Analisi delle variazioni di espressione genica nel Rat Hippocampus Dopo stimolazione cerebrale profonda del nucleo anteriore talamiche

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire la stimolazione cerebrale profonda del nucleo talamico anteriore e studiare i cambiamenti dell'espressione genica nell'ippocampo del ratto. Ciò si ottiene anestetizzando prima l'animale. Successivamente, l'animale viene preparato per l'intervento chirurgico.

Viene praticata un'incisione nel cuoio capelluto e il cranio viene esposto. Quindi, nella giusta posizione rispetto al bgma, vengono praticati i fori della fresa. Gli elettrodi DBS vengono inseriti e viene eseguita la stimolazione.

Infine, l'animale viene soppresso e il cervello viene sezionato. Per rimuovere l'ippocampo, il tessuto viene processato per l'estrazione dell'RNA e vengono eseguite la preparazione del CDNA e la QPCR. In definitiva, i risultati dimostrano che la stimolazione cerebrale profonda influenza l'espressione genica nell'ippocampo del ratto.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella chirurgia di stimolazione cerebrale profonda, ad esempio quali sono i meccanismi molecolari alla base dell'effetto terapeutico della chirurgia di stimolazione cerebrale profonda? Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia non solo dell'epilessia, ma anche di altre condizioni neuronali come il morbo di Parkinson, il morbo di Alzheimer e la distonia. Perché il DPS sta emergendo come approccio chirurgico per il trattamento di molti disturbi neuronali Per prepararsi all'intervento chirurgico, utilizzare cuscinetti chirurgici per coprire il banco di lavoro e assicurarsi che sia disponibile uno smaltimento dei rifiuti a rischio biologico.

Pesare il ratto e calcolare la dose di anestesia secondo il protocollo di testo montare e fissare due elettrodi sul supporto dell'elettrodo di un telaio chirurgico stereotassico e, con un microscopio, ispezionare le punte dell'elettrodo per verificarne il corretto allineamento. Fissare gli elettrodi a tre millimetri di distanza l'uno dall'altro, facendo attenzione a non toccare la punta dell'elettrodo su superfici dure. Iniettare la ketamina xilazina.

Mescolare intraperitoneale all'animale e confermare che l'animale abbia raggiunto un piano chirurgico di anestesia controllando il riflesso di pizzicamento delle dita, la frequenza respiratoria e la profondità e regolarità della respirazione. Fissare e posizionare l'animale sul telaio stereotassico. Applicare un lubrificante per gli occhi sugli occhi dell'animale per proteggerlo dall'eccessiva secchezza e disinfettare il cuoio capelluto con tre scrub alternati, ciascuno di Betadine e alcol o soluzione salina sterile.

Posiziona l'animale su un cuscinetto di acqua calda circolante o usa lampade riscaldanti per mantenere la temperatura corporea dell'animale a un livello ottimale. Sulla base dell'atlante cerebrale di ratto di Paxos e Watson, utilizzare le seguenti coordinate stereotassiche per mirare al nucleo talamico anteriore o a un NT anteriore posteriore negativo di 1,6 millimetri. Media laterale 1,5 millimetri e dorso ventrale 5,2 millimetri.

Successivamente, praticare un'incisione nel cuoio capelluto sagittale per rivelare il cranio Utilizzando un paio di divaricatori, fissare il cuoio capelluto inciso per esporre il cranio. Quindi, con tamponi sterili imbevuti di etanolo, pulire la regione incisa per esporre chiaramente le suture. Individua il bgma e usa un pennarello nero per guidare la posizione dei fori della fresa.

Fai altri due segni a circa 1,5 millimetri. Media lateralmente su entrambi i lati dalla sutura sagittale e 1,6 millimetri posteriormente alla sutura coronale. Ora per fare i due fori della fresa, usa l'etanolo per disinfettare la punta del trapano.

Utilizzando un trapano tenuto a un angolo di 45 gradi, praticare i fori della fresa passando frequentemente tra i due fori per evitare un calore eccessivo al centro di uno dei fori della fresa. Continuare a forare fino a quando la dura madre non è esposta. Utilizzando un ago con la punta piegata a forma di L, rimuovere eventuali pezzi di osso rotti che ostruirebbero l'inserimento dell'elettrodo.

Fare attenzione a non danneggiare la dura madre sottostante e/o il tessuto cerebrale durante la rimozione dei frammenti ossei. Fissare il gruppo elettrodo doppio all'impugnatura rotante del telaio stereotassico e fissare l'impugnatura a un angolo di 90 gradi. Utilizzando le regolazioni nel telaio stereotassico, posizionare l'elettrodo sinistro esattamente sopra il bgma.

Utilizzo delle regolazioni stereotassiche per i media. Il posizionamento laterale ha spostato con precisione l'elettrodo sinistro di 1,5 millimetri sul lato sinistro del bgma, in modo tale che ora ci sono due elettrodi perfettamente allineati lungo la sutura coronale, ma distanziati tra loro. 1,5 millimetri lateralmente dal BGMA.

Quindi, con le regolazioni stereotassiche antero-posteriori, spostare gli elettrodi di 1,6 millimetri posteriormente alla sutura coronale. Quindi, con le regolazioni ventrali dorsali, abbassare gli elettrodi per verificare prima se i fori della fresa sono stati realizzati nella posizione corretta, in modo tale che gli elettrodi possano essere inseriti con facilità senza toccare i bordi ruvidi dei fori della fresa. In tal caso, inserire gli elettrodi a una profondità di 5,2 millimetri dalla superficie del cranio.

Collegare gli elettrodi tramite cavi a uno stimolatore impostato a 130 hertz, 2,5 volt e larghezza di impulso di 90 microsecondi. Fornire una stimolazione ad alta frequenza per un periodo di tempo desiderato. Esecuzione di stimolazione unilaterale o bilaterale.

Dopo aver eseguito la stimolazione, rimuovere con cura gli elettrodi e con tre punti di sutura zero o graffette chirurgiche sterili, suturare l'incisione, somministrare buprenorfina per via sottocutanea e monitorare l'animale fino a quando non ritorna alla normale attività, quindi riportarlo alla struttura di stabulazione. Posiziona il cervello su una matrice cerebrale acrilica pre-raffreddata sul ghiaccio usando una lama di rasoio. Tagliare il corly cerebrale a circa sette-otto millimetri dal bordo più anteriore del cervello.

Eseguire un secondo taglio e posteriormente al primo taglio in modo da poter rimuovere una fetta di cervello spessa circa cinque millimetri. Trasferisci la fetta di cervello in una capsula di Petri con PBS ghiacciato usando una lama di rasoio, recidi le due sezioni emisferiche e fai attenzione a notare quale sezione corrisponde rispettivamente ai lati sinistro e destro. Utilizzando una pinza fine e le forbici, rimuovere con cura il flash dell'ippocampo, congelare il tessuto su ghiaccio secco e conservarlo a meno 20 gradi Celsius fino a quando non è pronto per i successivi passaggi dell'RNA eseguiti secondo il protocollo di testo mostrato qui è i livelli di espressione relativi di BDNF rispetto al gene di controllo beta actina nei punti temporali indicati.

Dopo la stimolazione DBS. L'upregolazione del BDNF si osserva immediatamente dopo l'intervento chirurgico di DBS, insieme al picco di espressione a tre ore dopo la stimolazione. Questa osservazione suggerisce che un'aumentata espressione di BDNF e la conseguente neuroprotezione potrebbero contribuire al beneficio terapeutico della DBS per i pazienti epilettici.

Questo pannello illustra l'espressione del recettore GABA, G-A-B-R-D, che mostra una maggiore espressione negli animali stimolati rispetto ai controlli non stimolati a tre ore dopo DBS. Considerando che gli agonisti del GABA sono usati come efficaci soppressori delle crisi, è interessante osservare un aumento dell'espressione di G-A-B-R-D dopo la DBS che implica un possibile ruolo del GABA e l'effetto antiepilettico della DBS. Seguendo questa procedura.

È possibile eseguire altri metodi come il blocco occidentale, l'immunoprecipitazione della cromatina e molti altri saggi biologici molecolari standard. Questo aiuta a rispondere a domande relative ai cambiamenti nell'espressione proteica, alle modifiche post-traduzionali, all'occupazione dei fattori di trascrizione su specifiche regioni promotrici del gene, eccetera. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un intervento chirurgico di stimolazione cerebrale profonda nei ratti.

Isolare il tessuto ippocampale e analizzarlo per verificare la presenza di cambiamenti nell'espressione genica.