Una nuova tecnica di analisi quantitativa di perdita dei capelli nei topi mediante analisi in scala di grigi

L'alopecia è una forma comune di perdita di capelli che può verificarsi in molte condizioni diverse, anche come effetto collaterale della chemioterapia. Abbiamo sviluppato un metodo per quantificare la caduta dei capelli nei topi, utilizzando un gel imager standard per eseguire un'analisi in scala di grigi, per facilitare lo studio di nuove promettenti terapie per l'alopecia.

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire una quantificazione della densità dei capelli utilizzando l'assorbimento della luce. Ciò si ottiene fotografando prima gli animali su un imager gel. I passaggi successivi consistono nel definire una regione di interesse sulla fotografia e determinare l'assorbimento della luce all'interno della regione di interesse.

Quindi l'assorbimento della luce viene confrontato con uno standard fotografico. In definitiva, l'assorbimento della luce può essere mediato tra animali trattati in modo simile per mostrare gli effetti di un intervento sulla crescita del pelo. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è imparziale, quantificabile e riproducibile.

Questo è estremamente importante perché consente di utilizzare standard, tecniche statistiche come Inova per determinare la significatività statistica dei risultati. Per questo protocollo, utilizzare un gel imager con una sorgente di luce incorporata per la fotografia riflettente. Ciò garantisce una buona uniformità della luce, mentre l'illuminazione trans crea un silhouetting inadatto all'analisi.

Iniziare preparando il gel imager, impostare la messa a fuoco e il campo visivo. Utilizzando del testo stampato, il mouse può essere leggermente sfocato poiché funziona effettivamente. Per ridurre gli errori quantistici in piccole regioni di interesse, verificare l'uniformità della sorgente luminosa nella regione fotografata con l'obiettivo di un'eccellente media ottica nella regione di interesse.

Quindi, prepara l'animale. Scegliete un anestetico con insorgenza rapida e breve durata d'azione e somministrate quanto basta per mantenere gli animali fermi per la fotografia. Ora posiziona gli animali sulla termocamera verticalmente e il più vicino possibile al parallelo.

Per le fotografie dorsali, posizionare gli animali in posizione prona con gli arti distesi. Per le fotografie ventrali, posizionare gli animali in posizione supina. Assicurarsi che non siano ruotati lateralmente.

I valori di assorbimento possono essere estratti tra le immagini, ma non è per questo che la macchina è stata progettata. Quindi l'aggiunta di uno standard in scala di grigi ci permette di normalizzare i valori di assorbimento durante la compilazione dei dati. Ora posiziona lo standard della scala di grigi nella regione fotografata.

Quindi chiudere la camera e ridurre l'illuminazione ambientale che potrebbe entrare nella camera sulla fotocamera. Impostare lo stop F su un'esposizione che renda l'area di interesse non sovrasatura o sottoesposta. Quindi scatta una fotografia.

Se lo stop F viene scelto in modo tale che l'immagine sia satura, il valore della scala di grigi sarà fissato al valore e B di nessuna utilità. Quindi cambia l'F.Stop di uno, mantenendo l'area di interesse e lo standard in un intervallo di esposizione lineare, e scatta una seconda fotografia con la fotografia completata. Metti gli animali su un tavolo riscaldante e monitorali fino a quando non si riprendono.

Sdraiato sternale. Quindi riporta gli animali nelle loro gabbie e infine nel vivaio per il pieno recupero. Per quantificare l'assorbimento della luce utilizzando il software di imaging su gel, contrassegnare le regioni di interesse sulle immagini degli animali per una vista dorsale dell'intero animale.

Usa un'immagine rettangolare, un'immagine ovale o uno strumento a mano libera per delineare uno spazio dagli arti superiori a quelli inferiori, estendendosi lateralmente il più possibile. Rimani entro i margini della schiena dell'animale per una visione ventrale dell'intero animale. Usa due rettangoli.

Uno per coprire la regione pelvica, che è curata, e uno per coprire la zona del torace, che non è curata. Anche le regioni di interesse più piccole, come il luogo in cui è stato somministrato un farmaco, possono essere contrassegnate in base alle esigenze. In secondo luogo, segnare la regione di interesse sullo standard di assorbimento della scala di grigi.

Quindi registrare l'assorbimento da ciascuna regione di interesse contrassegnata per il confronto tra le fotografie. Normalizzare i livelli di assorbimento allo standard di fondo utilizzando una relazione logaritmica tra esposizione e assorbimento. Per fare ciò, traccia una curva del log di esposizione rispetto al log di assorbimento.

Utilizzando i valori ottenuti dallo standard di assorbimento della scala di grigi, regolare le variazioni dello standard di ciascuna fotografia come segue. Per prima cosa, selezionare l'F-stop per la lettura del ROI e l'F-stop per il riferimento e calcolare l'assorbimento medio dello standard in tutte le fotografie alla lettura dell'F-stop. Questa media è il valore standard di riferimento o RSV.

Quindi, calcola la differenza di assorbimento tra le impostazioni F-Stop di lettura e di riferimento in ciascuna fotografia ed esegui gli stessi calcoli per lo standard e per ogni ROI definito. Ora, utilizzando i dati di un F-stop, calcola l'assorbimento corretto per ciascun ROI utilizzando la formula mostrata. Successivamente, applicare metodi statistici standard per analizzare i dati dei topi trapiantati C3 HHEJ, che modellano l'alopecia ADA sono stati analizzati utilizzando il metodo descritto a diverse esposizioni.

Le variazioni del ROI non sovrapposto sono state strettamente correlate come previsto. Confronti simili hanno prodotto la stessa stretta correlazione per un periodo di tre settimane. I topi sono stati sottoposti a imaging per quantificare la loro prevista perdita di capelli.

L'80% dei topi fotografati ha mostrato perdita di capelli in questo lasso di tempo. In confronto, i normali topi C 57 neri non hanno mostrato alcuna perdita di capelli nello stesso lasso di tempo. In un secondo studio, l'alopecia indotta dalla chemioterapia è stata quantificata utilizzando la tecnica descritta.

I topi sono stati trattati con ciclofosfamide per tre settimane e dopo due mesi hanno mostrato una significativa perdita di capelli rispetto ai controlli. Una volta padroneggiata, ogni immagine può essere analizzata in meno di cinque minuti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare la quantità di crescita dei peli nei roditori utilizzando un sistema di imaging su gel standard.