Name: Superficie-immobilizzazione funzionale dei geni usando Multistep Strand Displacement Litografia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Impara la litografia bephore per l'immobilizzazione di DNA di lunghezza genica su superfici, facilitando espressione genica cell-free su biochip. Questo metodo avanza la biologia sintetica.

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Noi riconosciamo con gratitudine il sostegno finanziario per questo progetto la Volkswagen Stiftung (grant No. 89 883) e il Consiglio europeo della ricerca (concessione contratto n. 694410 - AEDNA). M.S.-S. riconosce il sostegno dal DFG attraverso GRK 2062.

<ol><li>Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+and+assembly+on+a+biochip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip.</a> Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).</li>
<li>Jaehme, M., Michel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cell-free+protein+synthesis+for+the+crystallization+of+membrane+proteins+-+a+case+study+on+a+member+of+the+glutamate+transporter+family+from+Staphylothermus+marinus%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins - a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus.</a> The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).</li>
<li>Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dependence+of+cell-free+protein+synthesis+in+E.+coli+upon+naturally+occurring+or+synthetic+polyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+Of+The+National+Academy+Of+Sciences+Of+The+United+States+Of+America%22%5BJournal%5D)">The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).</li>
<li>Harris, D. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+biology%3A+exploiting+the+interface+between+synthetic+biology+and+synthetic+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).</li>
<li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthetic+biology%3A+Thinking+outside+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).</li>
<li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li>
<li>Estévez-Torres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-independent+and+reversible+photocontrol+of+transcription%2Fexpression+systems+using+a+photosensitive+nucleic+acid+binder%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).</li>
<li>Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+biochemistry+molecular+purge+valve+module+that+maintains+redox+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance.</a> Nature Communications. 5 (1), 4113(2014).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).</li>
<li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coarse-Grained+Dynamics+of+Protein+Synthesis+in+a+Cell-Free+System%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System.</a> Physical Review Letters. 106 (4), 048104(2011).</li>
<li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+replication%2C+synthesis%2C+and+assembly+of+the+bacteriophage+T7+in+a+single+cell-free+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).</li>
<li>Maeda, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+MreB+filaments+on+liposome+membranes%3A+a+synthetic+biology+approach%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).</li>
<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox%3A+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).</li>
<li>Niederholtmeyer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cell-free+forward+engineering+of+novel+genetic+ring+oscillators%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators.</a> eLife. 4, e09771(2015).</li>
<li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li>
<li>Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+by+pure+translation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis by pure translation systems.</a> Methods. 36 (3), 299-304 (2005).</li>
<li>Pohorille, A., Deamer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cells%3A+prospects+for+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Artificial cells: prospects for biotechnology.</a> Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).</li>
<li>Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+genetic+circuit+interactions+within+and+between+synthetic+minimal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells.</a> Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).</li>
<li>Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+crowding+shapes+gene+expression+in+synthetic+cellular+nanosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems.</a> Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).</li>
<li>van Nies, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-replication+of+DNA+by+its+encoded+proteins+in+liposome-based+synthetic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 1583(2018).</li>
<li>Buxboim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-step+photolithographic+interface+for+cell-free+gene+expression+and+active+biochips%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips.</a> Small. 3 (3), 500-510 (2007).</li>
<li>Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+properties+of+dense+DNA+phases+toward+artificial+biosystems+on+a+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+Of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface.</a> Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).</li>
<li>Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+and+nanowire+assemblies+of+condensed+DNA+polymer+brushes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).</li>
<li>Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+by+directional+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+Of+The+National+Academy+Of+Sciences+Of+The+United+States+Of+America%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization by directional gene expression.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).</li>
<li>Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+on-chip+DNA+compartments+as+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells.</a> Science. 345 (6198), 829-832 (2014).</li>
<li>Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nphys3469">Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells.</a> Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).</li>
<li>Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+on+DNA+Biochips+Patterned+with+Strand-Displacement+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie-International+Edition+In+English%22%5BJournal%5D)">Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).</li>
<li>Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+and+Erasable+DNA+Photolithography%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Multicolor and Erasable DNA Photolithography.</a> ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).</li>
<li>Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Polymer+Brush+Patterning+through+Photocontrollable+Surface-Initiated+DNA+Hybridization+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction.</a> Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).</li>
<li>McDonald, J. C., et al. <a target="_blank" href=" Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane)">Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).</a> Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun interessi concorrenti.

Litografia di Bephore è una tecnica robusta e versatile per l'immobilizzazione con motivi di DNA o RNA. Ancora, la procedura prevede diversi passaggi, che - se cambiato - possono essere una fonte per guasto o riduzione delle prestazioni del sistema.
Un passo cruciale nella fabbricazione di circuiti integrati Bephore è la PEGilazione del substrato, che fornisce la biocompatibilità della superficie. Qui, la fase di pulizia con una procedura RCA è importante, poiché attiva anche la superficie per...

Cella-libera espressione genica reazioni sono di grande interesse per varie applicazioni in biochimica, delle biotecnologie e biologia sintetica. Senza cellula di espressione delle proteine è stato determinante per la preparazione di campioni di proteine pure, che erano alla base di numerosi studi in biologia strutturale. Per esempio, sistemi senza cellula sono stati utilizzati con successo per l'espressione della proteina complessi1 o membrana proteine2, che sono difficili da produrre utilizzando espressione basati su cellule. In particolare, senza cellula reazioni erano usate anche per delucidare la struttura del codice genetico, a partire con gli esperimenti innovativi di Nirenberg e Matthaei nel 19613l'espressione genica.
Recentemente, c'è stato un rinnovato interesse nei metodi senza cellula in biotecnologie e biologia sintetica4,5,6. Sistemi senza cellula possono essere ampliate con composti non-biologico, e componenti di origine biologica, diversa possono essere combinati più facilmente7. Anche se sistemi senza cellula hanno lo svantaggio evidente che essi non "crescono e si dividono", è concepibile per preparare aperte senza cellula bioreattori con funzioni metaboliche di base e lasciarli a sintetizzare metaboliti quando dotati di energia e di carbonio semplice ingressi8. All'interno del campo emergente della biologia sintetica, sistemi senza cellula promettono di essere un "telaio" più prevedibile per l'attuazione delle funzioni biologiche sintetici.
Attualmente, le reazioni di espressione genica senza cellula sono effettuate utilizzando estratti cellulari (da diverse fonti quali batteri, lieviti, insetti), o sistemi di trascrizione/traduzione che sono stati ottimizzati per diverse applicazioni (ad es., procariotiche vs eucariotiche espressione genica, produzione di proteine di membrana, ecc.). Un popolare protocollo per la preparazione dell'estratto di cellula batterica (comunemente chiamato TXTL) è stato fornito recentemente da V. Noireaux e colleghe9. Sue proprietà biofisiche sono stati accuratamente caratterizzata10, e il sistema TXTL è stato già utilizzato con successo per eseguire una serie di complesse attività biochimiche: ad esempio, l'Assemblea dei batteriofagi funzionale tramite senza cellula espressione del genoma dei fagi11, la sintesi di proteina batterica filamenti12o l'attuazione del gene senza cellula circuiti13,14.
Un altro sistema popolare in biologia senza cellula sintetica è il sistema puro, che viene ricostituito da componenti purificate15,16. Rispetto al sistema TXTL, non contiene nucleasi o macchine di degradazione della proteina. Durante la degradazione di DNA lineare, molecole del RNA o proteine è meno di un problema nel sistema puro, vie di decadimento sono in realtà importante per l'implementazione di funzioni dinamiche. Al fine di ridurre l'effetto di degradazione di exonuclease di modelli lineari genica nel sistema TXTL (attraverso RecBCD), la proteina di GamS fine-protezione dovrà essere aggiunto. Sia il TXTL e il sistema puro sono disponibili in commercio.
Un argomento strettamente legato alle preoccupazioni senza cellula biologia lo studio dell'effetto di compartimentalizzazione su reazioni biochimiche e ulteriormente la creazione di strutture alveolari artificiali o protocellule17,18,19 ,20. Ricerca sulle cellule artificiali in genere implica l'incapsulamento di un sistema di reazione biochimica all'interno di compartimenti vescicolari effettuata in fosfolipidi o altri anfifili. Mentre tali sistemi aiutano a esplorare gli aspetti fondamentali della compartimentalizzazione, o la comparsa di cellularità e strutture auto-replicanti, si trovano ad affrontare le problematiche tipiche di sistemi chiusi: in assenza di un metabolismo funziona e appropriato meccanismi di trasporto di membrana, è difficile mantenere reazioni compartimenti in esecuzione per lunghi periodi di tempo - molecole di carburante vengono utilizzati e prodotti di scarto si accumulano.
Un'interessante alternativa alla compartimentazione all'interno di tali compartimenti che imita cella è l'organizzazione spaziale di materiale genetico mediante metodi fotolitografiche. Immobilizzazione dei "geni su un chip" è stato lanciato dal gruppo Bar-Ziv presso l'Istituto di Weizmann più di dieci anni fa21. Tra le principali questioni che dovevano essere risolti erano l'adsorbimento non specifico del DNA e la potenziale denaturazione delle proteine sulla superficie del chip. Bar-Ziv et al ha sviluppato un resist fotolitografia dedicato chiamato "Daisy", che era composta di un silano terminale reattivo per l'immobilizzazione delle molecole resistere sulle superfici di biossido di silicio, un distanziatore lungo polietilenglicole (PEG) che ha assicurato biocompatibilità e capigruppo un photocleavable, che è stato convertito in un'ammina reattiva all'irradiazione con luce ultravioletta (UV). È stato dimostrato che Daisy può essere utilizzato per immobilizzare molecole di DNA del gene-lunghezza (con lunghezze diverse kilo-di coppie di basi (kbp)) su una superficie del chip. Da un punto di vista della fisica di polimeri, i sistemi rappresentati spazzole polimero innestati su un substrato solido. A causa della natura di polielettrolita del DNA, la conformazione di queste spazzole è fortemente influenzata dalla osmotico e altri effetti di ioni specifici22,23.
La cosa più importante, ha dimostrato che geni immobilizzati substrato sono ancora funzionali e possono essere trascritto e tradotto in RNA e proteina. Gene pennelli sono accessibili per la polimerasi del RNA dalla soluzione24, e il complesso composto macromolecolare della trascrizione/traduzione non è denaturato alla superficie. Uno dei vantaggi di immobilizzazione dei componenti genetiche su un substrato è che essi possano funzionare in un sistema di reattore aperto microfluidici che continuamente viene fornito con molecole precursori piccolo e da quali prodotti di scarto può essere rimosso25 , 26.
Recentemente abbiamo sviluppato una variante di questo metodo chiamato Bephore (per fascio di elettroni biocompatibile e photoresist)27, che era basato esclusivamente su componenti disponibili in commercio e utilizzati reazioni di invasione di strand DNA sequenza-specifiche per la realizzazione di una procedura di Litografia multistep semplice da implementare per la creazione di cellule artificiali basati su chip. Una descrizione schematica della procedura è illustrata nella Figura 1. È basato su molecole di DNA tornante contenente un gruppo di photocleavable, che sono immobilizzati su un livello di PEG biocompatibile. Photocleavage dei tornanti espone una sequenza di filamento singolo punto d'appoggio, attraverso il quale DNA molecole di interesse (contenente la sequenza DIS "spostando") possono essere collegato via invasione strand toehold-mediata.
Mentre Bephore è potenzialmente più semplice da implementare, Daisy permette la realizzazione di molto denso e pulito "spazzole del gene", che presenta vantaggi in determinate applicazioni. In linea di principio, tuttavia, Litografia Daisy e Bephore potrebbe essere facilmente combinato. Un metodo di Litografia correlata utilizzando spazzole di DNA strand displacement per strutturazione del DNA su oro precedentemente è stato sviluppato da Huang et al., ma non è stata utilizzata nel contesto dell'espressione genica senza cellula28,29.
Il seguente protocollo forniamo che una descrizione dettagliata della produzione di DNA pennelli per l'espressione genica senza cellula utilizzando il metodo Bephore. Descriviamo come il chip del gene sono fabbricati e dimostrare l'uso di multi-step foto-litografia per l'immobilizzazione spazialmente strutturato dei geni su un chip. Inoltre discutiamo la realizzazione di camere di reazione e l'applicazione della microfluidica per lo svolgimento delle reazioni di espressione genica su chip.

<table><tbody><tr><td>Wafer di silicio con biossido di silicio da 50 nm (substrato di Bephore)</td><td>Spessore del wafer</td><td></td> di Siegert <td>(&micro; m): 525 &plusmn; 25, Diametro (mm): 100</td></tr><tr><td>Wafer di silicio (per stampo master PDMS)</td><td>Siegert Wafer</td><td></td><td>Spessore (&micro; m): 525 &plusmn; 25, Diametro (mm): 76,2 (3")</td></tr><tr><td>Vetrini n. 4</td><td>Menzel</td><td></td><td>22 mm x 50 mm</td></tr><tr><td>Vetrini vetrini n. 1,5</td><td>Assistent</td><td></td><td>24 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>Biotin-PEG-Silane</td><td>Laysan Bio</td><td></td><td>MW 5.000</td></tr><tr><td>Toluene anidro</td><td>Sigma Aldrich (Merck)</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>S888</td><td></td></tr><tr><td>DNA</td><td>Integrated DNA Technologies ( IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix con tampone HF New</td><td>England Biolabs</td><td>M0531S</td><td>Kit</td></tr><tr><td>PCR Wizard SV Gel e PCR Clean-Up System&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>Kit di pulizia PCR a colonna rotante</td></tr><tr><td>PURExpress</td><td>New England Biolabs</td><td>E6800S</td><td>Sistema di espressione senza cellule</td></tr><tr><td>PDMS&nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>Slygard 184</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>F8771</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in PTFE (ID: 0,8 mm, OD: 1,6 mm)</td><td>Tecnologia Bola</td><td>S 1810-10</td><td></td></tr><tr><td>EpoCore 20</td><td>micro resist&nbsp; GmbH</td><td></td><td>Photoresist</td></tr><tr><td>mr-Dev 600</td><td>micro resist technology&nbsp; GmbH</td><td></td><td>Sviluppatore di fotoresist</td></tr><tr><td>Ti-Prime</td><td>MicroChemicals</td><td></td><td>Promotore di adesione</td></tr><tr><td>Colla siliconica bicomponente</td><td>Picodent</td><td>Twinsil&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lamina gialla con protezione UV</td><td>Lithoprotect (via MicroChemicals)</td><td>Y520E212</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maschere per fotolitografia</td><td>Zitzmann GmbH</td><td></td><td>64.000 dpi, 180x240 mm</td></tr><tr><td>Microscopio dritto</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td>Fotolitografia e imaging a fluorescenza</td></tr><tr><td>60x obiettivo ad immersione in acqua</td><td>Olympus</td><td>LumPlanFl</td><td>Utilizzato con Olympus BX51, NA 0.9</td></tr><tr><td>20x Obiettivo ad immersione in acqua</td><td>Olympus</td><td>LumPlanFl</td><td>Utilizzato con Olympus BX51, NA 0.5</td></tr><tr><td>Fotometria</td><td>della fotocamera</td><td>Coolsnap HQ</td><td>Utilizzato con Olympus BX51</td></tr><tr><td>Fonte di illuminazione</td><td>EXFO</td><td>X-Cite 120Q</td><td>Utilizzato con Olympus BX51</td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Nikon</td><td>Ti2-E</td><td>Fluorescenza imaging dell'espressione genica</td></tr><tr><td>obiettivo 4x</td><td>Nikon</td><td>CFI P-Apo 4x Lambda</td><td>Utilizzato con la fotocamera Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td></td><td>Andor</td><td>Neo5.5</td><td>Utilizzato con Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td>Sorgente luminosa</td><td>Lumencor</td><td>SOLA SM II</td><td>Utilizzato con Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td>Incubatrice a gabbia</td><td>Okolab</td><td>bold line</td><td>Utilizzata con il regolatore di pressione Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td></td><td>Elveflow</td><td>OB1 MK3</td><td></td></tr><tr><td>Nanofotometro</td><td>Implen</td><td></td><td>Misurazione della concentrazione di DNA</td></tr><tr><td>Pulitore al plasma</td><td>Diener</td><td>Femto</td><td>200 W, operato a 0,8 mbar con il campione in una gabbia di Faraday</td></tr></tbody></table>

superficie-immobilizzazione funzionale dei geni usando multistep strand displacement litografia

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Immobilizzazione dei geni su superfici litograficamente strutturate permette lo studio del gene compartimenti processi di espressione in un sistema di bioreattore microfluidico aperta. A differenza di altri approcci verso sistemi cellulari artificiali, tale configurazione consente un approvvigionamento continuo con reagenti di espressione genica e simultanea di scarico dei prodotti di scarto. Questo facilita l'implementazione di processi di espressione genica senza cellula per lunghi periodi di tempo, che è importante per la realizzazione di sistemi di regolamentazione feedback dinamico gene. Qui forniamo un protocollo dettagliato per la realizzazione di biochip genetica usando una tecnica litografica di simple-to-use basata su reazioni di spostamento del filo del DNA, che utilizza esclusivamente i componenti disponibili in commercio. Forniamo anche un protocollo sull'integrazione dei compartimenti geni con un polidimetilsilossano (PDMS)-basato su sistema microfluidico. Inoltre, indichiamo che il sistema è compatibile con microscopia di fluorescenza (TIRF) riflessione interna totale, che può essere utilizzata per l'osservazione diretta delle interazioni molecolari tra DNA e molecole contenute nel mix di espressione.

Litografia in due fasi: la figura 5 Mostra il risultato di un processo litografico in due fasi su un vetrino con sovrapposizione pattern dei filamenti fluorescente contrassegnati DIS.
Espressione di una proteina fluorescente da un pennello di gene: Figura 6 dimostra l'espressione della proteina fluorescente YPet dal DNA immobilizzato. In diversi punti del tempo che abbi...

Descriviamo una semplice procedura litografica per l'immobilizzazione di molecole di DNA del gene-lunghezza su una superficie, che può essere utilizzata per eseguire gli esperimenti di espressione del gene senza cellula il biochip.

Superficie-immobilizzazione funzionale dei geni usando Multistep Strand Displacement Litografia

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

I biochip di DNA sono un'interessante piattaforma di ricerca per la biologia auto-sintetica, originariamente sviluppata dal gruppo BASF, che consente il funzionamento di circuiti genetici in vitro per lunghi periodi di tempo. Con questo protocollo, speriamo di rendere questa tecnologia disponibile per una gamma più ampia di ricercatori. Il nostro metodo, ico litografia del beforo, rappresenta una strategia per l'immobilizzazione del DNA basata sulla reazione di spostamento del filamento di DNA.La forza di questa tecnica risiede nelle sue capacità litografiche in più passaggi, nella sua semplice riproducibilità e nella disponibilità commerciale di tutti i componenti. Simile ad altre soluzioni di biochip, il bephore può essere combinato con diverse tecnologie. Ad esempio, le spazzole geniche funzionali possono essere assemblate all'interno di microcomparti per l'espressione proteica.Per iniziare, preparare una miscela RCA mescolando cinque parti d'acqua con una parte di una soluzione di ammoniaca al 30% in un bicchiere di vetro. Scaldare la miscela a 70 gradi Celsius su una piastra calda durante l'agitazione. Una volta raggiunto i 70 gradi Celsius, aggiungere una parte del 30% di perossido di idrogeno.Quindi posizionare un wafer di silicio di 100 millimetri di diametro nella soluzione, per rimuovere materiale organico e particelle da esso. Dopo 30 minuti, estraere il substrato, sciacquarlo accuratamente con acqua da una bottiglia di lavaggio e asciugarlo con una pistola azotati. Procedere immediatamente con la PEGylation del substrato.Per raggiungere questo obiettivo, prima diluire biotina-PEG-Silane in toluene secco a 5 milligrammi per millilitro e vortice la soluzione fino a quando non è ben miscelata. Con il substrato posto in una piastra di Petri in vetro, pipettare lentamente la soluzione sul substrato, coprendo l'intera superficie, ma evitare di consentire alla soluzione di fluire sul bordo. Una volta coperta la superficie, chiudere la piastra di Petri e quindi aggiungere un coperchio aggiuntivo.Dopo 30 minuti, rimuovere il coperchio e aggiungere circa 40 millilitri di alcol isopropile alla piastra di Petri. Quindi estraere il substrato, sciacquarlo di nuovo accuratamente con alcol isopropile e asciugarlo con un cannone azotati. Quando è asciutto, conservare il substrato al buio fino a quando non è necessario.Preparare un substrato utilizzando una taglierina di vetro o un bisturi per formare pezzi di un centimetro per un centimetro. Quindi, aggiungere un semplice segno di allineamento facendo un breve graffio dal centro verso un bordo del substrato. Soffiare piccole particelle dal chip usando una pistola azotati.Quindi, mescolare due goccioline di una colla siliconica bicomponente e applicare la colla sulla superficie del chip, lasciando vuota l'area intorno alla punta del graffio. Lì la colla fornisce una barriera idrofobica, mantenendo soluzioni acquose sul chip. Ciò facilita le successive fasi di lavaggio e riduce la quantità di DNA necessaria per le incubazioni.In un passaggio successivo, la colla può essere facilmente staccata. Nei seguenti passaggi, il DNA fotocleabile viene gestito solo in un ambiente a luce gialla. Coprire il chip con circa 10 microlitri di una miscela di semafori a temperatura ambiente e posizionare il truciolo in una scatola parzialmente riempita d'acqua per ridurre l'evaporazione.Dopo un'ora, lavare il chip più volte con PBS per rimuovere qualsiasi mix di bephore non legato. Quindi, aggiungere 10 microlitri del mix di passivazione al chip. Dopo due ore, lavare il chip più volte con PBS per rimuovere gli agenti passivazione non vincolati.Tagliare una maschera fotografica stampata alla dimensione appropriata per adattarsi a un supporto per maschere adatto. Inserirlo nella posizione dell'arresto del campo e utilizzare i segni di allineamento per allineare la maschera nel supporto. Con il substrato posizionato sullo stadio di microscopia, inserire un filtro rosso nel percorso di illuminazione e mettere a fuoco sulla superficie del substrato.Quindi, naviga verso la regione del substrato che verrà esposta. Quindi, inserire il supporto della maschera, bloccare l'illuminazione e passare al filtro UV. A bassa intensità luminosa, aprire l'otturatore e utilizzare la fotocamera per mettere rapidamente a fuoco la maschera sul substrato.Con il substrato ora allineato e la maschera a fuoco, bloccare il percorso della luce verso la fotocamera e illuminare il substrato ad alta intensità luminosa per il tempo di esposizione desiderato. Dopo l'esposizione, rimuovere il campione dal microscopio e rimuovere con cura il più buffer possibile dal substrato senza asciugarlo. Quindi, aggiungere da 10 a 20 microlitri di DNA con la sequenza per l'attaccamento alla superficie.Posizionare il substrato in una scatola bagnata per evitare che si asciughi e incubare il DNA sul substrato per due ore a temperatura ambiente. Per osservare l'espressione genica compartimentata su un microscopio invertito, preparare prima separatamente le due parti del portacampioni. Inizia incollando un chip bephore con una spazzola genica immobilizzata sul supporto del truciolo, utilizzando nastro adesivo a doppia parte.Quindi, aggiungere del grasso sottovuoto attorno al foro centrale della parte inferiore del supporto e inserire il supporto del truciolo. Ora assembla la parte superiore del supporto. Tagliare un sottile chip PDMS con compartimenti il più piccoli possibile, lasciando un canale aperto su un lato per consentire in seguito lo scambio di rifiuti e molecole precursori per diffusione Next, trattato al plasma una copertura di vetro scivolare sul retro del chip PDMS con plasma di ossigeno.Subito dopo il trattamento, posizionare il chip PDMS al centro dello scivolo di vetro, con i vani rivolti verso l'alto. Quindi, cuocere il bicchiere con il PDMS per un'ora a 70 gradi Celsius. Poco prima di assemblare l'intero portacampioni, trattare al plasma lo scivolo di vetro con il chip PDMS come prima.Quindi, aggiungere del grasso sottovuoto attorno al grande foro del supporto superiore e posizionare lo scivolo di vetro con il PDMS su di esso. Premere delicatamente il vetro sul grasso. Rimuovere con cura il tampone dal chip e lavarlo una volta con 10 microlitri di sistema di auto-espressione.Successivamente, aggiungere 60 microlitri di sistema di auto-espressione sul chip e rimuovere la colla siliconica bicomponente dai bordi. Ora, aggiungere 20 microlitri del sistema di espressione al PDMS. Dopo aver posizionato la goccia sul PDMS, controllare rapidamente nel microscopio stereoscopico che i compartimenti siano ben bagnati e senza bolle d'aria.Se ci sono bolle d'aria, prova a lavarle via. Per assemblare i due pezzi del supporto e allineare camere e spazzole di DNA, lavorare al microscopio stereoscopico. Immobilizzare il supporto inferiore con un braccio della pinza in modo che le due viti e le ali siano facilmente accessibili con entrambe le mani.Inserire il supporto superiore nel supporto inferiore e abbassarlo fino a quando le goccioline del sistema di espressione senza celle si fondono. Quindi, verificare che i compartimenti e il segno di allineamento si trovano in una regione simile nel piano XY. Dal basso, avvitare le ali fino a quando non toccano il lato inferiore del supporto.Mentre si allineano i compartimenti e il chip nel piano XY, stringere delicatamente le ali. Questo passaggio richiede una certa esperienza e dipende dalla costruzione del portacampioni. Il PDMS deve essere premuto sul chip solo con forza delicata.Successivamente, spruzzare una spugna nell'involucro anti-evaporazione con acqua e inserire il supporto nella scatola. Quindi, riempire una siringa da cinque millilitri con colla siliconica bicomponente e utilizzarla per sigillare la scatola. Infine, trasferire la scatola su un microscopio a temperatura controllata e immagini il pennello del DNA e la reazione usando la microscopia a fluorescenza.Un processo litografico in due fasi, qui eseguito su uno scivolo di vetro al beforo, produce modelli sovrapposti di filamenti di DNA etichettati fluorescentmente. In questa dimostrazione dell'espressione genica su chip, il DNA viene immobilizzato nella camera a sinistra. Quando esposto al mix di espressione, la proteina fluorescente gialla YPet viene sintetizzata dal DNA immobilizzato.Per valutare l'attività del sistema di espressione genica, il recupero della fluorescenza si osserva dopo una fase di sbiancamento. A due ore, l'intensità della fluorescenza si riprese rapidamente. Tuttavia, dopo quattro e sei ore, non si è ripreso, indicando che senza una nuova fornitura del mix di espressioni, la reazione è terminata intorno alle quattro ore.Sebbene l'espressione genica sia limitata in un sistema chiuso, può essere sostenuta per periodi di tempo più lunghi fornendo ai compartimenti di espressione molecole precursori aggiuntive tramite microli fluidica. Il metodo del bephore è usato per immobilizzare oligonucleotidi o DNA di lunghezza genica, che può essere applicato per costruire sistemi di spazzole di DNA interagenti per l'espressione auto-genica. La tecnica può anche essere utilizzata per altre applicazioni in biofisica, come studi di fluorescenza a singola molecola.Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di fabbricare biochip di bephore da wafer o diapositive di vetro e integrarli nei tuoi progetti di ricerca.

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