Realizzazione substrati di coltura complessi utilizzando robotica microcontact stampa (R-μCP) e sequenziale Sostituzione nucleofila

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di generare substrati di coltura tissutale con più spazzole PEG a micro pattern, presentando sostanze chimiche ortogonali che consentono l'immobilizzazione spazialmente precisa e sito-specifica dei ligandi biologici. Ciò si ottiene mediante array di deposizione di tiolo acan, un iniziatore TRP mediante una stampa robotica a micro contatto su substrati rivestiti d'oro. Come seconda fase SI, viene eseguito un TRP sui substrati del micro pattern, che genera spazzole PEG con gruppi bromo terminali.

Successivamente, i gruppi terminali di bromo vengono funzionalizzati con uno o due gruppi chimici reattivi al fine di consentire la mobilizzazione IM di ligandi biologici opportunamente preparati. Quindi l'intero processo viene ripetuto per funzionalizzare con un secondo gruppo chimico. I risultati mostrano microarray di due spazzole PEG funzionalizzate, ortogonalmente sovrapposte, con una precisione di 10 micron.

Ciò viene verificato utilizzando un software di analisi delle immagini personalizzato dopo la coniugazione dei gruppi reattivi con molecole fluorescenti. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto a metodi come la stampa manuale a micro contatto è che la stampa robotica a micro contatto è in grado di sovrapporre più fasi di stampa con precisione al micron, consentendo al contempo la massima flessibilità e progettazione del substrato. L'accuratezza offerta da questo metodo, unita alle reazioni sequenziali di sostituzione nucleofila, ci permette di generare substrati di coltura tissutale che vengono funzionalizzati con più ligandi biologici che sono quindi in grado di esercitare un controllo temporale e spaziale del solfato su scala micron.

Prima di S-I-A-T-R-P, un vetrino di copertina rivestito in oro avrebbe dovuto essere modellato con il timbro A-P-D-M-S. Questa procedura relativamente comune è spiegata in un protocollo di testo. Inizia rimuovendo la slitta del coperchio del brevetto dal robot rilasciando l'aspirapolvere.

Quindi trasferirlo in un pallone da 50 millilitri di lunghezza, sigillare il pallone e applicare un vuoto negativo a 30 PSI. Successivamente, aggiungere 5,5 millilitri di miscela di reazione A TRP nel pallone utilizzando una siringa, quindi aggiungere 0,5 millilitri di L ascorbato di sodio in acqua anche tramite siringa. Osserva la reazione cambiare colore dal verde chiaro al marrone scuro.

Lasciare che la reazione continui per 16 ore sotto gas inerte. Al termine della reazione, rimuovere il vetrino del coperchio e sciacquarlo con etanolo, quindi acqua e infine di nuovo etanolo. Quindi asciugarlo delicatamente con azoto.

Il microarray di pennelli P-E-G-M-E-M-A innestati dovrebbe essere visibile ad occhio nudo. Usa la microscopia per rivelare questi cambiamenti in dettaglio per Azad funzionalizzare, le catene P-E-G-M-E-M-A. Trasferire il vetrino di copertura del modello in una fiala di reazione in vetro da 20 millilitri e aggiungere sei millilitri di DMF contenente 100 millimolari di azoturo di sodio.

Lasciare andare la reazione per 24 ore a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, sciacquare il vetrino del coperchio del brevetto con etanolo e asciugarlo sotto un leggero flusso di azoto per pacificare le restanti catene P-E-G-M-E-M-A funzionalizzate con bromo. Trasferire il vetrino di copertura del modello micro in una fiala di reazione in vetro da 20 millilitri e aggiungere sei millilitri di DMSO contenente 100 millimolari di etanolammina e 300 millimolari di trietilammina.

Lasciare che questa reazione proceda per 24 ore a 40 gradi Celsius il giorno successivo. Sciacquare il vetrino di copertura con etanolo e asciugarlo delicatamente sotto un getto di azoto. Il passo successivo consiste nel ripetere la stampa a micro contatto del robot utilizzando un secondo timbro PDMS e successivamente lo stampaggio.

Utilizzare nuovamente SI A TRP per rappresentare graficamente il secondo pennello PEG micro array. Quindi è il momento di funzionalizzare l'acetilene del secondo micro array di catene P-E-G-M-E-A François. La copertura del micro pattern.

Far scivolare in una fiala di reazione in vetro da 20 millilitri con sei millilitri di propagammina molare da 100 milligrammi in DMF. Lasciare che la reazione proceda per 24 ore. A temperatura ambiente il giorno successivo, sciacquare il vetrino del coperchio del brevetto con etanolo e asciugarlo sotto un leggero getto di azoto.

Il vetrino del coperchio del brevetto è quindi pronto per l'esaltazione della biotina. Iniziare posizionando il vetrino del coperchio del micro brevetto in una fiala di reazione in vetro da 20 millilitri. In primo luogo, la biotina ha mangiato le catene terminate con acetilene.

Aggiungere sei millilitri di solfato di rame con l'azide PEG coniugato a quattro biotina alla fiala di reazione, seguiti da 1,2 millilitri da 0,15. Acido rbic millimolare in acqua per inizializzare la reazione, bollare la reazione con azoto per 10 secondi. Quindi sigillare la fiala con paraform e lasciare che la reazione vada avanti per 24 ore.

A temperatura ambiente il giorno successivo, sciacquare il vetrino di copertura con acqua e trasferirlo in una pirofila di polistirolo a 12 pozzetti. Quindi a temperatura ambiente a DPBS con siero d'asino per un'ora un'ora dopo, colorare nei gruppi esaltati di biotina con streptococco DEIN 5 46 coniugato a due microgrammi per millilitro in colorazione DPBS per due ore a temperatura ambiente due ore dopo. Sciacquare cinque volte il vetrino di copertura in DPBS con una vegetazione delicata.

Tobi ITIN aate le catene azi terminate. Mettere il vetrino coprioggetti in un pozzetto di una piastra di polistirene a sei pozzetti e applicare due millilitri di DPBS contenente 20 micromolari D-B-C-O-P-G quattro biotina. Quindi incubare il vetrino di copertura per 24 ore a temperatura ambiente 24 ore dopo.

Sciacquare il vetrino di copertura come prima delle quattro e macchiarlo con streptavidina 4 88. Coniugato a due microgrammi per millilitro in DPBS. Due ore dopo.

Sciacquare nuovamente il vetrino di copertina, quindi visualizzarlo al microscopio. Utilizzando questo protocollo di stampa a micro contatto robotico. Un array accuratamente modellato di PEG brush ANN UI con gruppi di alkin terminali è stato modellato all'interno di un array separato di pennello PEG ANN UI più grande con gruppi di azi terminali.

La distribuzione spaziale dei gruppi azide e alchinica è stata osservata utilizzando la chimica a scatto e il legame con la streptavidina delle sonde fluorescenti. Una sovrapposizione di entrambi i canali fluorescenti mostra come i timbri non si sovrappongano. La precisione dell'allineamento è stata calcolata sotto i 10 micron, che è ai limiti dello SCAR.

Un sistema utilizzato per eseguire la stampa. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare substrati di coltura tissutale personalizzati utilizzando la stampa robotica a micro contatto per sovrapporre più array di pennelli a piolo. Funzionalizzato con chimica ortogonale.