High-throughput sintesi dei carboidrati e funzionalizzazione di nanoparticelle polianidride

In questo articolo video, descriviamo un nuovo protocollo idro put per la sintesi automatizzata della fase di soluzione di oligosaccaridi e la funzionalizzazione di nanoparticelle di polianipa. Con questi agenti mirati a base di carboidrati, le prime molecole di carboidrati vengono sintetizzate utilizzando un sistema automatizzato che utilizza la sintesi in fase di soluzione invece dei sintetizzatori in fase solida. Successivamente, gli intermedi oligosaccaridici vengono purificati da un fiorista, estrazione in fase solida o FSPE.

Le molecole di carboidrati prodotte sono caratterizzate da NMR e quindi vengono attaccate alle nanoparticelle di polianidride mediante coniugazione di carbo IDE. Infine, le nanoparticelle funzionalizzate con carboidrati sono caratterizzate mediante spettroscopia fotoelettronica a raggi X e un saggio di acido fenilsolforico idro putt. In definitiva, utilizzando la metodologia idroponica qui descritta, sono state ottenute le condizioni di reazione per ottimizzare la morfologia delle nanoparticelle e la densità dei carboidrati sulla superficie delle particelle.

Il vantaggio principale di questo metodo rispetto a quelli esistenti, come la sintesi di oligosaccaridi solidi, è che in questo metodo utilizziamo una quantità sostanzialmente inferiore di elementi costitutivi In questo metodo, in genere utilizziamo due o tre equivalenti invece di 10 o 20 equivalenti. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando abbiamo dimostrato l'efficacia degli effetti di superficie, la funzionalizzazione di nanoparticelle poli idro, utilizzando i carboidrati per colpire i recettori ceep sulle cellule anti ammaccatura. Abbiamo quindi voluto progettare un sistema ad alta produttività che ci consentisse di esaminare i molteplici parametri coinvolti nella fabbricazione e nell'applicazione di questi nuovi vettori.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché lo sviluppo di piattaforme automatizzate per la sintesi ad alto rendimento di oligosaccaridi e il loro attaccamento a particelle polimeriche è una nuova area di indagine senza molta documentazione disponibile prima della sintesi automatizzata dell'acido diano. Un donatore di zucchero adeguatamente protetto, tipicamente tricloro acetammide un accettore principalmente in Alcon, l'alcol fluoroso viene sintetizzato sul banco di lavoro e preparato in clorometano prepara anche silo trimetilico, trifluorometano solfonato in clorometano, 80% metanolo e 100% metanolo. Assicurarsi che l'umidità relativa nella stanza sia del 30% o inferiore nella camera di automazione.

L'elevata umidità è dannosa per le reazioni di glicosilazione. I passaggi seguenti vengono eseguiti utilizzando una piattaforma di automazione. La prima glicosilazione viene effettuata con l'alcol del donatore e del fiorista.

Una volta fatto, la molecola di zucchero risultante dal fiorista viene purificata da FSPE. Il gruppo protettivo temporaneo viene quindi rimosso da sodio, ossido di metanfetamina e metanolo e, ancora una volta, il prodotto viene purificato da FSPE. Dopodiché, lo zucchero del fiorista viene utilizzato come accettore e accoppiato allo stesso donatore per ottenere il disaccaride, il disaccaride viene purificato da FSPE per iniziare.

Posizionare i reagenti, tra cui il promotore accettore donatore, l'80% di metanolo acqua, il 100% di metanolo, l'ossido di sodio metanfetamina nella piattaforma robotica e avviare il programma. Il braccio robotico ritirerà il donatore e poi l'accettore dalle fiale e li trasferirà in una fiala di reazione. Quindi la miscela di donatore e accettore viene mescolata per 30 minuti.

Dopo che sono trascorsi 30 minuti. Il braccio robotico trasferisce il silo catalitico trimetilico, il trifluoro, il metano solfonato nella miscela. La soluzione viene quindi mescolata per altri 30 minuti Al termine dell'agitazione, il programma si interrompe.

Rimuovere un'aliquota di 10 microlitri per verificare se la reazione è completa mediante cromatografia su strato sottile. Se la reazione è completa, la molecola accettore non sarà visibile. Se la reazione non è completa, l'accettore sulla TLC è ancora visibile.

In questo caso, interrompere il programma, reimpostare i tempi di glicosilazione intorno ai 30 minuti e aggiungere un eccesso di promotore trimetil silo, trifluoro, metano solfonato. Al termine della reazione, continuare con il passaggio successivo. Una volta completata la reazione, il robot trasferisce la miscela di reazione in cartucce FSPE contenenti gel di silice modificato C nine F 17 per la purificazione.

Successivamente, le cartucce vengono lavate con otto millilitri di metanolo all'80%, seguiti da otto millilitri di metanolo al 100%. Per eliminare la frazione non floris, il flusso viene raccolto in una fiala per ottenere il prodotto etichettato dal fiorista desiderato. Se è necessaria un'ulteriore purificazione, mettere in pausa il robot e rimuovere i prodotti di reazione appropriati.

A seconda della struttura, i donatori possono essere estremamente non reattivi e alcune molecole accette del fiorista rimarranno anche dopo aver aggiunto un promotore sufficiente. Se questo è il caso, l'FSPE non sarà abbastanza efficiente per la purificazione e un'ulteriore purificazione tramite cromatografia su colonna su gel di silice può essere eseguita dopo la purificazione il braccio robotico eroga ossido di sodio metanfetamina nella fiala di reazione. La reazione viene quindi agitata per due ore nella piattaforma robotica, se non completa come determinato da TLC, prolunga il periodo di incubazione di circa un'ora.

Dopo il completamento della reazione, il prodotto viene purificato da FSPE come prima. Successivamente, rimuovere il prodotto di reazione dal robot e sul banco di lavoro sottoposto a dissoluzione in toluene anidro, seguita da evaporazione per rimuovere l'acqua residua. Una volta che un campione è asciutto, rimetterlo nel robot con lo stesso ciclo, compresa la purificazione della glicosilazione mediante FSPE.

La protezione profonda del gruppo protettivo temporaneo seguita dalla glicosilazione viene ripetuta fino a ottenere la lunghezza della catena desiderata per la molecola bersaglio per proteggere il prodotto protetto ottenuto dall'automazione, rimuovere la fiala dal robot. Le fasi finali della procedura utilizzano idrogeno gassoso esplosivo e devono essere eseguite all'esterno della piattaforma di automazione. Sul banco di lavoro, si verifica la lisi del doppio legame nella targhetta del fiorista ed è seguita dall'ossidazione dell'aldeide prodotta in acido carbossilico.

Purificare il prodotto risultante mediante cromatografia su colonna su gel di silice su un banco di lavoro utilizzando una miscela di metanolo al 30% in clorometano. Infine, per proteggere i gruppi benzoetere mediante idrogenazione catalizzata dal palladio, passare il prodotto attraverso un pad satellitare per eliminare il palladio, per ottenere il prodotto finale puro. Caratterizzare completamente il prodotto utilizzando la risonanza magnetica nucleare o la spettroscopia NMR.

La sintesi di polimeri put ad alta gittata e la fabbricazione di nanoparticelle vengono effettuate seguendo il protocollo descritto da Peterson et al. Come indicato nel documento di accompagnamento, l'apparato di deposizione automatizzato utilizzato per la funzionalizzazione delle particelle è costituito da tre pompe NE 1000, uno stadio robotico integrato da due attuatori, uno per il movimento in direzione X e l'altro per il movimento in direzione Y e un secondo stadio robotico con due rack adiacenti costituiti da tre attuatori, Uno per ogni direzione sono collegate le pompe e un totale di cinque attuatori. In serie, gli attuatori e le pompe sono azionati da un computer che utilizza il software di visualizzazione del laboratorio.

I sistemi di copolimeri utilizzati per la fabbricazione di particelle sono basati su acido SEBA o SA e uno sei bis, carbossi paraico, oxil heane o CPH e uno otto BIS para carbossi fenossi tre sei diossano o CP Teeg. Dopo il luogo di fabbricazione delle nanoparticelle, per la prima reazione viene eseguito un rack contenente le provette da centrifugazione da 1,7 millilitri con una libreria di nanoparticelle allo stadio dell'attuatore lineare per l'attaccamento dei carboidrati alla superficie delle particelle di poliania e una reazione di accoppiamento dell'acido carbossilico medio costituita da due reazioni consecutive. Riempire una siringa in una pompa a siringa programmabile con una soluzione acquosa di EDC ed etilene diammina a una concentrazione di due milligrammi per milligrammo di nanoparticelle e 0,6 milligrammi per milligrammi di nanoparticelle rispettivamente.

Riempire una seconda siringa in una pompa a siringa programmabile con 2,5 milligrammi per milligrammo di particelle di NHSA per un totale di 12 equivalenti per campione di nanoparticelle, una soluzione acquosa. Successivamente, utilizzando il programma di visualizzazione del laboratorio, istruire il robot a depositare le sospensioni di reagenti nella libreria di nanoparticelle. Gli attuatori del robot sposterebbero quindi il supporto del tubo nella posizione corretta nella piattaforma per la dispensazione di soluzioni, EDC e NHS.

Attivare i gruppi di acido carbossilico sulla superficie delle nanoparticelle di polianidride e consentire un accoppiamento medio. Quindi, immergere una sonda di sonicazione in ciascun tubo e sonicare ogni campione per 30 secondi a 40 hertz. Prima di passare al campione successivo, pulire la sonda con acetone.

Una volta che tutti i campioni sono sazi, il supporto della provetta viene staccato dalla piattaforma robotica. Incubare le sospensioni di nanoparticelle per nove ore con rotazione costante a quattro gradi Celsius. I tempi di reazione per la prima e la seconda reazione possono essere modificati per regolare la concentrazione finale di saccaridi.

Al termine della reazione, centrifugare le provette a 12.000 volte G per cinque minuti. In un ambiente freddo, tornare alla stazione robotica. Ricollegare il supporto del tubo al braccio robotico e riempire la seconda siringa nella piattaforma robotica.

Con acqua fredda, la prima siringa deve rimanere vuota. Avvia il robot. Il surnatante in ogni provetta viene prelevato nella siringa vuota e la seconda pompa deposita acqua fredda nei tubi.

Questo passaggio viene eseguito per rimuovere eventuali reagenti non reattivi dalle sospensioni di nanoparticelle. Successivamente, omogeneizzare la sospensione di nanoparticelle mediante sonicazione come dimostrato in precedenza. Quindi centrifugare le provette a 12.000 volte G per cinque minuti.

Eseguire un secondo lavaggio con acqua fredda utilizzando l'apparato robotico per il secondo carico di reazione: 12 equivalenti per campione di nanoparticelle di EDC nella prima pompa e 12 equivalenti per campione di nanoparticelle di NHS nella seconda pompa. Avviare la piattaforma robotica per erogare volumi adeguati nelle provette contenenti nanoparticelle. La presenza di EDC e NHS permetterà la formazione di un legame ammidico tra i gruppi amminici del dite di etilene già attaccato alla superficie della nanoparticella e il gruppo acido carbossilico dello zucchero profondamente protetto.

Una volta completata la deposizione, caricare 10 equivalenti di un saccaride specifico. In questo caso, è stato utilizzato il lattosio e il controllo dell'acido glicolico nelle due pompe disponibili. Ogni saccaride viene depositato in provette a seconda della funzionalizzazione desiderata da ottenere in ciascuna provetta, che è precedentemente programmata nel programma di visualizzazione del laboratorio, utilizzata per azionare gli attuatori e le funzioni della pompa per la reazione specifica impiegata In questo studio per l'attacco dei carboidrati, l'acido glicolico viene utilizzato come controllo del linker poiché i saccaridi profondamente protetti hanno già questa molecola legata in modo covalente, che consente un ulteriore attaccamento alla superficie delle nanoparticelle.

Le sospensioni di nanoparticelle vengono omogeneizzate mediante sonicazione come prima e poi incubate per nove ore con rotazione costante a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, lavare le sospensioni di nanoparticelle mediante centrifugazione rimuovendo il surnatante, quindi sospendere il pellet in acqua fredda e posizionare sonicamente le provette, che ora contengono la libreria di nanoparticelle funzionalizzata in una camera a vuoto per asciugare per almeno due ore. Le nanoparticelle funzionalizzate sono caratterizzate dalla diffusione dinamica della luce e da altri metodi per valutare la composizione superficiale, la concentrazione, la dimensione delle particelle, la distribuzione dimensionale e la carica superficiale.

Il lato diano completamente protetto mostrato qui è stato sintetizzato utilizzando la piattaforma di automazione. Il composto sintetizzato è stato caratterizzato mediante NMR protonica in uno spettrometro VXR da 400 megahertz. Utilizzando CDC 13 come solvente, la formazione del prodotto può essere confermata dalla presenza di alcuni picchi caratteristici.

Nel diagramma NMR del protone, i quattro protoni da 1,79 a 2,21 e i due protoni a 3,38 provengono dal tag del fiorista. Il picco di singoletto a 2,16 corrisponde ai picchi di picco dell'acetato a 4,94 e 5,11 sono i protoni anomerici per valutare l'effetto del tempo di reazione sulla morfologia finale delle nanoparticelle e il grado di attaccamento dello zucchero raggiunto. Le nanoparticelle sono state funzionalizzate con tempi di reazione crescenti come mostrato qui, la concentrazione di diano sulla superficie di 50 nanoparticelle CPT CPH è aumentata con il tempo totale di reazione e ha raggiunto un massimo dopo 18 ore.

Le nanoparticelle funzionalizzate con un tempo di reazione totale di 24 ore sono state quindi utilizzate per valutare la loro capacità di indirizzare i CLR su cellule dendritiche derivate dal midollo osseo di topo utilizzando la citometria a flusso, come mostrato qui. È stata osservata un'aumentata espressione del segno DC e del recettore della mano rispetto ai recettori della lectina di tipo C dopo stimolazione con nanoparticelle non funzionalizzate e con lattosio e dano. Ciò indica un targeting efficace.

Tuttavia, le particelle funzionalizzate di Diano hanno mostrato un livello di espressione più elevato, indicando una specificità di questo ligando per i recettori che sono stati studiati. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la sintesi automatizzata ad alto rendimento di oligosaccaridi e la funzionalizzazione di poli nanoparticelle. Utilizzando questi carboidrati a base di agenti mirati, una volta padroneggiata la sintesi dello zucchero protetto dell'accettore donatore, così come l'assemblaggio dell'apparato può essere fatto in 24-48 ore.

Naturalmente, la durata dipende dalle dimensioni della libreria e dal tempo di funzionalizzazione. Durante la partecipazione a questo metodo, è importante ricordare che è possibile ottimizzare le condizioni di reazione della funzionalizzazione di particelle poliidro biodegradabili a seconda della chimica delle nanoparticelle. Seguendo questa procedura, è possibile sintetizzare varie strutture di carboidrati al fine di indirizzare diversi recettori cellulari per influenzare l'esito immunologico.