Name: Realizzazione substrati di coltura complessi utilizzando robotica microcontact stampa (R-μCP) e sequenziale Sostituzione nucleofila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Scopri la stampa microcontact robotica per creare substrati di coltura con spazzole PEG funzionalizzate ortogonalmente. Questo metodo automatizzato consente l'immobilizzazione spazialmente precisa di ligandi biologici per l'ingegneria tissutale.

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I finanziamenti per questo lavoro, GTK, TK e JDM sono stati forniti dal Wisconsin Institute for Discovery e dalla Wisconsin Alumni Research Foundation.

1. Generazione elastomerici Francobolli <ol style="margin-left: 40px;"><li> Per generare padroni di silicio del timbro PDMS, di design dispongono di modelli del fotomaschere utilizzando il software computer-aided design. <ol><li> Progettare il primo modello come 20 x 20 serie di corone circolari con 300 micron di diametro interno (ID) e 600 micron OD con 1.200 micron da centro a centro spaziatura. </li><li> Progettare il secondo pattern come 20 x 20 serie di corone circolari con ID 600 micron e 900 micron OD con 1.200 micron da centro a centro di spaziatura. </li><li> Inoltre, mettere 1 x 1 mm 2 tacche di riferimento quadrati a tutti i quattro angoli di ogni disegno di matrice distanziati 1.200 micron da centro a centro del modello di angolo in un angolo di 45 °. </li><li> Realizzare i maestri di silicio per l'uso in questo esperimento con 1: 1 proporzioni, correlando ad una profondità di 300 micron funzione utilizzando tecniche di litografia norme definite altrove 15 o in collaborazione con una fonderia microfluidica. NOTA: Caratteristica Profondità inferiore a 100 micron possono portare a deformazioni anormali di francobolli prima del contatto con le superfici del substrato. NOTA: Questo protocollo inizia con avere maestri di silicio già ottenuti con i modelli descritti di fotoresist, che richiede attrezzature specializzate e camere pulite per creare. E 'meglio consultare un costruttore o nucleo possibilità di creare questi maestri fantasia. </li></ol></li><li> Maestri di silicio silanizzare O / N mediante incubazione con (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) vapore triclorosilano. NOTA: silano vapore è altamente tossico e deve essere maneggiato solo in una cappa. </li><li> Creare repliche inversa dei maestri silicio curando un rapporto 10: 1 di PDMS pre-polimero e PDMS induritore in cima maestri silicio silanizzato in una capsula di Petri O / N a 60 ° C. </li><li> Rimuovere le PDMS francobolli dai maestri di silicio, e legare i timbri acrilonitrile-butadiene-stirene (ABS) supporti o qualsiasi altro materiale rigidos utilizzo di colla. NOTA: il materiale di scelta non deve essere trasparente o biocompatibile. Tuttavia, si deve fornire una superficie piana per l'interfaccia con l'attrezzatura robotizzata e maggiore rigidità rispetto PDMS. </li></ol> 2. Coprioggetto Preparazione <ol style="margin-left: 40px;"><li> Coprioggetto microscopio risciacquo (24 x 50 mm # 1) in toluene, metanolo e ultrasuoni in acetone per 1 min prima del risciacquo con etanolo ed essiccamento sotto lieve corrente di azoto. NOTA: Maneggiare toluene e acetone solo in una cappa. </li><li> Coprioggetto cappotto con ~ 3.5 nm titanio (Ti), seguita da 18,0 nm oro (Au) con un mirato evaporatore a fascio elettronico. NOTA: Questa procedura è compatibile con una varietà di substrati oro rivestite compreso silicio e polistirene. Mentre è possibile generare questi in loco, substrati oro rivestite sono disponibili tramite fornitori commerciali anche. NOTA: i livelli di Ti deve essere di almeno 3 nm di spessore, mentre Au strati su supporti dovrebbe essere unt almeno 5 nm di spessore e può variare fino a 1 mm di spessore a seconda delle proprietà ottiche ideali del substrato finale 16,17. Substrati non sono tenuti ad essere otticamente trasparente per la fabbricazione; tuttavia, facilita l'analisi microscopica di substrati fabbricati. </li><li> Risciacquare Coprioggetto oro rivestite con etanolo e secco sotto azoto delicato immediatamente prima dell'uso. </li></ol> 3. R-μCP di anello esterno <ol style="margin-left: 40px;"><li> Prima di R-μCP con il sistema selettivo conforme braccio del robot articolato (SCARA), calibrare gli effettori degli strumenti robotici e sistemi dual telecamere di accompagnamento utilizzando il software del sistema. NOTA: Questi strumenti sono raffigurati nella figura 1. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52186/52186fig1highres.jpg"> Figura 1. R- μCP sistema e Braccio robotico Tooling. (A) vista su larga scala del sistema di R-μCP con tutte le attrezzature e arredi, (a) mandrino a vuoto, (b) bagno reagente, (c) fotocamera rivolta verso il basso, (d) apparecchio timbro nidificazione, (e) robotica utensile. (B) Attrezzature per robotica braccio raffigurante (f), strumento di incisione a punta di diamante e (g) strumento pneumatiche aspiranti in possesso di un (h) ABS-backed PDMS bollo. <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> Inserire manualmente un timbro PDMS con 600 ID micron e 900 micron OD sporgente annuli a faccia in giù nel dispositivo timbro di nidificazione. Inserire manualmente un coverslide oro rivestite appena pulita sopra il mandrino a depressione, mostrata in Figura 1A, e immobilizzarlo con il laboratorio vuoto collegata. </li><li> Utilizzando i controlli robot, allineare la fotocamera rivolta verso il basso sopra il punto centrale della coverslide rivestita d'oro, come in Figura 2A. NOTA: Questo punto può essere inizialmente definita mediante ispezione visiva e non richiede grande precisione, come il timbro PDMS è molto larger quanto la slitta rivestita d'oro. </li><li> Istruire il braccio robotico per incidere quattro riferimento "X" marchi di cui i vertici di un quadrato di dimensioni 3,8 millimetri di 3,8 millimetri centrati sul coverslide oro rivestite utilizzando lo strumento di incisione a punta di diamante attaccato al braccio robotico. (Illustrato nella figura 2B; processo automatizzato) NOTA: In questo modo tutti e quattro i punti di riferimento sono all'interno di un quadro visivo della telecamera rivolta verso il basso. </li><li> Utilizzando i robot attrezzature pneumatiche aspiranti, pick-up e tenere premuto il PDMS Timbro 1 mm sopra il dispositivo timbro nidificazione come in Figura 2C. (Processo automatizzato) </li><li> Utilizzando la fotocamera rivolta verso l'alto e l'anello illuminazione a LED nella Figura 2D ed E, visualizza indici di riferimento quadrata del timbro e identificarli con il software della fotocamera 10 volte per determinare X medio del timbro, Y e offset angolare dal centro della asse robot utensili. (Processo automatizzato) </li><li> Come in <strong figura utilizzare la fotocamera rivolta verso il basso per visualizzare e rilevare segni di riferimento incise del coverslide volte determinare x media y sedi centrali offset angolare dal centro dell robot utensili. automatico> NOTA: un calcolo interno è svolto dal software del sistema robotico per allineare con precisione la X del coprioggetto, Y località del centro e offset angolari nelle future fasi R-μCP di timbro e. </li><li> 3.8) Posizionare il timbro in un bagno di alkanethiol iniziatore ATRP, ω-mercaptoundecyl bromoisobutirrato (2 mM in etanolo), come illustrato nella Figura 2F. (Processo automatizzato) </li><li> Rimuovere il timbro dalla soluzione alkanethiol e porlo sul flusso di azoto pressurizzato a 0,48 bar (5 psi) per far evaporare l'etanolo come in Figura 2G. Dopo 1 min aumentare la pressione del flusso di azoto è di 1,03 bar (15 psi) per garantire la secchezza uniforme. (Processo automatizzato) NOTA: asciugatura incompleta comporterà la perdita totale o parziale del modello di fedeltà. </li><li> Dopo l'essiccazione, spostare il timbro sulla posizione centro calcolato della slitta rivestita d'oro e abbassarlo a 100 micron incrementi monitorando forza motore asse Z come illustrato nella Figura 2H. NOTA: Questo viene comunicato come torsione subita dal motore asse Z e visualizzato nel software guida robot. (Processo automatizzato) </li><li> Arrestare abbassando il timbro una volta raggiunta la pressione prestabilita di 79,2 kPa, e mantenere il contatto con la slitta rivestita d'oro per 15 sec. (Processo automatizzato) NOTA: I valori di pressione qui sono ottimizzati per la progettazione timbro e funzionalità altezza corrente. Se il disegno di bollo viene modificato, in particolare per alto rapporto di aspetto francobolli, sintonizzare questi di conseguenza un processo di tentativi ed errori. </li><li> Rimuovere lentamente il timbro dalla diapositiva oro rivestite e mettere il timbro di nuovo nel dispositivo timbro di nidificazione. (Processo automatizzato) </li></ol> 4. SI-ATRP di PEGMEMA su micropatterned Coprioggetto <ol style="margin-left: 40px;"><li> Rilasciare la pressione di vuoto tenendo il coverslide micropatterned, e trasferirla in un pallone da 50 ml Schlenk. Seal e Degas la Schlenk pallone di utilizzare una pompa a vuoto. </li><li> Aggiungere 5,5 ml di miscela di reazione contenente la ATRP macromonomero PEGMEMA (208.75 mmoli), acqua (34,4 ml), metanolo (43,8 ml), rame (II) bromuro (1 mmol), e 2 ', 2-bipiridina (3 mmol) di la beuta Schlenk. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di ascorbato di sodio L-(454,3 mM) in acqua per iniziare l'attacco, e lasciarlo proseguire per 16 ore a temperatura ambiente sotto gas inerte. NOTA: Dopo l'aggiunta di L-ascorbato di sodio, colore reazione si sposterà dal verde chiaro al marrone scuro, come mostrato nella Figura 3A-B. NOTA: La reazione può continuare oltre 16 ore, ma non aumenta significativamente la lunghezza delle spazzole PEG. </li></ol><imgalt src='"/' files ftp_upload></imgalt> Figura 3. Apertura di SI-ATRP. (A) Avvio di reazione e (B) dopo il cambiamento di colore in seguito all'aggiunta di ascorbato di sodio L-. (C) Microscopio immagine di micropatterned superficie coverslide seguente procedura SI-ATRP. Bar Scala 1 mm. <ol start="4" style="margin-left: 40px;"><li> Rimuovere il coverslide micropatterned dal pallone Schenk e risciacquare con etanolo, acqua e etanolo e secco sotto flusso di azoto dolce. NOTA: A seguito di SI-ATRP, modificazioni della superficie dovrebbe essere visibile a occhio e può essere ripreso e analizzato al microscopio come in figura 3C. NOTA: Questo è il metodo più semplice per testare la precisione del processo in quanto evita la necessità di immunostain substrati. </li></ol> 5. Funzionalizzazione azide delle Catene micropatterned PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Posizionare il coverslide micropatterned in 20 ml di reazione flaconcino di vetro. </li><li> Aggiungere 6 ml di N, N -dimethylformamide (DMF) contenente 100 mM sodio azide nel flaconcino di reazione. Mantenere questa reazione a 37 ° C per 24 ore. NOTA: Maneggiare DMF solo in una cappa. Fare attenzione durante la pesatura fuori sodio azide. </li><li> Al termine, rimuovere il coverslide micropatterned dalla fiala di reazione e lavare con etanolo quindi acqua e asciugare in corrente di azoto. </li></ol> 6. passivazione delle Catene bromo funzionalizzati PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Mettere coverslide micropatterned in 20 ml fiale di vetro. </li><li> Aggiungere 6 ml di dimetilsolfossido (DMSO) contenenti etanolamina 100 mM e 300 mM trietilamina nel flaconcino di reazione. Mantenere questa reazione a 40 ° C per 24 ore. NOTA: Maneggiare DMSO, etanolammina, e trietilammina solo in una cappa. </li><li> Al termine rimuovere il coversl micropatternedide dal flaconcino di reazione, lavare con etanolo poi acqua e asciugare in corrente di azoto. </li></ol> 7. R-μCP di Annulus interne e SI-ATRP di PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Eseguire i punti R-μCP come precedentemente descritto nei passaggi 3,2 e 3,6-3,12, sostituendo un timbro PDMS con 300 micron e 600 micron ID annuli OD sporgenti, in modo che il annuli con le caratteristiche più piccole sono collocati all'interno delle corone circolari in precedenza micropatterned. NOTA: La soglia di pressione per questo francobollo è 132,0 kPa. Come accennato in precedenza, queste impostazioni di pressione sono ottimizzate per le caratteristiche provvisorie utilizzati in questo esperimento. </li><li> Eseguire i punti SI-ATRP come precedentemente descritto nei punti 4,1-4,4. </li></ol> 8. L'acetilene Funzionalizzazione di Catene micropatterned PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Mettere coverslide micropatterned in 20 ml di reazione flaconcino di vetro. </li><li> Aggiungere 6 ml di DMSO contenente 100 mMpropargylamine nel flaconcino di reazione. Mantenere questa reazione a temperatura ambiente per 24 ore. NOTA: Maneggiare DMSO e propargylamine solo in una cappa. </li><li> Al termine rimuovere il coverslide micropatterned dalla fiala di reazione e lavare con etanolo quindi acqua e asciugare in corrente di azoto. </li></ol> 9. rame-catalizzata "Click" biotinilazione di acetilene terminato Catene PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Mettere coverslide micropatterned in 20 ml di reazione flaconcino di vetro. </li><li> Aggiungere 6 ml di solfato di rame (15 mM) / Tris [(1-benzil-1H -1,2,3-triazol-4-il) metil] ammina (TBTA, 30 mM) (1: 1 v / v di acqua / DMF) contenente 562 mM azide-PEG 4 -Biotin coniugato nel flaconcino di reazione. Aggiungere 1,2 ml di acido L-ascorbico (0,15 mM) in acqua alla miscela per inizializzare la reazione. </li><li> Bubble azoto attraverso la soluzione di reazione per 10 sec, sigillare la fiala con Parafilm e reagire per 24 ore a temperatura ambiente. </li><li> Su completion rimuovere coverslide micropatterned dal flaconcino di reazione, sciacquare con acqua e metterla in un piatto di polistirolo 12-bene. </li></ol> 10. immunofluorescenza Rilevamento di Biotinylated acetilene Gruppi <ol style="margin-left: 40px;"><li> Bloccare coverslide micropatterned in DPBS (3% Donkey Siero) per 1 ora a temperatura ambiente. Colorazione per gruppi acetilene biotinilati con streptavidina-546 coniugato (2 mg / ml) in DBPs (3% asino siero in PBS) per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare coverslide micropatterned 5 volte con DPBS per 10 minuti e scuotendo con cautela. NOTA: Figura 4B illustra una immagine della diapositiva dopo questo passaggio è completato. </li></ol> 11. Rame esente "Click" biotinilazione di azoturo terminato Catene PEGMEMA NOTA: Se lo si desidera, questa operazione modifica substrato può essere eseguita in situ durante la coltura cellulare. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Lascia coverslide micropatterned in 12 pozzetti ppiatto olystyrene seguente DBPs risciacqua. </li><li> Aggiungere 2 ml di DBPs (o cella di coltura) contenenti 20 mM DBCO-PEG 4 -Biotin, e lasciare questa reazione di continuare per 24 ore a temperatura ambiente (o a 37 ° C in un incubatore). </li><li> Al termine, lavare coverslide micropatterned 5 volte con DPBS (o semplicemente eseguire un cambiamento media). </li></ol> 12. immunofluorescenza Rilevamento di Biotinylated azide Gruppi <ol style="margin-left: 40px;"><li> Colorazione per gruppi azide biotinilati con streptavidina-488 coniugato (2 mg / ml) in 2 ml DPBS (3% asino siero) per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare coverslide micropatterned 5 volte in DPBS per 10 minuti e scuotendo con cautela. </li><li> Immagine micropatterned coverslide con microscopio confocale a fluorescenza. Figura 4A-C raffigura immagini della diapositiva dopo questo passaggio è completato. NOTA: Quando si utilizzano supporti per tessuti saggi di cultura, ignorare le sezioni 10 e 12 del presente protocollo. Dopo il degre desideratoe di funzionalizzazione, sterilizzare il coverslide ingegnerizzato risciacquando entrambi i lati con 100% di etanolo ed essiccamento in corrente di azoto. Trasferire i vetrini in una cappa di sicurezza biologica sterile e sciacquare il vetrino con PBS cinque volte prima di procedere con la semina e coltura cellulare. </li></ol>

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<li>Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biomaterials.</a> Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).</li>
<li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li>
<li>Meitl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+printing+by+kinetic+control+of+adhesion+to+an+elastomeric+stamp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp.</a> Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario concorrente.

Substrati ideali per l&#39;ingegneria tissutale sarebbero bioispirati e quindi ricapitolano la distribuzione spaziale dei leganti critici bioattivi presenti all&#39;interno dei tessuti nativi. Avrebbero anche possedere proprietà dinamiche che consentono regolazioni temporali dei leganti e dei modelli spaziali in cui sono presentati per consentire la morfogenesi dei tessuti diretto e spazialmente limitate induzione del destino cellulare. Fabbricazione di tali substrati richiede l&#39;immobilizzazione di molteplici segnal...

La capacità delle superfici PEG-innestate per visualizzare leganti biochimici un legame covalente al tempo stesso mantenendo intrinseche proprietà non-fouling li rendono la scelta ideale per gli ambienti di microscala ingegneria personalizzate su substrati di coltura 1,2,3 fare. Le interazioni biospecifici mediate da ligando coniugata spazzole PEG consente l&#39;analisi riduzionistica degli effetti di segnali biochimici si trovano all&#39;interno del complesso in microambienti tessuto vivo su fenotipi di cellule singole. Inoltre, chimiche &quot;click&quot; bio-ortogonale possono essere utilizzati per facilitare l&#39;immobilizzazione direzionale di ligandi in modo che siano presentati in conformazioni native 4-6. Così, microscala patterning spaziale di PEG spazzole è uno strumento versatile per creare design in nicchie in vitro per studiare la segnalazione cellulare indotta da stimoli biochimici immobilizzati 6,7. Un metodo comune per la generazione di modelli spaziali di cu biochimicaes comporta stampa microcontact (μCP) substrati d&#39;oro rivestite con modelli di PEG alkanethiols coniugati. Poi, i monostrati auto-assemblati micropatterned (SAM) di alkanethiols PEG-ylated limita adsorbimento fisico di molecole biochimiche, ad esempio, le proteine, solo per le regioni non fantasia del substrato 8,9. Tuttavia, i SAM generati da questa tecnica sono sensibili all&#39;ossidazione a lungo termine mezzi di coltura cellulare. Così, μCP&#39;d alkanethiol SAM sono spesso ulteriormente innestate con PEG spazzole polimero con trasferimento atomo-superficie avviato polimerizzazione radicalica (SI-ATRP) per aumentare non sporcare la stabilità della regione 10. In particolare, μCP della iniziatore di polimerizzazione alkanethiol, ω-meraptoundecyl bromoisobutirrato, su superfici d&#39;oro rivestite seguite da SI-ATRP di poli (etilene glicole) metacrilato metil etere (PEGMEMA) monomeri genera superfici con micropatterned a lungo termine, stabile, e non fouling PEG spazzole. Inoltre, questi<html> sono in grado di essere ulteriormente modificato per presentare frazioni chimiche diverse 11. Approfittando di questa proprietà, Sha et. al. messo a punto un metodo per progettare substrati di coltura con spazzole PEGMEMA più componenti presentano ortogonali chimiche &quot;clic&quot;. In questo metodo, si avvalgono di una serie di passaggi μCP / SI-ATRP intervallati da sodio azide sequenziale, etanolammina, e propargylamine sostituzioni nucleofile per creare substrati di coltura che presentano modelli di microscala di più ligandi immobilizzati 6. Mentre la prospettiva di utilizzare tali sostanze chimiche in collegamento con μCP manuale per progettare nuovi substrati di coltura è immenso, è limitata dalla precisione e accuratezza con cui più passaggi μCP possono essere allineate su un unico substrato. Un alto livello di precisione e accuratezza sarebbe necessario per la fabbricazione riproducibile complesso in nicchie vitro utilizzando queste tecniche versatili. e_content &quot;&gt; Per affrontare questa limitazione, sono stati generati diversi sistemi μCP automatici e semi-automatici. Chakra et. al., messo a punto un sistema di μCP in cui timbri personalizzati sono posti su un sistema ferroviario e messi in contatto conforme con scivoli d&#39;oro rivestite con un attuatore pneumatico controllato da computer. Tuttavia, questo metodo richiede la realizzazione precisa dei disegni provvisorie personalizzati e riporta una precisione di 10 micron con nessuna relazione della precisione ottenuta durante l&#39;esecuzione multipla μCP passaggi 12. Più recentemente, un metodo che utilizza un sistema di accoppiamento cinematico integrato precisione sotto riportato 1 micron utilizzando un singolo modello, ma non erano in grado di allineare con precisione più pattern a causa della mancanza di un controllo preciso delle caratteristiche provvisorie da stampo per stampo 13. Inoltre, entrambi i metodi precedenti richiedono il substrato a rimanere fisso tra passi patterning , con ciò limitando sensibilmente la diversità dei chimici la modifica della superficie che possono essereutilizzata. Qui, descriviamo un sistema R-μCP automatizzato in grado di allineamento accurato e preciso di molteplici passaggi μCP pur consentendo la massima flessibilità nella progettazione e fabbricazione di bollo. Inoltre, i substrati modellati possono essere ripetutamente rimossi dal sistema tra frantumi, permettendo così l&#39;uso di diverse sostanze chimiche modifica substrato, incluse sostituzioni nucleofile sequenziali. Substrati ingegnerizzati l&#39;utilizzo di tali sostanze chimiche sono state utilizzate per colture cellulari in precedenza sia da noi 6,14 e altri 7. Così, abbiamo unito R-μCP e reazioni di sostituzione nucleofila sequenziali per sviluppare un metodo per la produzione scalabile di substrati di coltura con segnali biochimici complessi e micropatterned.

<table><tbody><tr><td>SCARA&nbsp;</td><td>Se</td><td>lo si desidera, sono disponibili modelli di fascia alta Epson</td> <td>LS3-401ST</td> con maggiore precisione.</tr><tr><td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetraidroottil)triclorosilano</td><td>Gelest</td><td>SIT8174.0</td><td>ATTENZIONE, Deve essere maneggiato solo in una cappa chimica. Quando si silanizzano i wafer, nessuno deve entrare nella cappa fino a quando tutto il silano non è stato evaporato.</td></tr><tr><td>Kit elastomero siliconico Sylgard 184</td><td>Ellsworth Adhesive Co NC9020938</td><td></td><td>Degassare accuratamente le soluzioni tramite esposizione al vuoto prima dell'uso. Sono accettabili kit alternativi come il Kit 182.</td></tr><tr><td>Vetrini di copertura #1 da 24 mm x 50 mm Fisher</td><td>Scientific</td><td>48393106</td><td>Questi possono essere acquistati da una serie di fornitori con dimensioni variabili in base alle esigenze.</td></tr><tr><td>CHA-600 Telemark Evaporatore a fascio di elettroni Telemark</td><td></td><td>SEC-600-RAP</td><td>richiede una formazione specializzata.</td></tr><tr><td>EPSON LS3 SCARA</td><td>EPSON</td><td>LS3-401ST</td><td></td></tr><tr><td>&omega;-mertcaptoundecil bromoisobutirrato</td><td>Prochimia</td><td>FT 015-m11-0.2</td><td>Conservare a -20 &deg;C. Altri iniziatori ATRP possono essere utilizzati come questo R-&mu; La piattaforma CP è applicabile a tutte le modalità di micropatterning.</td></tr><tr><td>Schlenk Tubo Pallone 50 ml</td><td>Synthware</td><td>60003-078</td><td>Richiede tappi in gomma con diaframma.</td></tr><tr><td>Poli(glicole etilenico) metil etere metacrilato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447943</td><td>Spedito contenente inibitori readical liberi MEHQ e BHT.</td></tr><tr><td>Metanolo (certificato ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>ATTENZIONE, maneggiare solo in cappa chimica.</td></tr><tr><td>Bromuro di rame (II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>437867</td><td>ATTENZIONE, limitare l'esposizione con maschera chirurgica.</td></tr><tr><td>2,2'-Bipiridina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D216305</td><td>ATTENZIONE, limitare l'esposizione con maschera chirurgica.</td></tr><tr><td>Sodio L-Ascorbato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Fiale a scintillazione in vetro borosilicato</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-340-4E</td><td></td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>ATTENZIONE, limitare l'esposizione con maschera chirurgica.</td></tr><tr><td>N,N-dimethyformamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>ATTENZIONE, maneggiare solo in cappa chimica.</td></tr><tr><td>Etanolammina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>398136</td><td>ATTENZIONE, maneggiare solo in cappa chimica.</td></tr><tr><td>Trietilammina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0886</td><td>ATTENZIONE, maneggiare solo in cappa chimica.</td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td>ATTENZIONE, maneggiare solo in cappa chimica.</td></tr><tr><td>Propargylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P50900</td><td>ATTENZIONE, maneggiare solo in cappa chimica.</td></tr><tr><td>200 Proof Ethanol</td><td>University of Wisconsin Material Distribution Services</td><td>2292</td><td>ATTENZIONE, maneggiare solo in cappa chimica.</td></tr><tr><td>Azide-PEG3-Biotina</td><td>ClickChemistryTools</td><td>AZ104-100</td><td>Solubilizzato in DMF</td></tr><tr><td>Solfato di rame (II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1297</td><td>ATTENZIONE, limitare l'esposizione con maschera chirurgica.</td></tr><tr><td>Tris[(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]ammina (TBTA)</td><td></td>Acido L-ascorbico <td>Sigma Aldrich</td> 678937 <td></td></tr><tr><td>Tampone</td> fosfato <td>Sigma Aldrich</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina</td><td>Invitrogen</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Siero d'asina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td> Gli <td>articoli contaminati da siero d'asino sono considerati materiale a rischio biologico e devono essere smaltiti di conseguenza. Vari altri composti (ad es. BSA) sono disponibili e servono a questo scopo.</td></tr><tr><td>Piastra in Polistirene a 12 Pozzetti</td><td>Thermo Scientifit - NUNC</td><td>07-200-81</td><td>Le piastre possono essere acquistate da diversi fornitori con dimensioni variabili.</td></tr><tr><td>DBCO-PEG4-Biotina</td><td>Clickchemistytools</td><td>A105P4-10</td><td>Solubilizzato in DMF</td></tr><tr><td>Streptavidina, Alexa Fluor 488 Coniugato</td><td>Life Technologies</td><td>S-11223</td><td>Solubilizzato in PBS</td></tr><tr><td>Streptavidina, Alexa Fluor 546 coniugato</td><td>Life Technologies</td><td>S-11225</td><td>Solubilizzato in PBS</td></tr><tr><td>Nikon A1-R Microscopio confocale</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse Ti, A1R</td><td>Un microscopio a epifluorescenza è sufficiente per visualizzare substrati micropatternizzati funzionalizzati.</td></tr></tbody></table>

realizzazione substrati di coltura complessi utilizzando robotica microcontact stampa (r-μcp) e sequenziale sostituzione nucleofila

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

Nell'ingegneria tissutale, è auspicabile esibire il controllo spaziale della morfologia dei tessuti e del destino cellulare in coltura su scala micron. Per raggiungere questo compito possono essere utilizzati substrati di coltura che presentano spazzole innestate di poli(glicole etilenico) (PEG) creando regioni su microscala, non incrostate e resistenti all'adesione cellulare, nonché regioni in cui le cellule partecipano a interazioni biospecifiche con ligandi legati covalentemente. Per ingegnerizzare tessuti complessi utilizzando tali substrati, sarà necessario modellare in sequenza più spazzole PEG funzionalizzate per conferire bioattività differenziali e allineate in orientamenti su microscala che imitano nicchie in vivo. La stampa a microcontatto (μCP) è una tecnica versatile per modellare tali spazzole PEG innestate, ma la μCP manuale non può essere eseguita con precisione su microscala. Pertanto, abbiamo combinato la robotica avanzata con tecniche di litografia morbida e reazioni chimiche di superficie emergenti per sviluppare un metodo assistito da stampa robotica a microcontatto (R-μCP) per la fabbricazione di substrati di coltura con modelli complessi, su microscala e altamente ordinati di spazzole PEG che presentano sostanze chimiche ortogonali "a clic". Qui descriviamo in dettaglio il flusso di lavoro per la produzione di tali substrati.

L'uso di tecniche di allineamento μCP manuali per ingegnere substrati di coltura con array di spazzole PEG-innestate funzionalizzati con ortogonali "click" chimiche è stata dimostrata in precedenti lavori 6. Tuttavia, questo consente un controllo minimo dell'orientamento del modello e si traduce spesso in sovrapposizione delle aree funzionalizzati. Qui, un nuovo sistema R-μCP viene utilizzato per superare questa limitazione, e la sua capacità di precisione modello una serie di PEG pennello corone circolari co...

I substrati di coltura cellulare funzionalizzati con modelli su microscala di ligandi biologici hanno un'immensa utilità nel campo dell'ingegneria tissutale. Qui, dimostriamo la produzione versatile e automatizzata di substrati di coltura tissutale con spazzole multiple di poli(glicole etilenico) microstrutturate che presentano sostanze chimiche ortogonali che consentono l'immobilizzazione spazialmente precisa e sito-specifica di ligandi biologici.

Realizzazione substrati di coltura complessi utilizzando robotica microcontact stampa (R-μCP) e sequenziale Sostituzione nucleofila

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di generare substrati di coltura tissutale con più spazzole PEG a micro pattern, presentando sostanze chimiche ortogonali che consentono l'immobilizzazione spazialmente precisa e sito-specifica dei ligandi biologici. Ciò si ottiene mediante array di deposizione di tiolo acan, un iniziatore TRP mediante una stampa robotica a micro contatto su substrati rivestiti d'oro. Come seconda fase SI, viene eseguito un TRP sui substrati del micro pattern, che genera spazzole PEG con gruppi bromo terminali.Successivamente, i gruppi terminali di bromo vengono funzionalizzati con uno o due gruppi chimici reattivi al fine di consentire la mobilizzazione IM di ligandi biologici opportunamente preparati. Quindi l'intero processo viene ripetuto per funzionalizzare con un secondo gruppo chimico. I risultati mostrano microarray di due spazzole PEG funzionalizzate, ortogonalmente sovrapposte, con una precisione di 10 micron.Ciò viene verificato utilizzando un software di analisi delle immagini personalizzato dopo la coniugazione dei gruppi reattivi con molecole fluorescenti. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto a metodi come la stampa manuale a micro contatto è che la stampa robotica a micro contatto è in grado di sovrapporre più fasi di stampa con precisione al micron, consentendo al contempo la massima flessibilità e progettazione del substrato. L'accuratezza offerta da questo metodo, unita alle reazioni sequenziali di sostituzione nucleofila, ci permette di generare substrati di coltura tissutale che vengono funzionalizzati con più ligandi biologici che sono quindi in grado di esercitare un controllo temporale e spaziale del solfato su scala micron.Prima di S-I-A-T-R-P, un vetrino di copertina rivestito in oro avrebbe dovuto essere modellato con il timbro A-P-D-M-S. Questa procedura relativamente comune è spiegata in un protocollo di testo. Inizia rimuovendo la slitta del coperchio del brevetto dal robot rilasciando l'aspirapolvere.Quindi trasferirlo in un pallone da 50 millilitri di lunghezza, sigillare il pallone e applicare un vuoto negativo a 30 PSI. Successivamente, aggiungere 5,5 millilitri di miscela di reazione A TRP nel pallone utilizzando una siringa, quindi aggiungere 0,5 millilitri di L ascorbato di sodio in acqua anche tramite siringa. Osserva la reazione cambiare colore dal verde chiaro al marrone scuro.Lasciare che la reazione continui per 16 ore sotto gas inerte. Al termine della reazione, rimuovere il vetrino del coperchio e sciacquarlo con etanolo, quindi acqua e infine di nuovo etanolo. Quindi asciugarlo delicatamente con azoto.Il microarray di pennelli P-E-G-M-E-M-A innestati dovrebbe essere visibile ad occhio nudo. Usa la microscopia per rivelare questi cambiamenti in dettaglio per Azad funzionalizzare, le catene P-E-G-M-E-M-A. Trasferire il vetrino di copertura del modello in una fiala di reazione in vetro da 20 millilitri e aggiungere sei millilitri di DMF contenente 100 millimolari di azoturo di sodio.Lasciare andare la reazione per 24 ore a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, sciacquare il vetrino del coperchio del brevetto con etanolo e asciugarlo sotto un leggero flusso di azoto per pacificare le restanti catene P-E-G-M-E-M-A funzionalizzate con bromo. Trasferire il vetrino di copertura del modello micro in una fiala di reazione in vetro da 20 millilitri e aggiungere sei millilitri di DMSO contenente 100 millimolari di etanolammina e 300 millimolari di trietilammina.Lasciare che questa reazione proceda per 24 ore a 40 gradi Celsius il giorno successivo. Sciacquare il vetrino di copertura con etanolo e asciugarlo delicatamente sotto un getto di azoto. Il passo successivo consiste nel ripetere la stampa a micro contatto del robot utilizzando un secondo timbro PDMS e successivamente lo stampaggio.Utilizzare nuovamente SI A TRP per rappresentare graficamente il secondo pennello PEG micro array. Quindi è il momento di funzionalizzare l'acetilene del secondo micro array di catene P-E-G-M-E-A François. La copertura del micro pattern.Far scivolare in una fiala di reazione in vetro da 20 millilitri con sei millilitri di propagammina molare da 100 milligrammi in DMF. Lasciare che la reazione proceda per 24 ore. A temperatura ambiente il giorno successivo, sciacquare il vetrino del coperchio del brevetto con etanolo e asciugarlo sotto un leggero getto di azoto.Il vetrino del coperchio del brevetto è quindi pronto per l'esaltazione della biotina. Iniziare posizionando il vetrino del coperchio del micro brevetto in una fiala di reazione in vetro da 20 millilitri. In primo luogo, la biotina ha mangiato le catene terminate con acetilene.Aggiungere sei millilitri di solfato di rame con l'azide PEG coniugato a quattro biotina alla fiala di reazione, seguiti da 1,2 millilitri da 0,15. Acido rbic millimolare in acqua per inizializzare la reazione, bollare la reazione con azoto per 10 secondi. Quindi sigillare la fiala con paraform e lasciare che la reazione vada avanti per 24 ore.A temperatura ambiente il giorno successivo, sciacquare il vetrino di copertura con acqua e trasferirlo in una pirofila di polistirolo a 12 pozzetti. Quindi a temperatura ambiente a DPBS con siero d'asino per un'ora un'ora dopo, colorare nei gruppi esaltati di biotina con streptococco DEIN 5 46 coniugato a due microgrammi per millilitro in colorazione DPBS per due ore a temperatura ambiente due ore dopo. Sciacquare cinque volte il vetrino di copertura in DPBS con una vegetazione delicata.Tobi ITIN aate le catene azi terminate. Mettere il vetrino coprioggetti in un pozzetto di una piastra di polistirene a sei pozzetti e applicare due millilitri di DPBS contenente 20 micromolari D-B-C-O-P-G quattro biotina. Quindi incubare il vetrino di copertura per 24 ore a temperatura ambiente 24 ore dopo.Sciacquare il vetrino di copertura come prima delle quattro e macchiarlo con streptavidina 4 88. Coniugato a due microgrammi per millilitro in DPBS. Due ore dopo.Sciacquare nuovamente il vetrino di copertina, quindi visualizzarlo al microscopio. Utilizzando questo protocollo di stampa a micro contatto robotico. Un array accuratamente modellato di PEG brush ANN UI con gruppi di alkin terminali è stato modellato all'interno di un array separato di pennello PEG ANN UI più grande con gruppi di azi terminali.La distribuzione spaziale dei gruppi azide e alchinica è stata osservata utilizzando la chimica a scatto e il legame con la streptavidina delle sonde fluorescenti. Una sovrapposizione di entrambi i canali fluorescenti mostra come i timbri non si sovrappongano. La precisione dell'allineamento è stata calcolata sotto i 10 micron, che è ai limiti dello SCAR.Un sistema utilizzato per eseguire la stampa. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare substrati di coltura tissutale personalizzati utilizzando la stampa robotica a micro contatto per sovrapporre più array di pennelli a piolo. Funzionalizzato con chimica ortogonale.

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Realizzazione substrati di coltura complessi utilizzando robotica microcontact stampa (R-μCP) e sequenziale Sostituzione nucleofila (Video) | JoVE Journal

Realizzazione substrati di coltura complessi utilizzando robotica microcontact stampa (R-μCP) e sequenziale Sostituzione nucleofila

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