Ricostituzione e caratterizzazione di compositi actina-microtubuli con dinamica e meccanica azionata da motori sintonizzabili

Il nostro lavoro porta gli sforzi di ricostituzione del citoscheletro un importante passo avanti verso l'imitazione delle condizioni cellulari ingegnerizzando compositi di actina e microtubuli, guidati da motori di kinesina e miosina per sintonizzarsi, ristrutturarsi e muoversi attivamente. La dinamica e la struttura dei nostri compositi possono essere programmate con precisione aggiungendo, rimuovendo e sintonizzando in modo indipendente i diversi componenti per mostrare una ricca base di fase di contrazione, infezione, demising, ingrossamento e rottura. Il nostro approccio è ampiamente applicabile alla progettazione, creazione e caratterizzazione di piattaforme di materia attiva che incorporano più componenti generatori di forza che agiscono su diversi substrati in un unico sistema.

A dimostrare la procedura saranno Daisy Achiriloaie e Maya Hendija. Ricercatori universitari del nostro laboratorio. Per iniziare, aggiungere i reagenti a una provetta da microcentrifuga nera sterile da 1,5 millilitri utilizzando una micro pipetta e punte di pipette sterili per formare gruppi motori Kinesin che legano ed esercitano forze tra coppie di microtubuli.

Mescolare delicatamente pipettando la soluzione su e giù. Quindi incubare la soluzione per 30 minuti a quattro gradi Celsius, proteggerla dalla luce. Per preparare una rete composita coentangled di filamenti di actoni e microtubuli, impostare il blocco di calore a 37 gradi Celsius.

Aggiungere i reagenti in una provetta da microcentrifuga sterile da 0,6 millilitri. Assicurarsi che il volume totale sia di 25 microlitri. Pipettare delicatamente la soluzione su e giù per mescolarla e posizionarla sul blocco termico a 37 gradi Celsius protetto dalla luce per un'ora.

Successivamente, rimuovere il tubo dal blocco termico e utilizzare una micro pipetta per mescolare delicatamente 0,84 microlitri di 100 micromolari di falloidina. Incubare per cinque a 10 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Per preparare i compositi attivi per l'imaging focale della conf, aggiungere i reagenti alla soluzione e mescolare delicatamente mediante pipettaggio su e giù.

Dividere la soluzione in tre aliquote da 10 microlitri ed etichettarle come K, K più M e controllo negativo. Aggiungere 2,54 microlitri di miosina all'aliquota K più M e 2,54 microlitri di PEM a K e aliquote di controllo negativo. Quindi aggiungere 2,5 microlitri di cluster Kinesin alle aliquote K e K più M e pipettare su e giù per miscelare.

Quindi, aggiungere 2,5 microlitri di PEM al controllo negativo utilizzando la stessa tecnica. Utilizzare una micropipetta per far fluire lentamente ogni soluzione nel canale corrispondente delle camere del campione tramite azione capillare. Spingere verso il basso molto lentamente e delicatamente sulla pipetta in modo da non introdurre bolle d'aria nel canale.

Sigillare le due estremità aperte di ciascun canale con colla epossidica o polimerizzabile UV ad asciugatura rapida. Quando l'adesivo è completamente asciutto, posizionare il canale sul microscopio per visualizzare il composito il più vicino possibile allo stato inattivo iniziale. Immagina prima il canale K e i canali K plus M, seguiti dal canale di controllo.

Si noti il tempo trascorso tra l'aggiunta dei cluster Kinesin alle aliquote K e K più M e l'inizio dell'acquisizione dei dati. Per preparare l'actina ai reticolanti di actina o AA, aggiungere Biotina-actina, NeutrAvidina, Biotina e PEM in una provetta da microcentrifuga e mescolarli delicatamente mediante pipettaggio su e giù. Allo stesso modo, per i microtubuli ai microtubuli o ai reticolanti MM, aggiungere Biotina-tubulina, NeutrAvidina, Biotina e PEM a un micro tubo da centrifuga e mescolarli delicatamente pipettando su e giù.

Avvolgere il tubo in una pellicola termoplastica per soffitto per creare una tenuta stagna e posizionarli in una zattera di galleggiamento in un bagno sonicater a temperatura controllata, impostato a quattro gradi Celsius per 90 minuti. Per incorporare complessi reticolanti A-A nei campioni per l'imaging, aggiungere i reagenti a una provetta da microcentrifuga. Assicurarsi che il volume totale sia di 25 microlitri.

Allo stesso modo, per i complessi reticolanti M-M, aggiungere i reagenti mostrati sullo schermo a una provetta da microcentrifuga. Mescolare la soluzione pipettando su e giù e posizionarla sul blocco di calore a 37 gradi Celsius al riparo dalla luce per un'ora. Successivamente, rimuovere il tubo dal blocco termico e utilizzare una micro pipetta per miscelare 0,84 microlitri di 100 micromolari di falloidina.

Incubare per cinque a 10 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce e ripetere la procedura mostrata in precedenza per preparare compositi attivi per l'imaging confocale. Le monofibre di actina e i dimeri di tubulina sono copolimerizzati per formare reti co-entangled di filamenti di actina e microtubuli. I due mini filamenti di miosina e i cluster Kinesin spingono e tirano i filamenti per guidare i compositi fuori dallo stato stazionario.

La reticolazione passiva si ottiene utilizzando NeutrAvidin per collegare filamenti di actina biotinilata o microtubuli. I due mini filamenti di miosina, i cluster Kinesin o entrambi i motori sono incorporati in compositi senza reticoli passivi, reticoli actina-actina e reticoli microtubulo-microtubuli. Qui è mostrato l'imaging confocale a due colori di compositi citoscheletri guidati dalla miosina con diverse concentrazioni di miosina e frazioni molari di actina.

La velocimetria dell'immagine delle particelle mostra che l'attività della miosina dell'actina innesca dinamiche contrattili coordinate di actina e microtubuli in compositi coentangled. Qui, diversi colori delle frecce corrispondono a velocità diverse, come indicato nella scala dei colori a destra dei campi vettoriali. La microscopia dinamica differenziale risolta nel tempo viene eseguita sui canali dei microtubuli e dell'actina delle serie temporali per determinare le caratteristiche dei tempi di decadimento rispetto al numero d'onda sia per l'actina che per i microtubuli.

Le velocità di contrazione sono determinate tramite curve di tempo di adattamento a decadimento, mediate su tutti i tempi di ritardo per l'intera durata di ogni serie temporale di 45 minuti. La microscopia dinamica differenziale risolta nel tempo quantifica come la dinamica varia nel tempo valutando i tempi di decadimento per intervalli consecutivi di sei minuti durante il tempo di attivazione di 45 minuti per actina e microtubuli. Le velocità di contrazione risolte nel tempo per i filamenti di actina e i microtubuli sono determinate dalle curve del tempo di decadimento corrispondenti.

L'analisi di correlazione automatica dell'immagine spaziale quantifica la ristrutturazione motoria dei componenti citoscheletrici attivi confrontando le curve di correlazione automatica per le diverse reti all'inizio dell'esperimento rispetto alla fine. Le lunghezze di correlazione risolte nel tempo determinate tramite adattamenti esponenziali delle curve di correlazione automatica mostrano compositi che non si ristrutturano rispetto a quelli che ristrutturano sostanzialmente. Due immagini confocali a colori di compositi di microtubuli di actina guidati da Kinesin mostrano una ristrutturazione dipendente dalla formulazione nel tempo senza che i compositi reticolanti si ristrutturino in cluster ricchi di microtubuli debolmente connessi.

Il cross-linking actina-actina supporta la co-localizzazione dei microtubuli di actina, mentre il cross-linking microtubulo-microtubulo migliora la miscelazione di D. La microscopia dinamica differenziale e l'analisi di correlazione automatica delle immagini spaziali mostrano l'effetto della reticolazione e della competizione tra i motori di micina e Kinesina sulla dinamica e sulla struttura variabili nel tempo dei compositi. Per imitare le condizioni cellulari più da vicino, i ricercatori possono incorporare filamenti intermedi, altri motori e proteine leganti che controllano le lunghezze e le rigidità dei filamenti.

Le misure metrologiche delle pinzette ottiche possono anche essere eseguite per caratterizzare la meccanica dei compositi. Utilizzando il nostro approccio, i ricercatori possono sintonizzare con precisione la dinamica e la struttura della materia attiva composita ispirata al citoscheletro attraverso uno spazio delle fasi senza precedenti per emulare diversi processi cellulari e progettare materiali programmabili riconfigurabili.