39;assorbimento aspecifico di altre proteine ​​32 (protocollo 4 descrive semi immobilizzazione utilizzando digossigenina). I microtubuli segmentati possono quindi essere preparati utilizzando il protocollo 5. La motivazione principale di questo approccio è che i polimeri microtubuli dinamiche, che formano in presenza di GTP, possono essere stabilizzati temporaneamente aggiungendo le corte &quot;tappi&quot; di segmenti tubulina stabili, che contengono GMPCPP. Questi tappi contengono anche tubulina rodamina marcato, in modo che possano essere rimossi semplicemente illuminando il campo visivo con un laser 530-550 nm o una lampada a vapori di mercurio (Protocollo 6) 36. Intensità di fluorescenza del segnale punta-tracking può quindi essere utilizzato per stimare il numero di molecole che viaggiano con lo smontaggio estremità del microtubulo, tenendo conto della disuniformità del campo di illuminazione microscopio (Protocollo 7). Un approccio simile può essere utilizzatoper studiare le interazioni tra microtubuli depolimerizzazione e perline rivestite con proteine, preparato come descritto in 27 (protocollo 8). Alcune proteine ​​si legano facilmente alle pareti dei microtubuli segmentati, ma pinzette laser può anche essere utilizzato per contenere il tallone vicino alla parete del microtubulo, promuovendo in tal modo il suo legame.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tabella 1. Microscopia e altre apparecchiature.</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss Nikon</td><td>Axio Imager 2 Eclipse Ti</td><td>è possibile utilizzare altri modelli di microscopio in grado di eseguire DIC e imaging a epifluorescenza</td></tr><tr><td>Obiettivo</td><td>Zeiss Nikon</td><td>420490-9900-000 CFI Apo 100x Olio 1.49</td><td>100X, DIC, 1.3-1.49 NA</td></tr><tr><td>Riscaldatore dell'obiettivo</td><td>Bioptechs</td><td>150803, 150819-19</td><td></td></tr><tr><td>Cubo con filtro fluorescente</td><td>Chroma</td><td>49004 o 49008 41017 o 49020</td><td>ottimizzato per la fluorescenza della rodamina ottimizzato per la fluorescenza GFP</td></tr><tr><td>Software di acquisizione</td><td>freeware MicroManager Molecular Devices</td><td>non applicabile MetaMorph 7.5</td><td>http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ altri software possono essere utilizzati per acquisire immagini e per un tracciamento delle particelle</td></tr><tr><td>Telecamera EMCCD</td><td>Andor</td><td>iXon3, DU-897E-cs0-#BV</td><td>Telecamera EMCCD altamente sensibile</td></tr><tr><td>Laser di intrappolamento</td><td>IPG Laser Photonics</td><td>YLR-10-1064-LP</td><td>da 1.064 nm,</td></tr><tr><td>laser ad eccitazione a fluorescenza</td> da 10 W <td>Coherent, Inc. Coherent, Inc.</td><td>Zaffiro 488 LP Zaffiro 552 LP</td><td>eccitazione di fluorofori verdi eccitazione di fluorofori rossi</td></tr><tr><td>Pulitore al plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Camere di flusso commerciali</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-20 o RC-30</td><td></td></tr><tr><td>Pompa di perfusione</td><td>Cole Palmer Harvard Apparatus</td><td>Masterflex 77120-52 Pico Plus</td><td>Entrambe le pompe forniscono la portata di liquido richiesta, ma una pompa peristaltica può pulsare a velocità molto bassa. Il flusso con una pompa a siringa è più costante per un'ampia gamma di velocità, ma questa pompa ha inerzia.</td></tr><tr><td colspan="4">Tabella 2. Preparazione della camera per microscopia.</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio modificati per camere riutilizzabili</td><td>Soffiatura di precisione del vetro del Colorado</td><td>Ordine personalizzato www.precisionglassblowing.com</td><td>Fessure soniche nei vetrini utilizzando schemi in Figura 1</td></tr><tr><td>Tubo in polietilene</td><td>Intramedic</td><td>427410</td><td>D.I. 0,58 mm, D.E. 0,965 mm; utilizzare questi tubi per collegare la camera assemblata alla pompa e al contenitore dei rifiuti</td></tr><tr><td>Tubo in polietilene</td><td>Intramedic</td><td>427400</td><td>D.I. 0,28 mm, D.E. 0,61 mm; utilizzare questi tubi per realizzare la camera riutilizzabile</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio regolari VWR</td><td></td><td>48312-003</td><td>È possibile utilizzare altri vetrini simili</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>VWR</td><td>48393-150, 48366-067</td><td>È possibile utilizzare altri vetrini coprioggetti simili</td></tr><tr><td>Sigillante</td><td>siliconico World Precision Instruments</td><td>KIT, SIGILLANTE SILICONICO 5 MIN CURE</td><td></td></tr><tr><td>Colla epossidica</td><td>Loctite</td><td>83082</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo cianoacrilato</td><td>Scotch 3M</td><td>AD114</td><td>O adesivo cianoacrilato di altri produttori</td></tr><tr><td colspan="4">Tabella 3. Pulizia e rivestimento dei vetrini.</td></tr><tr><td>Setacci molecolari, grado 564</td><td>Macron</td><td>4490-04</td><td></td></tr><tr><td>Barattolo per colorazione in vetro di copertura</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>21036</td><td></td></tr><tr><td>Supporto in ceramica per vetrino coprioggetti</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542e40</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne Repel Silane</td><td>GE Healthcare Biosciences</td><td>17-1332-01</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Anti-digossigenina AB</td><td>Roche Applied Science</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabella 4. Preparazione di semi e microtubuli segmentati.</td></tr><tr><td>Tubulina</td><td>purificata da cervelli di mucca Cytoskeleton, Inc</td><td> T238P</td><td>Per i protocolli di purificazione vedere 49&ndash; 51 Tubulina suina non marcata</td></tr><tr><td>Tubulina marcata</td><td>Cytoskeleton, Inc Invitrogen Invitrogen</td><td>TL590M C1171 (rodamina) A-2952 (digoxigenina)</td><td>Tubulina suina marcata con rodamina La tubulina può essere marcata con qualsiasi colorante reattivo all'ammina come in riferimento52.</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-405</td><td>Aliquot e conservare a -70 gradi C</td></tr><tr><td>VALAP</td><td>Vaselina, lanolina e paraffina a 1:1:2 in massa</td><td></td><td>vedi riferimento9</td></tr></tbody></table>

preparazione di segmentate microtubuli allo studio proposte guidato dal smontaggio microtubuli ends

Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

Microtubulo depolimerizzazione in grado di fornire la forza di trasportare diversi complessi proteici e perline proteine ​​rivestite in vitro. I meccanismi sottostanti sono pensati per svolgere un ruolo vitale nel cromosoma movimenti microtubuli-dipendente durante la divisione cellulare, ma le proteine ​​interessate ei loro ruoli esatti sono mal definiti. Quindi, vi è una crescente necessità di sviluppare saggi con cui studiano tale motilità in vitro utilizzando componenti purificati e ambiente biochimico definito. I microtubuli, tuttavia, sono intrinsecamente instabili polimeri, la loro commutazione tra crescita e l&#39;accorciamento è stocastico e difficile da controllare. I protocolli che descriviamo qui approfittano dei microtubuli segmentati che sono fatti con il photoablatable stabilizzazione caps. Depolimerizzazione di tali microtubuli segmentati può essere attivato con alta risoluzione temporale e spaziale, aiutando in tal modo studi di motilità presso lo smontaggio estremità del microtubulo. Questa tecnica può essere utilizzata per caRRY un&#39;analisi quantitativa del numero di molecole in complessi proteici fluorescenza marcata, che si muovono con processively microtubuli dinamica termina. Per ottimizzare il rapporto segnale-rumore in questo ed altri saggi fluorescenti quantitative, coprioggetto devono essere trattati per ridurre l&#39;assorbimento aspecifico di proteine ​​solubili fluorescenza marcata. Protocolli dettagliati vengono forniti per tenere conto della disuniformità di illuminazione fluorescente, e determinare l&#39;intensità di un singolo fluoroforo utilizzando equidistante forma gaussiana. Infine, si descrive l&#39;uso dei microtubuli segmentati per studiare i movimenti microtubuli-dipendente delle microsfere rivestite di proteine, fornendo approfondimenti nella capacità di diverse proteine ​​motrici e non motori a coppia microtubuli depolimerizzazione al movimento merci processive.

Proteine ​​inseguimento con depolimerizzante microtubuli finisce. Lievito cinetocoro componente Dam1 è di gran lunga il miglior consiglio-tracker del microtubulo depolimerizzante finisce 14. Questo complesso di 10 subunità marcato con GFP può essere facilmente espresso e purificato da cellule batteriche 18,38, quindi si raccomanda di usarlo come controllo positivo per il test-punta inseguimento. Una proteina fluorescente che tiene traccia con la fine depolimerizzante di un microtub...

I microtubuli sono intrinsecamente polimeri instabili, e il loro passaggio tra la crescita e l&#39;accorciamento è stocastico e difficile da controllare. Qui si descrivono i protocolli utilizzando microtubuli segmentato con tappi di stabilizzazione photoablatable. Depolimerizzazione dei microtubuli segmentati può essere attivato con alta risoluzione temporale e spaziale, aiutando in tal modo l&#39;analisi delle proposte di risoluzione con lo smontaggio estremità del microtubulo.

Preparazione di segmentate microtubuli allo Studio Proposte guidato dal Smontaggio microtubuli Ends

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare i movimenti delle molecole proteiche e delle perle rivestite di proteine con le estremità dei microtubuli depolimerizzanti. Ciò si ottiene assemblando una camera di flusso riutilizzabile con un vetrino di copertura di dimensioni pulite. Successivamente vengono preparati i semi dei microtubuli attaccati al vetrino coprioggetto e utilizzati per nucleare i microtubuli, che vengono poi stabilizzati temporaneamente con cappucci fotodistruttibili.Quindi le proteine marcate con GFP o le perle rivestite di proteine vengono introdotte nella camera di flusso e si legano ai microtubuli segmentati. La depolimerizzazione della micro vasca viene quindi attivata rimuovendo i tappi mediante fotoablazione. Le immagini vengono analizzate con CH per determinare se le proteine marcate mostrano un comportamento di tracciamento della punta, che è il movimento con le estremità dei microtubuli depolimerizzanti.Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di innescare la microtubazione con un'elevata risoluzione temporale e speciale. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale. Il protocollo inizia con la preparazione e l'asse

preparation-segmented-microtubules-to-study-motions-driven

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo video descrive TIRF, una tecnica basata sulla microscopia a riflessione interna totale per visualizzare le dinamiche di polimerizzazione dell'actina e dei microtubuli. Il metodo consente l'imaging ad alta risoluzione delle dinamiche di accoppiamento tra actina e microtubuli in tempo reale, che è essenziale per comprendere i crosstalk cellulari.

Microscopia TIRF per visualizzare la dinamica dell'accoppiamento di actina e microtubuli

Erba lievito è un modello vantaggioso per lo studio della dinamica dei microtubuli in vivo grazie ai suoi potenti genetica e la semplicità della sua citoscheletro microtubuli. Il seguente protocollo descrive come trasformare le cellule e la cultura di lievito, di acquisire immagini di microscopia confocale, e quantitativamente analizzare dinamica dei microtubuli in cellule di lievito viventi.

Ad alta risoluzione Imaging e analisi dei singoli microtubuli astrali Dynamics in germogliamento lievito

Qui presentiamo un metodo robusto e dettagliato di analisi delle dinamiche dei microtubuli nelle cellule sincronizzate nella prometafase utilizzando la microscopia confocale del disco di filatura a cellule vive e l'elaborazione delle immagini basata su MATLAB.

Misurazione della microtubule Dynamics mediante microscopia disco rotante in spindle mitotici monopolari

I microtubuli, che sono polimeri di tubulina, svolgono un ruolo cruciale come componente del citoscheletro nelle cellule eucariotiche e sono noti per la loro instabilità dinamica. Questo studio ha sviluppato un metodo per frazionare i microtubuli per separarli in microtubuli stabili, microtubuli labili e tubulina libera per valutare la stabilità dei microtubuli in vari tessuti di topo.

Tecnica di frazionamento quantitativo dei microtubuli per separare microtubuli stabili, microtubuli labili e tubulina libera nei tessuti di topo

Qui, viene presentato un test di ricostituzione in vitro basato sulla microscopia TIRF per quantificare e confrontare contemporaneamente la dinamica di due popolazioni di microtubuli. Viene descritto un metodo per visualizzare simultaneamente l'attività collettiva di più proteine associate a microtubuli su fasci di microtubuli reticolati e singoli microtubuli.

Visualizzazione simultanea della dinamica di microtubuli reticolati e singoli in vitro mediante microscopia TIRF

Qui, presentiamo un protocollo per ricostituire i fasci di microtubuli in vitro e quantificare direttamente le forze esercitate al loro interno utilizzando l'intrappolamento ottico simultaneo e la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale. Questo test consente la misurazione su scala nanometrica delle forze e degli spostamenti generati dagli insiemi proteici all'interno delle reti di microtubuli attivi.

Misurazione diretta delle forze all'interno di fasci di microtubuli attivi ricostituiti

Questo studio descrive in dettaglio la purificazione di KIF1A (1-393LZ), un membro della famiglia kinesin-3, utilizzando il sistema di espressione del baculovirus Sf9. L'analisi in vitro di scorrimento monomolecola e multimotore di questi motori purificati ha mostrato robuste proprietà di motilità paragonabili ai motori del lisato cellulare di mammifero. Pertanto, il sistema Sf9-baculovirus è suscettibile di esprimere e purificare la proteina motoria di interesse.

Analisi a singola molecola dei motori della famiglia Kinesin-3 superprocessiva purificata Sf9

Questo articolo presenta un protocollo per la formazione di assemblaggi di microtubuli a forma di tactoidi utilizzando MAP65, un reticolante di microtubuli a base vegetale e PEG come agente di affollamento.

Auto-assemblaggio di microtubuli tactoidi

Questo articolo presenta protocolli per l'ingegnerizzazione e la caratterizzazione di reti composite tridimensionali sintonizzabili di filamenti di actina co-entangled e microtubuli. I compositi subiscono una ristrutturazione attiva e un movimento balistico, guidati dai motori della miosina II e della chinesina, e sono sintonizzati dalle concentrazioni relative di actina, microtubuli, proteine motorie e reticolanti passivi.

Ricostituzione e caratterizzazione di compositi actina-microtubuli con dinamica e meccanica azionata da motori sintonizzabili

Qui vengono presentati metodi per preparare la nematica attiva da microtubuli e motori di chinesina, compresa la preparazione e la costruzione di proteine e l'uso di pozzetti per il confinamento nematico attivo.

Formazione, confinamento e osservazione della nematica attiva basata su microtubuli

Qui, descriviamo un protocollo per estrarre la tubulina endogena da cellule di mammifero, che possono mancare o contenere specifici enzimi modificanti i microtubuli, per ottenere microtubuli arricchiti per una specifica modifica. Descriviamo quindi come i microtubuli estratti possono essere decorati con proteine purificate che legano i microtubuli per preparare griglie per la microscopia crioelettronica.

Estrazione di microtubuli modificati da cellule di mammifero per studiare complessi microtubulo-proteine mediante microscopia crioelettronica

Scopri come preparare microtubuli segmentati con tappi fotoablabili per studiare il movimento di proteine e perline durante la depolimerizzazione controllata. Questo metodo consente analisi ad alta risoluzione delle dinamiche microtubulari.

Preparazione di segmentate microtubuli allo Studio Proposte guidato dal Smontaggio microtubuli Ends

Esplora altri video