Ad alta risoluzione Imaging e analisi dei singoli microtubuli astrali Dynamics in germogliamento lievito

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la dinamica dei microtubuli nelle cellule di lievito. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei microtubuli, come ad esempio il modo in cui le mutazioni nei tubuli e nei regolatori dei microtubuli regolano la dinamica dei microtubuli in una cellula vivente. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le cellule di lievito viventi sono stabilizzate nell'immagine.

Piuttosto, un'alta risoluzione temporale per dieci minuti o una risoluzione temporale bassa per diverse ore. A dimostrare la procedura saranno Colby Fees e Cassi Estrem, due studenti laureati del mio laboratorio. Le cellule di lievito utilizzate in questo esperimento sono state costruite per esprimere costitutivamente la tubulina marcata con GFP.

Inoculare circa un microlitro di cellule di lievito da una singola colonia su una piastra in tre millilitri di terreno sintetico completo. Lasciare che le cellule crescano durante la notte a 30 gradi Celsius agitando a 250 giri/min. Il giorno successivo, diluire la coltura satura a un OD600 inferiore a 0,1 nel terreno.

Rimettere la coltura diluita nell'agitatore a 30 gradi Celsius per tre o quattro ore, o fino a quando l'OD600 non è compreso tra 0,4 e 0,8. Iniziare la preparazione dei vetrini della camera di flusso tagliando un foglio di pellicola di paraffina in un pezzo che misura quattro pollici di larghezza e sette pollici di lunghezza. Posizionare un vetrino da microscopio standard nel senso della lunghezza sulla larghezza di quattro pollici della pellicola di paraffina e avvolgere la pellicola attorno al vetrino tre o quattro volte in modo che il vetrino sia coperto da una pellicola spessa tre o quattro strati.

Premere gli strati insieme per assicurarsi che ci sia una tenuta ragionevole, ma evitare di premere troppo forte o di far raggrinzire la pellicola. Usando un rasoio da taglio pulito e un'altra slitta per fornire un bordo dritto per il taglio, taglia la pellicola di paraffina lungo i bordi esterni della diapositiva. Staccare la pellicola in eccesso dal vetrino di lavoro e gettarla.

Usando la seconda diapositiva come bordo dritto, tagliare gli strati di pellicola impilati lungo l'asse lungo della diapositiva in circa 10 strisce, ciascuna larga da due a quattro millimetri. Quindi, tagliare gli strati di pellicola di paraffina impilati perpendicolarmente ai tagli precedenti lungo l'asse corto della diapositiva per creare strisce da due a quattro millimetri di larghezza, da 23 a 24 millimetri di lunghezza e tre o quattro strati di spessore. Usa un rasoio con un angolo di 45 gradi per staccare le strisce di pellicola tagliate.

Quindi utilizzare una pinza per distribuire uniformemente le strisce tagliate su un vetrino da microscopio pulito per creare il numero desiderato di camere. In questo esempio, verranno utilizzate quattro strisce di pellicola per creare tre camere. Posizionare un singolo vetrino coprioggetti sopra le strisce di pellicola e spostarlo in posizione con una pinza.

Posizionare il vetrino preparato, il vetrino di copertura rivolto verso l'alto, su una piastra riscaldante impostata a circa 95 gradi Celsius, e riscaldare il vetrino per circa tre minuti fino a quando le strisce di pellicola non saranno traslucide. Sigillare insieme il vetrino e il vetrino coprioggetti utilizzando una pinzetta per premere delicatamente sulle regioni del vetrino coprioggetti che si trovano direttamente sopra le strisce di pellicola di paraffina. Utilizzare una pinza per rimuovere il vetrino dalla piastra riscaldante e metterlo da parte per farlo raffreddare con il lato del vetrino coprioggetto rivolto verso l'alto.

Man mano che il vetrino si raffredda, la pellicola tornerà a una colorazione bianca opaca. Per iniziare questa procedura, scongelare un'aliquota congelata da 200 microlitri di Concanavalin A a temperatura ambiente. Aggiungere circa 100 microlitri di Concanavalina A scongelata a ciascuna camera del vetrino preparato pipettando in una delle estremità aperte.

Quindi appendere il vetrino, il vetrino coprioggetti verso il basso, tra due rastrelliere per provette microfuge per cinque minuti per consentire alla Concanavalin A di aderire al vetrino coprioggetto. Riportare il vetrino in posizione di scivolamento del coperchio e rimuovere la Concanavalin A lavando la camera con un mezzo completo sintetico. Far scorrere il doppio del volume del fluido attraverso la camera utilizzando l'angolo di un tovagliolo di carta per estrarre il fluido da un'estremità della camera, pipettando contemporaneamente il fluido fresco nell'altra estremità della camera.

Celle di carico che scorrono due volte il volume della camera di sospensione delle celle utilizzando il metodo del flusso diretto. Appendere il vetrino, vetrino coprioggetti, per 10 minuti per consentire alle celle di aderire al vetrino coprioggetti. Eliminare le cellule non aderenti facendo scorrere attraverso un volume quattro volte superiore a quello del terreno sintetico completo.

Asciugare accuratamente ogni estremità della camera con un angolo pulito di un tovagliolo di carta, portando il menisco sul bordo del vetrino coprioggetto. Sigillare ciascuna estremità della camera con sigillante caldo. L'acquisizione delle immagini sarà eseguita con un microscopio invertito dotato di un obiettivo 1.45 NA 100X CFI Plan Apo, uno stadio piezoelettrico, un'unità di scansione confocale a disco rotante, un laser di illuminazione e una fotocamera EMCCD.

Mantenere la temperatura del tavolino a temperatura ambiente durante l'acquisizione dell'immagine. Metti a fuoco le cellule e cerca nel vetrino le cellule raggruppate per assicurarti che il campo di acquisizione abbia almeno cinque o sei cellule raggruppate insieme sullo stesso piano focale. Programmate un'acquisizione multidimensionale per raccogliere più zSeries nel tempo.

Regolare le impostazioni all'interno delle impostazioni di acquisizione attive su quanto segue: profondità Z totale di sei micrometri per comprendere l'intera cellula di lievito, dimensione del passo Z di 300 nanometri per massimizzare la raccolta della luce senza sovracampionamento, durata totale del tempo di 10 minuti, intervalli di tempo di quattro secondi tra zSeries e tempo di esposizione di 90 millisecondi per ciascun piano Z. Inizia l'acquisizione facendo clic su Esegui e consentila di funzionare per l'intera durata di 10 minuti. I dati vengono salvati come serie di immagini e qui viene mostrato un esempio di risultato dell'imaging time lapse.

Avviare l'analisi dell'immagine aprendo ImageJ e trascinando la pila di immagini acquisite direttamente sul pannello di controllo. I formati bio importati si avvieranno automaticamente. Seleziona Va bene"per caricare lo stack di immagini come hyperstack.

Utilizzando la funzione ZProject, comprimere ogni zSeries in un'intensità massima di proiezione bidimensionale. Applicate un filtro medio alla pila di immagini per ridurre il rumore di macchiettamento selezionando il menu Processo, il sottomenu Filtro e la funzione mediana. Inserisci 2.0 pixel nella casella del raggio e fai clic su Va bene"Identifica le celle pre-NFA nel campo.

Questi sono caratterizzati da gemme di medie dimensioni e da un corto fuso mitotico lungo circa uno a un punto cinque micrometri. A partire dal primo punto temporale della serie di immagini, utilizzare lo strumento linea segmentata per tracciare una linea lungo un singolo microtubulo astrale da quello situato alla giunzione tra il microtubulo astrale e i microtubuli fusiformi più intensamente marcati, fino all'estremità positiva, che si trova nel citoplasma. Fare doppio clic sull'estremità del microtubulo per completare la linea segmentata.

Registrare la misurazione nella tabella dei risultati utilizzando la funzione di misurazione premendo il pulsante M sulla tastiera. Dopo aver effettuato le misurazioni per tutti i punti temporali, copiare i dati dalla tabella dei risultati, incollarli in un foglio di calcolo e selezionare Salva con nome"per selezionare i dati. Questo grafico mostra una serie temporale della dinamica dei microtubuli astrali in una cellula wild type e un ceppo mutante che in precedenza aveva dimostrato di avere microtubuli più stabili.

I microtubuli sono etichettati con l'alfa tubulina marcata GFP per visualizzare la lunghezza dei microtubuli. Le frecce rosse tracciano la lunghezza totale di un microtubulo astrale, con le punte delle frecce che denotano le estremità positive. Le lunghezze dei microtubuli sono state misurate in ogni punto temporale per otto minuti e queste lunghezze compilate sono rappresentate nei grafici della vita.

I punti verdi denotano la polimerizzazione e i punti rosa denotano la depolimerizzazione. Gli eventi catastrofali sono indicati da punte di freccia. Questi grafici mostrano che il microtubulo nel mutante è più lungo e mostra meno catastrofi rispetto al microtubulo di tipo selvatico.

Inoltre, i tassi di polimerizzazione e depolimerizzazione determinati dalle pendenze delle lunghezze dei microtubuli ascendenti e discendenti sono diminuiti nel mutante rispetto al wild type. Le misurazioni della dinamica dei microtubuli rivelano anche che il microtubulo nella cellula mutante ha una dinamica ridotta rispetto al tipo selvatico. Una volta padroneggiati, la preparazione dei vetrini, il caricamento delle celle e l'acquisizione delle immagini possono essere eseguiti in 30 minuti, il che significa che è possibile visualizzare molti campioni diversi in un solo giorno.

Le camere di scorrimento possono essere realizzate e conservate in anticipo prima di aggiungere Concanavalin A.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come stabilizzare le cellule di lievito in semplici camere di vetrino, visualizzare immagini in quattro dimensioni e misurare la dinamica dei microtubuli nelle cellule viventi. Oltre ai microtubuli, questa procedura può essere modificata per misurare la dinamica di altre proteine marcate in fluorescenza in cellule di lievito viventi su scale temporali che vanno da secondi a ore.