Name: Un Ex Vivo Laser-indotta Spinal Cord Injury modello per valutare i meccanismi di degenerazione assonale in tempo reale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Scopri un modello ex vivo di lesione spinale laser-indotta per valutare la degenerazione assonale in tempo reale mediante microscopia a due fotoni. Questo metodo consente di visualizzare dinamiche di assoni e mielina preservando l'integrità tissutale.

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DPS riconosce il supporto passato e presente in parte dalla sovvenzione #2665 e #2934, rispettivamente, dalla PVA Research Foundation. PKS è uno scienziato di Alberta Innovates – Health Solutions, i cui fondi operativi sono stati forniti dalla cattedra Leblanc per la ricerca sul midollo spinale, Università di Calgary.

NOTA: Tutte le procedure sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida stabilite dal comitato Animal Istituzionale Cura e uso presso l&#39;Università di Louisville, in osservanza delle disposizioni federali. 1. Preparazione di Low Ca 2+ e 2 mM Ca 2 + artificiale liquido cerebrospinale (aCSF) Perfusates <ol><li> Preparare 2x bassa Ca 2+ (0,1 mM) Stock tampone C, 2x normale Ca 2+ (2 mM) Stock Un buffer, e tampone 2x Archivio B come descritto nella Tabella 1. Le singole soluzioni stock consentono modifica del contenuto di ioni (ad esempio, basso o nullo Ca 2+) e può essere conservato a 4 ° C per un mese. </li><li> Per intracardiaca perfusione durante la dissezione, aggiungere 100 ml di 2x basso Ca 2+ della C e 100 ml di 2x Fotografico B in una bottiglia di plastica per rendere basso Ca 2+ 1x aCSF. Mescolare e conservare una notte a 4 ° C o fare fresco. </li><li> Per perfusione ex vivo del midollo spinale durante imagING, aggiungere 500 ml di 2x normale Ca 2+ Stock A e 500 ml di 2x Fotografico B in una bottiglia di vetro da 1 L per generare 1x aCSF. Mescolare e conservare notte a temperatura ambiente o fare fresco. </li><li> Aggiustare il pH del buffer ACSF a 7,4. Mantenendo la aCSF a temperatura ambiente, collocare il basso Ca 2+ aCSF su ghiaccio e poi bolla entrambi i buffer con gas carbogeno (95% O 2; 5% CO 2) per 30 minuti prima dell&#39;uso e continuamente durante la perfusione. </li></ol> 2. Preparazione di Ex Vivo Imaging Camera <ol><li> Avvolgere una coperta di riscaldamento (senza spegnimento automatico) intorno alla bottiglia aCSF e regolare la fiamma al minimo l&#39;impostazione / media. </li><li> Inserire una linea di perfusione aCSF dedicata nella bottiglia collegata ad una pompa di perfusione e in linea riscaldatore che è controllata da una sonda bipolare regolatore di temperatura e retroazione della temperatura, come mostrato nella Figura 1A. </li><li> Fissare un microscopio piatta inserto fase (152 x 102 mm) per la 2-fotoni di eccitazione / confpalco microscopio Ocal dotato di un contenitore di fuoriuscita. </li><li> Mettere un grande camera di perfusione open-bagno (W x L x H; 12 x 24 x 8 mm) nel contenitore fuoriuscita di accogliere e fornire un flusso continuo di fresco ossigenato aCSF al midollo spinale ex vivo (vedi Figura 1B per un ex adeguato Vivo l&#39;imaging disegno della camera). </li><li> Collegare la porta di uscita del metallo del riscaldatore in linea alla camera di ex vivo di immagini utilizzando tubi adatti. Inserire un tampone assorbente sottile sotto della camera ex vivo imaging per aiutare a mantenere la temperatura del buffer / tessuto durante l&#39;imaging. </li><li> Rispettare la camera di ex vivo imaging per il fondo dell&#39;inserto container fuoriuscita / stage con tack appiccicoso rimovibile. La malleabilità del tack appiccicoso consentirà la camera da regolare come necessario per garantire percorso ottico del obiettivo è perpendicolare alla superficie del tessuto. Se necessario, utilizzare un livello Bullseye per regolare la camera. </li><li> Fissare unsonda in linea risposte riscaldatore temperatura vicino alla camera di ingresso del fluido e un tubo di aspirazione in acciaio inox collegato ad una linea di vuoto all&#39;uscita della camera. Supporti a nastro magnetico e appropriato micropipetta sono utili in questo senso. Accendere la sorgente di vuoto. </li><li> Accendere la pompa di perfusione per iniziare a riempire la camera di imaging con aCSF ossigenato. Impostare la pompa di perfusione a 1,5-2 ml al minuto. </li><li> Controllare il volume del aCSF nella camera di imaging regolando la linea del vuoto. È importante che vi sia sufficiente aCSF nella camera di imaging per coprire il segmento del midollo spinale e permettere sufficiente distanza di lavoro tra un obiettivo immersione acqua e la superficie del tessuto. La mielina e gli assoni possono essere negativamente influenzate se il segmento di tessuto non è completamente immerso in fresco ossigenato aCSF porta artefatti per sperimentatore-indotte. </li><li> Regolare il regolatore di temperatura del riscaldatore in linea in modo che la temperatura perfusato nella camera di imaging è temperatura ambiente. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Dissezione di adulti Murine cervicale del midollo spinale <ol><li> Euthanize un adulto 6-10 settimane di età Thy1 -YFP topo transgenico (uso ceppo appropriato che ha l&#39;espressione della proteina fluorescente in radice dorsale neuroni gangliari) iniettando una dose eccessiva del pentobarbital sodico anestesia (200 mg / kg) mediante iniezione intraperitoneale. </li><li> Una volta sotto il corretto livello di anestesia (per esempio, nessuna reazione a pizzico punta e perdita di riflesso corneale), barba accuratamente la pelle sovrastante il midollo spinale e il cervello con i tagliatori chirurgici. Detergere la pelle con betadine e il 70% pastiglie etanolo. </li><li> Spray al torace / addome con il 70% di etanolo, quindi profumato il soggetto transcardiaca utilizzando refrigerata, CarboGen-bolle basso Ca 2+ aCSF. (Vedi Figura 1C per il banco di dissezione suggerito top istituito). </li><li> Come il fegato impallidisce, fissare l&#39;ago perfusione nel cuore con un piccolo clip. Girare il soggetto sopra per accedere al lato dorsale rasata diil soggetto e pulire la zona rasata con il 70% di etanolo. </li><li> Fare un incisione cutanea dorsale lungo la linea mediana a partire dal naso all&#39;hip con le forbici dissezione per esporre il cervello e la colonna vertebrale (Figura 2A). Fissare la preparazione mettendo perni al naso e anca. </li><li> Utilizzando un microscopio di dissezione da questo punto in poi, saldamente tagliare attraverso la superficie dorsale del cranio a livello dei bulbi olfattivi. Inserire una delle punte forbice nei bordi laterali della incisione e taglio lungo i bordi della calotta cranica bilateralmente fino cervelletto. NOTA: Non accise completamente la calotta cranica, come è necessario in seguito a sollevare il tessuto sovrastante dal midollo spinale durante la dissezione (Figura 2B). </li><li> Sollevare la calotta cranica per esporre il cervello. Tagliare delicatamente i bordi destro e sinistro del midollo interparietale (situato il cervelletto) e tirarlo indietro caudale per esporre il tronco cerebrale / midollo spinale (Figura 2C </strong&gt;). </li><li> Usare le forbici fine punta terranno a un angolo di 45 ° rispetto alla superficie della tavola e tagliare le vertebre bilateralmente appena inferiore alle radici nervose posteriori. NOTA: Evitare il contatto con le colonne dorsali bianche luminose. Queste fibre sono quelli che verranno immagine (Figura 2D) e possono essere facilmente danneggiati. </li><li> Sollevare la superficie zucchetto e dorsale della colonna vertebrale, con pinza sottile a punta, tirando delicatamente il tessuto sovrastante in un unico pezzo, come i tagli sono fatti per esporre il midollo spinale. Continuare a tagliare vertebre al livello superiore del torace per isolare un segmento 1-2 cm del midollo cervicale per la successiva formazione immagine (figura 2E). </li><li> Usare le forbici per tagliare il parallelo di tessuto / ossea alla colonna vertebrale e dei tessuti chiari sotto la colonna. Rendere questi tagli come livello possibile. È molto importante che il tessuto sia piatto nella camera in modo che il cavo sia in piano per l&#39;imaging. </li><li> Utilizzare un # 11 bisturi al transetto del tronco cerebrale (oltre ilterminazione delle fibre fasciculus gracili) ea livello toracico superiore per isolare il segmento midollo spinale cervicale (vedere Figura 2F). Usare le forbici per tagliare il tessuto / ossea a questi stessi due punti. Il tessuto isolato dovrebbe contenere i 2/3 della colonna vertebrale, che comprende il tronco cerebrale caudale, l&#39;allargamento cervicale, e del midollo spinale toracico superiore (Figura 2G). </li><li> Porre la colonna vertebrale isolato in una scatola Petri di CarboGen-bollito, raffreddato a basso Ca 2+ aCSF. Se necessario, tagliare il tessuto sotto la colonna vertebrale fino a adagiata nel piatto. </li><li> Trasferire la colonna vertebrale isolata alla camera di imaging ex vivo e aumentare gradualmente la temperatura perfusato più di 1 ora a 36-37 ° C. Mantenere questa temperatura durante l&#39;imaging. </li></ol> 4. Posizionamento di Ex Vivo midollo spinale in Imaging Camera e mielina Etichettatura con Nile Red <ol><li> Fissare adeguatamente la colonna vertebrale in iCamera Maging con un appropriato fetta raccordo tenere premuto modificata con una piattaforma griglia verticale costituita da fili sottili Lycra (rimuovere le discussioni centrali della piattaforma di rete per consentire lo spazio per il midollo spinale; vedi Figura 3A). </li><li> Scongelare una aliquota di Nile Red (5 stock mM in DMSO e 0,22 micron filtrato; possono essere memorizzate per 1 mese a 4 ° C, o 6 mesi a -20 ° C al buio). Appena prima di aggiungere Nilo Red alla camera di imaging, ridurre la portata della pompa di perfusione e regolare la linea del vuoto per assicurare il fluido nella camera comprende sempre il midollo spinale. </li><li> Aggiungere 5-10 ml di soluzione madre Nile Red alla camera di imaging verso la fine caudale del cavo (Figura 3B). Utilizzare una pipetta 1 ml di mescolare delicatamente Nile Red in tutta la camera. Lasciare Nile Red di rimanere in camera per 1-2 minuti, quindi inserire la linea del vuoto indietro e regolare la pompa di perfusione a 1,5-2 ml al minuto di perfusione continuamente il midollo spinale. </li><li> Sollevare con cautela palco microscopioe allineare l&#39;obiettivo con il centro del segmento del midollo spinale e medialmente sulle colonne dorsali finché l&#39;obiettivo ad immersione acqua è circa 10 mm dalla superficie del aCSF nella camera. Usate il microscopio volante fuoco revolver per portare lentamente l&#39;obiettivo verso il basso fino a toccare leggermente la superficie del aCSF. Utilizzare una sorgente luminosa epifluorescente concentrare le colonne dorsali nel campo di vista (Figura 3C). </li></ol> 5. Ex Vivo Imaging del cavo del mouse spinale con TPLSM e laser-indotta Spinal Cord Injury (Lisci) NOTA: La vena posteriore fornisce un marcatore utile per centrare il tessuto come le fibre Fasciculus gracili (provengono dal corpo cellulare dei gangli spinali e salire da T6 e sotto lungo la linea mediana del midollo spinale) in parallelo con questo vaso sanguigno. Le spesse YFP + cervicale proiezioni radici dorsali forniscono anche un indicatore utile come fibre salire e scendere lateralmente alla YFibre FP + Fasciculus gracile che sono più piccoli di diametro. <ol><li> Una volta che il tessuto del midollo spinale è allineato in modo appropriato, passare alla modalità di scansione laser per eseguire l&#39;imaging di base degli ascendenti fasciculus gracile fibre mieliniche. Per eccitare sia YFP e Nilo Red, utilizzare una sorgente laser a due fotoni sintonizzati a 950 nm (~ 17 mW misurata all&#39;uscita di un 25X, 1.1 obiettivo NA) e dicroici appropriate (DM) e filtri passa-banda per isolare l&#39;emissione fluorescente dei fluorofori (usiamo 525/50 DM560, DM640 600/60, 685/70 e, per separare YFP e Nilo rosso al giallo-arancio, rosso e canali estesi, rispettivamente). <ol><li> Se più del 3% degli assoni mostrano sferoidi assonali durante l&#39;imaging di base (30-60 min), eliminare la preparazione a causa di artefatti sperimentatore-indotta. </li></ol></li><li> Indurre un Lisci ingrandendo il campo visivo a 30.3X (per creare un diametro ablazione ~ 20 micron). Tune il laser a 800 nm, e aumentare la potenza del laser a ~ 110 mWil campione. Lasciare 5 completo campo delle scansioni vista laser per garantire le fibre sono completamente recisi. </li><li> Confermare Lisci modificando le impostazioni laser alle impostazioni di imaging (950 nm, 17 MW a campione, 2.08X) e scansionare il tessuto di visualizzare l&#39;ablazione. Verificare il diametro dell&#39;ablazione e che gli assoni ablazione primari sono completamente sezionato (vedere Figura 3D). Utilizzare le impostazioni di time-lapse sul microscopio combinato con z cattura per registrare la risposta dinamica di assoni e mielina per infortunio fino a 8-10 + hr dopo l&#39;infortunio. NOTA: Se l&#39;ablazione è incompleta (cioè, transection incompleta di fibre), scartare la preparazione, la determinazione dei meccanismi di lesioni primarie e secondarie saranno confusi. Inoltre, isolati segmenti del midollo spinale possono essere esposte fino a 24 ore post-Lisci con solo lieve a moderata danno tissutale Lisci-indipendente. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Descriviamo un metodo dell&#39;imaging ex vivo midollo spinale assoni mielinizzati (cioè, fasciculus gracile) combinata con una lesione del midollo spinale indotta da laser per studiare la progressione dinamica sia degenerazione assonale mieliniche primaria e secondaria nel tempo. Ex vivo immagini della superficie di midollo spinale supera molte delle complicazioni associate con l&#39;imaging in vivo come artefatti di movimento e il potenziale di ipossia sperimentatore indotta durante...

La degenerazione degli assoni è una causa importante di morbilità abbracciano diverse condizioni neurologiche tra cui neurotrauma, ictus, autoimmuni e malattie neurodegenerative. A differenza del sistema nervoso periferico (PNS), sistema nervoso centrale (SNC) assoni hanno una limitata capacità di rigenerare volta feriti causa sia barriere intrinseche ed estrinseche (cioè, molecole inibitrici della crescita assonale prodotti durante la formazione di cicatrici e liberato durante mielina degenerazione) 1 -7. Sebbene molti di questi ostacoli sono stati ampiamente esplorato, interventi terapeutici mirati per prevenire CNS degenerazione assonale, promuovere la rigenerazione assonale robusto, e ripristinare connectively funzionale, restano limitati. Gli assoni una volta separati dal loro soma subiscono un processo di degenerazione stereotipata nota come degenerazione walleriana che è caratterizzata da gonfiore assonale, formazione sferoidale ed eventuale frammentazione (rivisto in 8). Incontrasto, il moncone prossimale che rimane in continuità con la soma di un assone periferiche transected, forma una tumefazione alla sua estremità, muore al nodo più vicino di Ranvier, e può quindi avviare la crescita formazione cono, un prerequisito vitale necessario per la successiva rigenerazione assonale 9-11. Al contrario, le terminazioni degli assoni prossimali di molti assoni centrali caratteristica forma &quot;endbulbs&quot; o lampadine retrazione, non riescono a formare coni di crescita, e invece rientrare dal sito della lesione dove rimangono per mesi dopo l&#39;infortunio 12-15. Oltre al danno assonale primario, ulteriore danno assonale / perdita può verificarsi anche a assoni che sono stati in gran parte risparmiata dalla lesione iniziale. Questa perdita assonale ritardato di assoni inizialmente risparmiati viene definita degenerazione assonale secondaria. Questa risposta inerente assoni del SNC al danno rende la rigenerazione assonale funzionale un obiettivo ancora più difficile da raggiungere nel cervello e nel midollo spinale. Anche se hallmarks di danno assonale (ad esempio, la formazione sferoide, lampadine di svincolo) sono state ben caratterizzate da tessuti post mortem e modelli sperimentali di degenerazione assonale, studio dei meccanismi molecolari alla base di questi processi dinamici è stato limitato. La maggior parte di questi studi si è basata su osservazioni endpoint statiche che non hanno di per sé di catturare singole risposte assonale nel tempo. Anche se esogeno applicate traccianti assonali sono stati utili a chiarire le risposte assoni dalle sezioni statiche e durante l&#39;imaging dal vivo, la disponibilità di marcatori assonale geneticamente codificati ha notevolmente migliorato la nostra capacità di visualizzare assoni in tempo reale utilizzando la microscopia a fluorescenza. Infatti, un rapporto seminale da Kerschensteiner e colleghi prima ha fornito prova diretta di degenerazione assonale e rigenerazione in vivo utilizzando topi Thy1 GFP-S che codificano la proteina fluorescente verde in sottoinsiemi di neuroni che inviano le loro proiezioni nelle colonne dorsali del midollocavo 16. Immagini dal vivo utilizzando due approcci microscopia a scansione laser fotoni (TPLSM) e l&#39;etichettatura proteina fluorescente genetico delle cellule di interesse continua a fornire prove dirette e comprensione meccanicistica in molti diversi processi dinamici come la degenerazione assonale, Ca 2+ segnalazione, la rigenerazione assonale, astrociti fisiologia, la fisiologia della microglia, e la risposta al danno 17-25. In contrasto con gli assoni, si sa molto poco di risposte mielina al danno in tempo reale. La mielina è una componente vitale della materia bianca prodotta e mantenuta da oligodendrociti nelle cellule del sistema nervoso centrale e di Schwann nel PNS. Mielina isola 99% della superficie di assoni e così facendo fornisce una elevata resistenza, bassa capacità rivestimento protettivo che supporta rapida ed efficiente propagazione dell&#39;impulso saltatory, recentemente da Buttermore et al. 26. Per catturare la risposta dinamica di mielina al danno si usa il solvatochromic, lipofilacolorante fluorescente Nile Red 27. Le proprietà solvatochromic di questa macchia vitale permettono spostamenti spettrali del suo spettro di emissione che dipende sull&#39;ambiente fisico-chimica 28,29. Queste proprietà sono utili al fine di conoscere i meccanismi di danno axomyelinic e può essere osservata con dicroici adeguatamente selezionati e filtri di emissione o risolti usando la microscopia spettrale 27. Ad esempio, lo spettro di emissione di Nile Red è blu-spostata in ambienti meno polari, ricchi di lipidi, come quelli trovati in adipociti e normale mielina del SNC (picco di emissione ~ 580-590 nm) 27. Al contrario, i picchi dello spettro di emissione di questo colorante vitale a ~ 625 nm in endbulbs formate da assoni subiscono deperimento assonale 27. Anche se il preciso meccanismo questi spostamenti spettrali specificamente in endbulbs rispetto mielina normale rimangono poco chiari, tali cambiamenti spettrali possono rivelare le alterazioni alla base di accumulo di proteine ​​o la disorganizzazione che porta aesposizione dei idrofobiche siti di legame di 27. Mentre l&#39;imaging in vivo è la metrica fondamentale per l&#39;osservazione del midollo spinale dinamiche danno assonale nel loro ambiente nativo, è tecnicamente impegnativo e richiede competenza chirurgica notevole, e spesso ripetere ambulatori per esporre la colonna dorsale che può introdurre artefatti sperimentali (ad esempio, l&#39;infiammazione e la cicatrice formazione). Inoltre, le apparecchiature costose è spesso necessario per permettere la sospensione e il posizionamento di un animale intatta sotto la lente obiettivo microscopio. Gli animali devono essere attentamente monitorati e per assicurare che rimangono caldo, al fine di garantire i fluidi sono reintegrati, e per assicurarsi che non ci sono segni di ipossia a causa di sessioni di imaging anestetizzati prolungati. Quest&#39;ultimo è estremamente importante in quanto assoni e mielina assolutamente richiedono perfusione costante e livelli di ossigeno adeguati a rimanere vitale. Tuttavia, questo non è spesso segnalata o monitorato in più studi in vivo perdata. Inoltre, artefatti da movimento a causa della frequenza cardiaca e la respirazione (isoflurano anestetizzati topo adulto: ~ 300-450 battiti al minuto (BPM) è ottimale per mantenere la saturazione di ossigeno 97-98% (tasso normale di ~ 632 BPM) e ~ 55-65 respiri al minuto (tariffa normale è ~ 163 respiri al minuto), rispettivamente)) 30 incontrato durante in vivo del midollo spinale di imaging make differenziare le risposte danno assonale primarie e secondarie con alta risoluzione microscopia a fluorescenza impegnativo come anche le scansioni laser più veloci inevitabilmente sono soggetti a questi movimenti artefatti. I progressi nella ultraveloci scanner di risonanza combinate con un impiantabile vertebrale rigida finestra incorniciate può consentire l&#39;imaging del midollo spinale murino in animali svegli, ma i tempi di scansione più veloce inevitabilmente ridurre il rapporto segnale rumore qualità dell&#39;immagine degradanti. Ulteriori miglioramenti nelle tecniche di imaging del midollo spinale, come attualmente utilizzate per l&#39;imaging cerebrale possono superare molti di questi ostacoli e di limitare le potenziali confonde introdotte dal inaperfusione tissutale dequate, ad esempio, 31-33. Molto di ciò che si conosce della sostanza bianca fisiologia e meccanismi di danno sostanza bianca è stato determinato utilizzando in vitro o ex vivo preparazioni di sostanza bianca dal nervo ottico, nervo periferico, e le strisce di midollo spinale sostanza bianca 34-41. Queste preparazioni continuano ad avanzare la nostra conoscenza dei meccanismi di lesioni bianche importa quanto consentono cambiamenti di fattori ambientali, controllata di farmaci e reagenti, valutazioni funzionali utilizzando elettrofisiologia, e dirette osservazioni microscopia a fluorescenza di assoni e mielina nel tessuto vivo controllati. Eppure, alcuni approcci precedenti per osservare assoni da midollo spinale strisce colonna dorsale o strisce di sostanza bianca ventrale inevitabilmente ferire assoni superficie durante la fase di rimozione che possono influenzare la risposta degli assoni strettamente opposti. Per capitalizzare le manipolazioni sperimentali di cui sopra e di evitare danni alla vefibre Ry sotto inchiesta, usiamo un modello del midollo spinale cervicale ex vivo in quanto impedisce il contatto diretto della parte dorsale del cavo. Così, l&#39;architettura della pia madre e adiacenti dorsali superficiali assoni colonna rimangono vitali e imperturbato durante l&#39;isolamento. Qui si descrive un approccio relativamente semplice che permette la visualizzazione diretta di assoni mielinizzati centrali come rispondono dinamicamente a una lesione focale in tempo reale fino a 8 - 10+ ore dopo l&#39;infortunio. La lesione del midollo spinale (Lisci) Modello indotta da laser consente la differenziazione tra i meccanismi di danno assonale primarie e secondarie, come la lesione primaria (sito di ablazione) rimane spazialmente vincolate nel tempo. La camera di imaging open-bagno è accessibile a un intervento terapeutico, la consegna dei reagenti, e manipolazioni ambientali. Agenti protettivi axomyelinic putativi possono essere rapidamente valutati in tempo reale da osservazioni dirette contro gli esperimenti lunghi e costosi che coinvolgono processi tessutoING, sezionamento, immunostaining, l&#39;acquisizione di immagini, e l&#39;analisi e quindi fornisce un modello utile surrogato per valutare le risposte acute e manipolazioni di protezione prima di testare gli agenti sperimentali di animali vivi.

<table><tbody><tr><td>Ampia camera da bagno con supporti slice</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27L</td><td>Per camera di imaging ex vivo</td></tr><tr><td>Supporti Slice standard</td><td>Warner Instruments</td><td>SS-3</td><td>Per camera di imaging ex vivo</td></tr><tr><td>Fissaggio Slice in plastica per camere RC-27L e RC-29 Warner</td><td>Instruments</td><td>SHD-27LP/10</td><td>Per camera di imaging ex vivo</td></tr><tr><td>Tubo di aspirazione, Serie 20 Design classico, per mancini</td><td>Warner Instruments</td><td>ST-1L</td><td>Per camera di imaging ex vivo</td></tr><tr><td>Soluzione Riscaldatore/raffreddatore in linea</td><td>Warner Instruments</td><td>SC-20</td><td>Per regolare la temperatura del perfusato durante l'imaging</td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura bipolare</td><td>Warner Instruments</td><td>CL-100</td><td>Per regolare la temperatura del perfusato durante l'imaging</td></tr><tr><td>Sistema di raffreddamento a liquido</td><td>Warner Instruments</td><td>LCS-1</td><td>Per regolare il perfusato temperatura durante l'imaging</td></tr><tr><td>Assemblaggio dei cavi per i controller del riscaldatore</td><td>Warner Instruments</td><td>CC-28</td><td>Per regolare la temperatura del perfusato durante l'imaging</td></tr><tr><td>Termizzatore a cordone di ricambio per cavo CC-28</td><td>Warner Instruments</td><td>TS-70B</td><td>Per regolare la temperatura del perfusato durante l'imaging</td></tr><tr><td>Supporto magnetico con tubo di aspirazione Strumenti</td><td>per le bioscienze</td><td>MTH-S</td><td>Per mantenere l'aspirazione a vuoto in acciaio inossidabile tubi&nbsp;</td></tr><tr><td>Supporto regolabile</td><td>Strumenti per le bioscienze</td><td>MTH</td><td>Per tenere la sonda di temperatura</td></tr><tr><td>sigillante</td><td></td><td></td> siliconico trasparente <td>Per la camera di imaging ex vivo</td></tr><tr><td>supercolla</td><td></td><td></td><td>Per la camera di imaging ex vivo</td></tr><tr><td>Strisce</td><td></td><td></td> sottili di plexiglass <td>Per la camera di imaging ex vivo</td></tr> rosso <tr><td>nilo</td><td>Life Technologies</td><td>N-1142</td><td>Per l'etichettatura della mielina</td></tr></tbody></table>

un ex vivo laser-indotta spinal cord injury modello per valutare i meccanismi di degenerazione assonale in tempo reale

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Assoni SNC feriti non riescono a rigenerarsi e spesso ritrarre lontano dal luogo di ferita. Gli assoni risparmiati dalla lesione iniziale possono poi subire una degenerazione assonale secondaria. La mancanza di formazione cono di crescita, la rigenerazione, e la perdita di ulteriori proiezioni assonale mieliniche all&#39;interno del midollo spinale limita notevolmente il recupero neurologico dopo un trauma. Per valutare come centrale mielinizzati assoni del midollo spinale rispondono al danno, abbiamo sviluppato un modello ex vivo che vive midollo spinale utilizzando topi transgenici che esprimono la proteina giallo fluorescente in assoni e una focale e lesioni del midollo spinale indotta da laser altamente riproducibile per documentare il destino di assoni e mielina (colorante fluorescente lipofila Nile Red) nel tempo utilizzando la microscopia a due fotoni di eccitazione time-lapse. Processi dinamici come lesioni acute assonale, retrazione assonale e mielinica degenerazione sono meglio studiati in tempo reale. Tuttavia, la natura non-focale delle lesioni basate contusione-e artefatti da movimento rilevatodurante in vivo del midollo spinale di imaging make differenziare le risposte danno assonale primarie e secondarie con alta risoluzione microscopio impegnativo. Il modello in vivo ex midollo spinale descritto qui imita alcuni aspetti di rilevanza clinica contusione / patologie assonale compressione indotta tra cui gonfiore assonale, formazione sferoide, transezione assonale, e peri-assonale gonfiore fornendo un modello utile per studiare questi processi dinamici in tempo reale. I principali vantaggi di questo modello sono eccellenti risoluzione spazio-temporale che permette la differenziazione tra l&#39;insulto primario che danneggia direttamente gli assoni e dei meccanismi di lesioni secondarie; infusione controllata di reagenti direttamente al bagno perfusato il cavo; alterazioni precise del milieu ambientale (ad esempio, il calcio, ioni sodio, noti collaboratori di danno assonale, ma vicino impossibile da manipolare in vivo); e modelli murini offrono anche un vantaggio in quanto forniscono la possibilità di visualizzare emanipolare popolazioni di cellule geneticamente identificati e strutture cellulari. Qui, descriviamo come isolare e immagine vivente midollo spinale di topi per catturare dinamiche di danno assonale acuta.

Dettagli di un laboratorio appropriata stabilita necessarie per isolare, mantenere la vitalità, e l'immagine del midollo spinale ex vivo è mostrato in Figura 1. Il microscopio deve essere dotato di un laser pulsato a femtosecondi accordabile, dicroics appropriati e filtri di emissione, e acqua immersione lente obiettivo con un elevato apertura numerica (≥1.0). Per garantire la redditività del midollo spinale durante la dissezione, la procedura deve essere eseguita in presenza di refrigerate oss...

Presentiamo un protocollo che utilizza la microscopia time-lapse con eccitazione a due fotoni per visualizzare simultaneamente la dinamica delle lesioni degli assoni e della mielina in tempo reale. Questo protocollo proposto consente di studiare fattori sia intrinseci che estrinseci che possono influenzare il destino dell'assone mielinizzato centrale dopo una lesione e contribuire alla disabilità clinica permanente.

Un Ex Vivo Laser-indotta Spinal Cord Injury modello per valutare i meccanismi di degenerazione assonale in tempo reale

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare i meccanismi di degenerazione assonale acuta in tempo reale. Ciò si ottiene isolando il tessuto neuro e del midollo spinale YFP positivo della coscia, perfondendo continuamente il tessuto con liquido cerebrospinale artificiale ossigenato a basso contenuto di calcio. Quindi il tessuto del midollo spinale viene allineato sotto un obiettivo da microscopio a due fotoni mantenendo le condizioni fisiologiche e la mielina viene colorata con il colorante fluorescente lipofilo rosso Nilo.Successivamente, viene creata una lesione di dimensioni micro sulla superficie dorsale di una colonna dorsale regolando la potenza del laser al fine di sezionare gli assoni mielinizzati all'interno delle colonne. I risultati mostrano la retrazione degli assoni danneggiati, il rigonfiamento periassonale, la mielina e altre risposte cellulari basate su misurazioni quantitative delle immagini. Quindi il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che utilizziamo l'intero midollo spinale cervicale e quindi le fibre della colonna dorsale rimangono intatte.In questo modo si evitano danni alle fibre mieliniche centrali sottostanti, che si verificano comunemente durante la preparazione delle strisce di sostanza bianca. A dimostrare questa procedura sarà il Dr.Starlin ada, un borsista post-dottorato nel mio laboratorio che ha davvero sostenuto questa tecnica per prepararsi alla perfusione intracardiaca. Produrre basso contenuto di calcio, liquido cerebrospinale artificiale o A CSF con soluzioni BNC stock due volte concentrate per la profusione del midollo spinale ex vivo.Durante l'imaging, preparare il normale A CSF con due volte le soluzioni stock A e B in un flacone di vetro. Offrite queste soluzioni a pH 7,4. Tenere il liquido cerebrospinale a basso contenuto di calcio A raffreddato vicino all'area di dissezione e mantenere il normale liquido cerebrospinale a temperatura ambiente vicino al microscopio.Fai bollire entrambe le soluzioni con l'auto e il gas per mezz'ora prima dell'uso e bollele continuamente mentre sono in uso. Quindi, preparare la camera di perfusione a bagno aperto per l'imaging. Innanzitutto, collegare l'uscita metallica dei riscaldatori in linea alla camera.Quindi far aderire la camera di imaging alla camera di fuoriuscita con una buona quantità di materiale appiccicoso in modo che vi sia la possibilità di regolare leggermente la posizione della camera di imaging. Fissare la sonda di temperatura di feedback dei riscaldatori in linea vicino all'ingresso del fluido e fissare il tubo di aspirazione in acciaio inossidabile alla linea del vuoto all'uscita della camera. Ora accendi la pompa del vuoto e la pompa di perfusione.Una volta che la camera si riempie di A CSF, ridurre la pompa a 1,5-2 millilitri al minuto. Quindi controllare il volume A CF nella camera tramite la posizione della linea del vuoto. Per regolare l'eutanasia da sei a 10 settimane TH un topo transgenico YFP.Innanzitutto, verifica che non ci sia una risposta riflessiva al pizzicamento delle dita. Quindi radere l'area che copre il midollo spinale e il cervello. Dopo la rasatura, pulire la pelle esposta con Betadine ed etanolo al 70%.Ora spruzzare il torace e la zona addominale con etanolo al 70% e perfondere il trans Cardi animale con carbogeno a basso contenuto di calcio A CSF. Quando il fegato inizia a impallidire, attacca l'ago di perfusione nel cuore con una clip. Quindi capovolgere l'animale e pulire il lato della pelle dorsale con etanolo al 70%.Fai un'incisione lungo la linea mediana dal naso all'anca per esporre la calotta cranica e il tessuto sopra le vertebre. Usa gli spilli per tirare da parte la pelle e fissare l'animale al naso e al fianco. Ora sposta la preparazione su un microscopio da dissezione con le forbici tagliate saldamente sulla superficie dorsale del cranio a livello dei bulbi olfattivi.Inserisci la punta delle forbici nell'incisione appena praticata e taglia lungo entrambi i bordi della calotta cranica per esporre il cervelletto. Non asportare completamente la calotta cranica. Sollevare la calotta cranica che espone il cervello e tagliare con cura i bordi sinistro e destro dell'osso interparietale sopra il cervelletto.Ora, mentre tiri delicatamente la calotta cranica e la superficie della colonna vertebrale dorsale, fai dei tagli appena sotto le radici nervose posteriori per esporre ulteriormente il midollo spinale. Quindi, utilizzando le forbici a punta fine, tagliare con cura le vertebre bilateralmente. Con un angolo di 45 gradi, è fondamentale evitare danni alle colonne dorsali.Queste fibre bianche brillanti si danneggiano facilmente senza prestare attenzione, continuando a tirare delicatamente indietro l'osso e il muscolo asportati mentre tagliano le vertebre. Tagliare uno o due centimetri per isolare un segmento di tessuto del midollo spinale cervicale adatto all'imaging. Quindi usa le forbici per tagliare il tessuto e l'osso parallelamente alla colonna vertebrale.Pulisci anche il tessuto sotto la colonna. Eseguire questi tagli il più livellati possibile perché è molto importante che il tessuto sia piatto a livello della camera per l'imaging. Infine, usa il bisturi numero 11 per sezionare il tronco encefalico oltre la terminazione delle fibre dell'erba ulu e a livello toracico superiore.Quindi usa le forbici per tagliare il tessuto e l'osso in questi due punti. Il tessuto isolato deve contenere due terzi della colonna vertebrale che comprende il tronco encefalico cordale, l'allargamento cervicale e il midollo spinale toracico superiore. Trasferire la colonna vertebrale isolata nella camera di imaging ex vivo e aumentare gradualmente la temperatura dell'otto perfuso tra 36 e 37 gradi Celsius nell'ora successiva.Mantenere questa temperatura durante l'imaging. Un aspetto critico di questo protocollo è quello di assicurarsi di isolare il midollo spinale senza danneggiare le fibre della colonna dorsale. Il secondo aspetto più critico di questo protocollo è garantire che il midollo spinale sia continuamente perfuso con liquido cerebrospinale artificiale ossigenato.Utilizzando un supporto per vetrini di tessuto modificato, fissare con cura la colonna vertebrale nella camera. È importante evitare di toccare il midollo spinale esposto, le colonne dorsali o di esercitare pressione su di esse con i fili più simili. Ora per colorare la mielina, interrompere brevemente il flusso della soluzione e rimuovere la linea del vuoto.Aggiungere da cinque a 10 microlitri di colorante rosso del Nilo da cinque millimolari vicino all'estremità cordale del midollo spinale. Quindi mescolare delicatamente la soluzione in tutta la camera di imaging e lasciare incubare il tessuto per un minuto o due. Una volta colorato, riportare il flusso di A CSF ossigenato tra 1,5 e due millilitri al minuto e sostituire la linea del vuoto utilizzando un fotomicroscopio a due.Visualizzare l'immagine del midollo spinale utilizzando un obiettivo ad immersione in acqua. Abbassare lentamente l'obiettivo sulla superficie A del liquido cerebrospinale, quindi mettere a fuoco il midollo spinale sotto la luce fluorescente AF. Ora passa alla modalità di scansione per l'imaging di base dell'erba ascendente.Fibre mielinizzate di Oculus. Per eccitare l'YFP e il rosso del Nilo, impostare l'eccitazione a 950 nanometri e isolare le emissioni fluorescenti con filtri DI cronici e passa-curva. Se entro un'ora dall'imaging si nota che più del 3% degli assoni contiene steroidi, significa che il midollo spinale è stato danneggiato durante l'isolamento.Ora è meglio scartare il preparato Per ferire il tessuto con il laser. Innanzitutto, individua un'area del tessuto che sembra essere a livello. Quindi aumentare l'ingrandimento dell'area di visualizzazione a 30,3x.Sintonizza il laser a 800 nanometri e aumenta la sua potenza a circa 110 milliwatt. Ora esegui cinque scansioni laser con campo visivo. Il risultato dovrebbe essere un'ablazione completa di 20 micron di diametro.Controllare la lesione con le impostazioni di imaging standard con il laser a 17 milliwatt e a 20,08 x di ingrandimento. Se le fibre assonali all'ablazione non sono completamente sezionate, scartare il preparato. Ora, utilizza le impostazioni time-lapse con le acquisizioni Z per effettuare registrazioni dinamiche della risposta agli infortuni.Il preparato può essere riprodotto per un massimo di 24 ore. Un segmento del midollo spinale è stato isolato e posizionato come descritto al basale T-P-L-S-M. La registrazione mostra che i sassoni articolari dell'erba mielininizzata sono assioni YFP positivi allineati parallelamente nella mielina colorata di rosso della guaina dinaro con pochi steroidi assonali o altri segni morfologici di degenerazione assonale.Si possono vedere dettagli fini come il naso del ROM VA evidenziato da punte di freccia. 40 minuti dopo dopo la lesione del midollo spinale indotta dal laser. La maggior parte degli assoni sezionati forma caratteristici bulbi assonali terminali e si ritraggono dal sito della lesione, gli assoni adiacenti al sito della lesione subiscono una degenerazione secondaria e il gonfiore assonale diventa più prominente.A differenza delle fibre retrattili trimestrali, la maggior parte dei bulbi assonali retrattili situati distalmente dalla lesione e gli steroidi erano fortemente marcati con il rosso del Nilo, suggerendo un cambiamento ambientale all'interno dell'assone. A sette ore, gli assoni continuavano a ritrarsi lontano dal sito della lesione. Tuttavia, questo è più evidente nei bulbi terminali situati distalmente o rostralmente dalla lesione rispetto ai bulbi terminali situati prossimalmente o cordalmente alla lesione.Alla fine, gli assoni che inizialmente erano stati risparmiati hanno subito gradualmente una degenerazione secondaria ritardata. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come isolare il neuro e il midollo spinale ed eseguire una lesione del midollo spinale indotta dal laser. Pertanto, sarai in grado di esaminare gli aspetti dinamici della degenerazione assonale primaria e secondaria in tempo reale.Le informazioni ottenute dall'utilizzo di questo sistema modello possono portare a un'importante comprensione meccanicistica del danno sia all'assone che alla mielina dopo una lesione.

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