High-throughput sintesi dei carboidrati e funzionalizzazione di nanoparticelle polianidride

In questo articolo video, descriviamo un nuovo protocollo idro put per la sintesi automatizzata in fase soluzione di oligosaccaridi e per la funzionalizzazione di nanoparticelle polianidride. Con questi agenti di targeting a base di carboidrati, innanzitutto vengono sintetizzate molecole di carboidrati mediante un sistema automatizzato che utilizza la sintesi in fase soluzione invece di sintetizzatori in fase solida. Successivamente, gli intermedi oligosaccaridici vengono purificati mediante florosil, estrazione in fase solida o FSPE.

Le molecole di carboidrati prodotte vengono caratterizzate mediante NMR e successivamente legate alle nanoparticelle di polianidride mediante coniugazione carbo IDE. Infine, le nanoparticelle funzionalizzate con carboidrati vengono caratterizzate mediante spettroscopia fotoelettronica a raggi X e un saggio di acido fenilsolforico idro putt. In definitiva, utilizzando la metodologia idro put qui descritta, sono state ottenute le condizioni di reazione per ottimizzare la morfologia delle nanoparticelle e la densità di carboidrati sulla superficie delle particelle.

Il principale vantaggio di questo metodo rispetto ai metodi esistenti, come la sintesi oligosaccaridica su fase solida, è che in questo approccio si utilizza una quantità notevolmente inferiore di unità costitutive. In questo metodo, tipicamente si impiegano da due a tre equivalenti invece di 10-20 equivalenti. Abbiamo concepito per la prima volta questa metodica quando abbiamo dimostrato l'efficacia degli effetti superficiali, mediante funzionalizzazione di nanoparticelle polimeriche idrofile con carboidrati per indirizzarle verso recettori CEEP su cellule anti-dentistiche. Successivamente, abbiamo voluto progettare un sistema ad alto rendimento che ci permettesse di analizzare i molteplici parametri coinvolti nella fabbricazione e nell'applicazione di questi nuovi vettori.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché lo sviluppo di piattaforme automatizzate per la sintesi ad alto rendimento di oligosaccaridi e il loro fissaggio su particelle polimeriche rappresenta un'area di ricerca innovativa, per la quale attualmente esiste una documentazione limitata, prima della sintesi automatizzata dell'acido dianoico. Un donatore di zucchero adeguatamente protetto, tipicamente tri cloro acetamide, e un accettore principalmente in Alcon, alcol fluoro, vengono sintetizzati in banco e preparati in cloro metano; preparare inoltre trimetil silo, trifluoro metansolfonato in cloro metano, metanolo al 80% e metanolo al 100%. Assicurarsi che l'umidità relativa nell'ambiente sia pari o inferiore al 30% all'interno della camera di automazione.

L'elevata umidità è dannosa per le reazioni di glicosilazione. I seguenti passaggi vengono eseguiti utilizzando una piattaforma automatizzata. La prima glicosilazione viene effettuata con il donatore e l'alcol florile.

Una volta terminato, la molecola di zucchero con il marcatore florist viene purificata mediante FSPE. Il gruppo protettivo temporaneo viene quindi rimosso con sodio, metossido e metanolo, e nuovamente il prodotto viene purificato mediante FSPE. Successivamente, lo zucchero con il marcatore florist viene utilizzato come accettore e accoppiato allo stesso donatore per ottenere il disaccaride, che viene purificato mediante FSPE per iniziare.

Posizionare i reagenti, inclusi il promotore donatore-accettore, metanolo al 80% in acqua, metanolo al 100% e metossido di sodio, sulla piattaforma robotica e avviare il programma. Il braccio robotico preleverà il donatore e successivamente l'accettore dalle provette e li trasferirà in una provetta di reazione. Quindi, la miscela di donatore e accettore viene agitata per 30 minuti.

Trascorsi 30 minuti, il braccio robotico trasferisce il catalizzatore trimetil silile trifluorometansolfonato nella miscela. La soluzione viene quindi mescolata per ulteriori 30 minuti. Al termine dell'agitazione, il programma va in pausa.

Prelevare un'aliquote di 10 microlitri per verificare, mediante cromatografia su strato sottile, se la reazione è completa. Se la reazione è completa, la molecola accettrice non sarà visibile. Se la reazione non è completa, l'accettrice sulla TLC sarà ancora visibile.

Se questo è il caso, arrestare il programma, reimpostare il tempo di glicosilazione a circa 30 minuti e aggiungere un eccesso di trimetil silo promotore, trifluorometansolfonato. Al termine della reazione, procedere con il passaggio successivo. Una volta completata la reazione, il robot trasferisce la miscela di reazione su cartucce FSPE contenenti gel di silice modificato con C nine F 17 per la purificazione.

Successivamente, le cartucce vengono lavate con otto millilitri di metanolo al 80%, seguiti da otto millilitri di metanolo al 100%. Per eliminare la frazione non floris, il flusso in uscita viene raccolto in un vial per ottenere il prodotto desiderato marcato come florist. Se è richiesta un'ulteriore purificazione, interrompere il robot e rimuovere i prodotti di reazione appropriati.

A seconda della struttura, i donatori possono essere estremamente poco reattivi e alcune molecole accettrici di floristi rimarranno anche dopo l'aggiunta di un promotore sufficiente. In tal caso, la FSPE non sarà abbastanza efficiente per la purificazione e potrà essere eseguita un'ulteriore purificazione mediante cromatografia su colonna a gel di silice dopo che il braccio robotico ha dispensato metossido di sodio nel vial di reazione. La reazione viene quindi agitata per due ore sulla piattaforma robotica; se non è completa, come determinato mediante TLC, estendere il periodo di incubazione di circa un'ora.

Al termine della reazione, il prodotto viene purificato mediante FSPE come in precedenza. Successivamente, rimuovere il prodotto della reazione dal robot e, sul banco di lavoro, sottoporlo a dissoluzione in toluene anidro, seguita da evaporazione per rimuovere l'acqua residua. Una volta che il campione è asciutto, riposizionarlo nel robot per lo stesso ciclo, inclusa la purificazione della glicosilazione mediante FSPE.

La protezione profonda del gruppo protettivo temporaneo seguita dalla glicosilazione viene ripetuta fino al raggiungimento della lunghezza della catena desiderata per la molecola bersaglio. Per deproteggere il prodotto protetto ottenuto dall'automazione, rimuovere il vial dal robot. I passaggi finali della procedura utilizzano gas idrogeno esplosivo e devono essere eseguiti al di fuori della piattaforma automatizzata. Sul bancone del laboratorio, oz, si verifica la lisi del doppio legame nel marcatore florist e segue l'ossidazione dell'aldeide prodotta in acido carbossilico.

Purificare il prodotto ottenuto mediante cromatografia su colonna a gel di silice in banco, utilizzando una miscela di metanolo al 30% in diclorometano. Infine, per rimuovere i gruppi benzo etere mediante idrogenazione catalizzata al palladio, far passare il prodotto attraverso un disco satellitare per eliminare il palladio ed ottenere il prodotto finale puro. Caratterizzare completamente il prodotto mediante risonanza magnetica nucleare o spettroscopia NMR.

La sintesi polimerica ad alto rendimento e la fabbricazione di nanoparticelle vengono eseguite seguendo il protocollo descritto da Peterson et al. Come indicato nel documento allegato, l'apparato automatizzato per la deposizione utilizzato per la funzionalizzazione delle particelle è costituito da tre pompe ne 1000, una piattaforma robotica integrata da due attuatori, uno per il movimento nella direzione X e l'altro per il movimento nella direzione Y, e una seconda piattaforma robotica con due scaffali adiacenti composti da tre attuatori, uno per ciascuna direzione, e complessivamente da cinque attuatori collegati. Gli attuatori e le pompe in serie sono gestiti da un computer mediante software LabVIEW.

I sistemi di copolimeri utilizzati per la fabbricazione delle particelle si basano sull'acido SEBA o sull'acido SA e su un sei bis, para-carbossi, ossil esano o CPH e un diciotto bis para-carbossi fenossi tre sei diossano o CP Teeg. Dopo la fabbricazione delle nanoparticelle, posizionare un rack contenente le provette da 1,7 millilitri per la centrifugazione, con una libreria di nanoparticelle, sullo stadio dell'attuatore lineare per l'attacco di carboidrati sulla superficie delle particelle di polianidride; viene quindi eseguita una reazione di accoppiamento mediata da acidi carbossilici, costituita da due reazioni consecutive. Per la prima reazione, riempire una siringa montata su una pompa per siringhe programmabile con una soluzione acquosa di EDC ed etilendiammina a una concentrazione rispettivamente di due milligrammi per milligrammo di nanoparticelle e di 0,6 milligrammi per milligrammo di nanoparticelle.

Riempire una seconda siringa di una pompa per siringhe programmabile con 2,5 milligrammi per milligrammo di particelle di NHSA, per un totale di 12 equivalenti per campione di nanoparticelle, sotto forma di soluzione acquosa. Successivamente, utilizzando il programma LabVIEW, istruire il robot a depositare sospensioni di reagenti all'interno della libreria di nanoparticelle. Gli attuatori del robot sposteranno quindi il porta provette nella posizione corretta sulla piattaforma per la dispensazione delle soluzioni, EDC e NHS.

Attivare i gruppi acidi carbossilici sulla superficie delle nanoparticelle di polianidride e consentire un accoppiamento medio. Successivamente, immergere una sonda a ultrasuoni in ogni provetta e sottoporre ogni campione a sonificazione per 30 secondi a 40 hertz. Prima di passare al campione successivo, pulire la sonda con acetone.

Dopo che tutti i campioni sono stati saturati, il portaprovetta viene staccato dalla piattaforma robotica. Incubare le sospensioni di nanoparticelle per nove ore con rotazione costante a quattro gradi Celsius. I tempi di reazione della prima e della seconda reazione possono essere modificati per regolare la concentrazione finale di saccaride.

Al termine della reazione, centrifugare i tubi a 12.000 ×g per cinque minuti. In un ambiente freddo, tornare alla stazione robotica. Riattaccare il portatubi al braccio robotico e riempire la seconda siringa sulla piattaforma robotica.

Con acqua fredda, la prima siringa deve rimanere vuota. Avviare il robot. Il soprannatante in ogni provetta viene aspirato nella siringa vuota e la seconda pompa introduce acqua fredda nelle provette.

Questo passaggio viene eseguito per rimuovere eventuali reagenti inattivi dalle sospensioni di nanoparticelle. Successivamente, omogeneizzare la sospensione di nanoparticelle mediante sonificazione, come dimostrato in precedenza. Quindi, centrifugare i tubi a 12.000 ×g per cinque minuti.

Eseguire un secondo lavaggio con acqua fredda utilizzando l'apparato robotico: caricare nel primo pompa 12 equivalenti per campione di nanoparticelle di EDC e nel secondo pompa 12 equivalenti per campione di nanoparticelle di NHS. Avviare la piattaforma robotica per erogare volumi adeguati nei tubi contenenti le nanoparticelle. La presenza di EDC e NHS permetterà la formazione di un legame ammidico tra i gruppi amminici dell'etilene dite già legati alla superficie delle nanoparticelle e il gruppo acido carbossilico dello zucchero protetto.

Una volta completata la deposizione, caricare 10 equivalenti di un saccaride specifico. In questo caso, è stato utilizzato il lattosio e l'acido glicolico come controllo nei due pompe disponibili. Ogni saccaride viene depositato in provette a seconda della funzionalizzazione desiderata da ottenere in ciascuna provetta, precedentemente programmata nel programma di visualizzazione del laboratorio, utilizzato per gestire le funzioni degli attuatori e delle pompe per la reazione specifica impiegata. In questo studio, per l'ancoraggio di carboidrati, l'acido glicolico viene utilizzato come controllo del linker poiché i saccaridi profondamente protetti possiedono già questa molecola legata covalentemente, consentendo un ulteriore ancoraggio alla superficie delle nanoparticelle.

Le sospensioni di nanoparticelle vengono omogeneizzate mediante sonificazione come in precedenza, quindi incubate per nove ore con rotazione costante a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, lavare le sospensioni di nanoparticelle mediante centrifugazione, rimuovendo il soprannatante; successivamente risospendere il pellet in acqua fredda, sonificare e posizionare i tubi, che ora contengono la libreria di nanoparticelle funzionalizzate, in una camera a vuoto per almeno due ore. Le nanoparticelle funzionalizzate vengono caratterizzate mediante scattering dinamico della luce e altri metodi per valutare la composizione superficiale, la concentrazione, le dimensioni delle particelle, la distribuzione dimensionale e la carica superficiale.

Il lato diano completamente protetto mostrato qui è stato sintetizzato utilizzando la piattaforma automatizzata. Il composto sintetizzato è stato caratterizzato mediante NMR del protone in uno spettrometro VXR da 400 megahertz. Utilizzando CDC13 come solvente, la formazione del prodotto può essere confermata dalla presenza di alcuni picchi caratteristici.

Nel diagramma NMR del protone, i quattro protoni compresi tra 1,79 e 2,21 e i due protoni a 3,38 provengono dal marcatore florist. Il picco singoletto a 2,16 corrisponde al picco dell'acetato; i picchi a 4,94 e 5,11 sono i protoni anomerici utilizzati per valutare l'effetto del tempo di reazione sulla morfologia finale delle nanoparticelle e sul grado di attacco dello zucchero ottenuto. Le nanoparticelle sono state funzionalizzate aumentando i tempi di reazione: come mostrato qui, la concentrazione di diano sulla superficie delle nanoparticelle 50 50 CPT CPH è aumentata con il tempo totale di reazione e ha raggiunto un massimo dopo 18 ore.

Nanoparticelle funzionalizzate con un tempo di reazione totale di 24 ore sono state quindi utilizzate per valutarne la capacità di bersagliare i CLR su cellule dendritiche derivate dal midollo osseo di topo mediante citometria a flusso, come mostrato qui. È stata osservata un'espressione aumentata del segnale DC e del recettore mannosidico verso i recettori di tipo lectina C dopo la stimolazione con nanoparticelle non funzionalizzate, nonché con quelle funzionalizzate con lattosio e DANO. Ciò indica un efficace indirizzamento.

Tuttavia, le particelle funzionalizzate con Diano hanno mostrato un livello di espressione più elevato, indicando una specificità di questo ligando per i recettori studiati. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire la sintesi automatizzata ad alto rendimento di oligosaccaridi e della funzionalizzazione di nanoparticelle polimeriche. Utilizzando questi agenti mirati a base di carboidrati, una volta acquisita padronanza nella sintesi dello zucchero protetto donatore-accettore, nonché nell'assemblaggio dell'apparato, il processo può essere completato in 24-48 ore.

Ovviamente, la durata dipende dalle dimensioni della libreria così come dal tempo di funzionalizzazione. Durante l'applicazione di questo metodo, è importante ricordare che è possibile ottimizzare le condizioni di reazione per la funzionalizzazione di particelle polimeriche biodegradabili a base di idrogel in base alla chimica delle nanoparticelle. Seguendo questa procedura, possono essere sintetizzate diverse strutture di carboidrati al fine di bersagliare diversi recettori cellulari e influenzare l'esito immunologico.