Superficie-immobilizzazione funzionale dei geni usando Multistep Strand Displacement Litografia

I biochip di DNA sono un'interessante piattaforma di ricerca per la biologia auto-sintetica, originariamente sviluppata dal gruppo BASF, che consente il funzionamento di circuiti genetici in vitro per lunghi periodi di tempo. Con questo protocollo, speriamo di rendere questa tecnologia disponibile per una gamma più ampia di ricercatori. Il nostro metodo, ico litografia del beforo, rappresenta una strategia per l'immobilizzazione del DNA basata sulla reazione di spostamento del filamento di DNA.

La forza di questa tecnica risiede nelle sue capacità litografiche in più passaggi, nella sua semplice riproducibilità e nella disponibilità commerciale di tutti i componenti. Simile ad altre soluzioni di biochip, il bephore può essere combinato con diverse tecnologie. Ad esempio, le spazzole geniche funzionali possono essere assemblate all'interno di microcomparti per l'espressione proteica.

Per iniziare, preparare una miscela RCA mescolando cinque parti d'acqua con una parte di una soluzione di ammoniaca al 30% in un bicchiere di vetro. Scaldare la miscela a 70 gradi Celsius su una piastra calda durante l'agitazione. Una volta raggiunto i 70 gradi Celsius, aggiungere una parte del 30% di perossido di idrogeno.

Quindi posizionare un wafer di silicio di 100 millimetri di diametro nella soluzione, per rimuovere materiale organico e particelle da esso. Dopo 30 minuti, estraere il substrato, sciacquarlo accuratamente con acqua da una bottiglia di lavaggio e asciugarlo con una pistola azotati. Procedere immediatamente con la PEGylation del substrato.

Per raggiungere questo obiettivo, prima diluire biotina-PEG-Silane in toluene secco a 5 milligrammi per millilitro e vortice la soluzione fino a quando non è ben miscelata. Con il substrato posto in una piastra di Petri in vetro, pipettare lentamente la soluzione sul substrato, coprendo l'intera superficie, ma evitare di consentire alla soluzione di fluire sul bordo. Una volta coperta la superficie, chiudere la piastra di Petri e quindi aggiungere un coperchio aggiuntivo.

Dopo 30 minuti, rimuovere il coperchio e aggiungere circa 40 millilitri di alcol isopropile alla piastra di Petri. Quindi estraere il substrato, sciacquarlo di nuovo accuratamente con alcol isopropile e asciugarlo con un cannone azotati. Quando è asciutto, conservare il substrato al buio fino a quando non è necessario.

Preparare un substrato utilizzando una taglierina di vetro o un bisturi per formare pezzi di un centimetro per un centimetro. Quindi, aggiungere un semplice segno di allineamento facendo un breve graffio dal centro verso un bordo del substrato. Soffiare piccole particelle dal chip usando una pistola azotati.

Quindi, mescolare due goccioline di una colla siliconica bicomponente e applicare la colla sulla superficie del chip, lasciando vuota l'area intorno alla punta del graffio. Lì la colla fornisce una barriera idrofobica, mantenendo soluzioni acquose sul chip. Ciò facilita le successive fasi di lavaggio e riduce la quantità di DNA necessaria per le incubazioni.

In un passaggio successivo, la colla può essere facilmente staccata. Nei seguenti passaggi, il DNA fotocleabile viene gestito solo in un ambiente a luce gialla. Coprire il chip con circa 10 microlitri di una miscela di semafori a temperatura ambiente e posizionare il truciolo in una scatola parzialmente riempita d'acqua per ridurre l'evaporazione.

Dopo un'ora, lavare il chip più volte con PBS per rimuovere qualsiasi mix di bephore non legato. Quindi, aggiungere 10 microlitri del mix di passivazione al chip. Dopo due ore, lavare il chip più volte con PBS per rimuovere gli agenti passivazione non vincolati.

Tagliare una maschera fotografica stampata alla dimensione appropriata per adattarsi a un supporto per maschere adatto. Inserirlo nella posizione dell'arresto del campo e utilizzare i segni di allineamento per allineare la maschera nel supporto. Con il substrato posizionato sullo stadio di microscopia, inserire un filtro rosso nel percorso di illuminazione e mettere a fuoco sulla superficie del substrato.

Quindi, naviga verso la regione del substrato che verrà esposta. Quindi, inserire il supporto della maschera, bloccare l'illuminazione e passare al filtro UV. A bassa intensità luminosa, aprire l'otturatore e utilizzare la fotocamera per mettere rapidamente a fuoco la maschera sul substrato.

Con il substrato ora allineato e la maschera a fuoco, bloccare il percorso della luce verso la fotocamera e illuminare il substrato ad alta intensità luminosa per il tempo di esposizione desiderato. Dopo l'esposizione, rimuovere il campione dal microscopio e rimuovere con cura il più buffer possibile dal substrato senza asciugarlo. Quindi, aggiungere da 10 a 20 microlitri di DNA con la sequenza per l'attaccamento alla superficie.

Posizionare il substrato in una scatola bagnata per evitare che si asciughi e incubare il DNA sul substrato per due ore a temperatura ambiente. Per osservare l'espressione genica compartimentata su un microscopio invertito, preparare prima separatamente le due parti del portacampioni. Inizia incollando un chip bephore con una spazzola genica immobilizzata sul supporto del truciolo, utilizzando nastro adesivo a doppia parte.

Quindi, aggiungere del grasso sottovuoto attorno al foro centrale della parte inferiore del supporto e inserire il supporto del truciolo. Ora assembla la parte superiore del supporto. Tagliare un sottile chip PDMS con compartimenti il più piccoli possibile, lasciando un canale aperto su un lato per consentire in seguito lo scambio di rifiuti e molecole precursori per diffusione Next, trattato al plasma una copertura di vetro scivolare sul retro del chip PDMS con plasma di ossigeno.

Subito dopo il trattamento, posizionare il chip PDMS al centro dello scivolo di vetro, con i vani rivolti verso l'alto. Quindi, cuocere il bicchiere con il PDMS per un'ora a 70 gradi Celsius. Poco prima di assemblare l'intero portacampioni, trattare al plasma lo scivolo di vetro con il chip PDMS come prima.

Quindi, aggiungere del grasso sottovuoto attorno al grande foro del supporto superiore e posizionare lo scivolo di vetro con il PDMS su di esso. Premere delicatamente il vetro sul grasso. Rimuovere con cura il tampone dal chip e lavarlo una volta con 10 microlitri di sistema di auto-espressione.

Successivamente, aggiungere 60 microlitri di sistema di auto-espressione sul chip e rimuovere la colla siliconica bicomponente dai bordi. Ora, aggiungere 20 microlitri del sistema di espressione al PDMS. Dopo aver posizionato la goccia sul PDMS, controllare rapidamente nel microscopio stereoscopico che i compartimenti siano ben bagnati e senza bolle d'aria.

Se ci sono bolle d'aria, prova a lavarle via. Per assemblare i due pezzi del supporto e allineare camere e spazzole di DNA, lavorare al microscopio stereoscopico. Immobilizzare il supporto inferiore con un braccio della pinza in modo che le due viti e le ali siano facilmente accessibili con entrambe le mani.

Inserire il supporto superiore nel supporto inferiore e abbassarlo fino a quando le goccioline del sistema di espressione senza celle si fondono. Quindi, verificare che i compartimenti e il segno di allineamento si trovano in una regione simile nel piano XY. Dal basso, avvitare le ali fino a quando non toccano il lato inferiore del supporto.

Mentre si allineano i compartimenti e il chip nel piano XY, stringere delicatamente le ali. Questo passaggio richiede una certa esperienza e dipende dalla costruzione del portacampioni. Il PDMS deve essere premuto sul chip solo con forza delicata.

Successivamente, spruzzare una spugna nell'involucro anti-evaporazione con acqua e inserire il supporto nella scatola. Quindi, riempire una siringa da cinque millilitri con colla siliconica bicomponente e utilizzarla per sigillare la scatola. Infine, trasferire la scatola su un microscopio a temperatura controllata e immagini il pennello del DNA e la reazione usando la microscopia a fluorescenza.

Un processo litografico in due fasi, qui eseguito su uno scivolo di vetro al beforo, produce modelli sovrapposti di filamenti di DNA etichettati fluorescentmente. In questa dimostrazione dell'espressione genica su chip, il DNA viene immobilizzato nella camera a sinistra. Quando esposto al mix di espressione, la proteina fluorescente gialla YPet viene sintetizzata dal DNA immobilizzato.

Per valutare l'attività del sistema di espressione genica, il recupero della fluorescenza si osserva dopo una fase di sbiancamento. A due ore, l'intensità della fluorescenza si riprese rapidamente. Tuttavia, dopo quattro e sei ore, non si è ripreso, indicando che senza una nuova fornitura del mix di espressioni, la reazione è terminata intorno alle quattro ore.

Sebbene l'espressione genica sia limitata in un sistema chiuso, può essere sostenuta per periodi di tempo più lunghi fornendo ai compartimenti di espressione molecole precursori aggiuntive tramite microli fluidica. Il metodo del bephore è usato per immobilizzare oligonucleotidi o DNA di lunghezza genica, che può essere applicato per costruire sistemi di spazzole di DNA interagenti per l'espressione auto-genica. La tecnica può anche essere utilizzata per altre applicazioni in biofisica, come studi di fluorescenza a singola molecola.

Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di fabbricare biochip di bephore da wafer o diapositive di vetro e integrarli nei tuoi progetti di ricerca.