Name: Analisi delle variazioni di espressione genica nel Rat Hippocampus Dopo stimolazione cerebrale profonda del nucleo anteriore talamiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Scopri come eseguire la stimolazione cerebrale profonda del nucleo anteriore talamico nel ratto e analizzare le variazioni di espressione genica nell'ippocampo. Questo metodo consente di studiare i meccanismi molecolari alla base degli effetti terapeutici della DBS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Siamo grati per il supporto della fondazione NREF.

NOTA: Etica Dichiarazione: Tutte le procedure descritte in questo manoscritto sono in conformità con le linee guida NIH per la ricerca animale (Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio) e sono approvati dalla Scuola Medica Comitato IACUC Harvard. Preparazione 1. Pre-chirurgica <ol><li> Assicurarsi che tutti gli strumenti chirurgici sono sterilizzati in autoclave sia o la pulizia con soluzione antisettica e / o etanolo, se necessario. Se possibile, utilizzare materiale monouso sterile come bisturi, aghi e siringhe. </li><li> Coprire il banco di lavoro con teli chirurgici e garantire che vi sia un rischio biologico di smaltimento disponibili. </li><li> Pesare il ratto e calcolare la dose di anestesia. Utilizzare un / Xilazina mix Ketamina (ketamina 75 mg / kg e Xilazina 10 mg / kg), per anestetizzare i topi. NOTA: Tra 200-250 g è il peso ottimale per il corretto fissaggio dell&#39;animale nel telaio stereotassico nonché per il targeting accurata della ATN. Isoflurane può essere utilizzato anche come agente anestetizzante. </li><li> Supporto e bloccare due elettrodi sterili (sterilizzato in autoclave o con ossido di etilene) sul supporto per elettrodi (Figura 2) di un telaio stereotassico chirurgica e con l&#39;aiuto di un microscopio (10-40X ingrandimenti), ispezionare le punte dell&#39;elettrodo per una corretta allineamento. Fissare i due elettrodi 3,0 millimetri di distanza. NOTA: Fare attenzione a non danneggiare l&#39;elettrodo toccando superfici dure. </li></ol> 2. DBS Chirurgia <ol><li> Iniettare la ketamina / Xilazina mix intraperitoneale all&#39;animale e confermare che l&#39;animale ha raggiunto un piano chirurgica di anestesia (controllando per la reflex toe-pizzico, la frequenza respiratoria e la profondità e la regolarità della respirazione). Rimuovere capelli dalla regione del cuoio capelluto che verrà incisa e disinfettare il cuoio capelluto con 3 scrub alternati ciascuno di betadine e alcole o soluzione fisiologica sterile. Sicuro e posizionare l&#39;animale sul fram stereotassicae. </li><li> Usa circolano pastiglie di acqua calda per mantenere la temperatura del corpo dell&#39;animale ad un livello ottimale. Applicare il lubrificante occhio agli occhi dell&#39;animale per proteggere dalla overdrying. </li><li> Utilizzare i seguenti coordinate stereotassica per mira il ATN (anteriore nucleo del talamo): anterioposterior -1.6 mm, mediolaterale 1,5 mm dorsoventrale 5,2 millimetri 1. NOTA: Le coordinate stereotassica si basano sulla Paxinos e Watson (6 ° edizione) Rat Brain atlas 36. </li><li> Fare un&#39;incisione nel cuoio capelluto sagittalmente per rivelare il cranio. Utilizzando un paio di divaricatori fissare il cuoio inciso per esporre il cranio. Utilizzare soluzione salina sterile per irrigare l&#39;incisione. Se incisione è troppo bagnato, usare tamponi di cotone sterili ad asciugare. Individuare il bregma e segnare con un pennarello nero. Per guidare la posizione dei fori di bave, rendono più due marchi in approssimativamente di 1,5 mm mediolaterally su entrambi i lati dalla sutura sagittale e 1,6 mm posteriormente al coronal sutura. </li><li> Utilizzare un trapano a mano per fare i buchi bave. Assicurarsi che la punta del foro bava è sterile mediante sterilizzazione con etanolo. Tenere il trapano a circa 45 ° rispetto alla superficie del cranio durante la foratura. Cambiare spesso tra i due fori bave per evitare eccessivo calore nella posizione di qualsiasi foro cranico. </li><li> Continuare fino a quando la perforazione dura è esposto. Utilizzando un ago con la punta piegata simile forma di &#39;L&#39;, rimuovere eventuali frammenti di osso che impedirebbero l&#39;inserimento dell&#39;elettrodo. Fare attenzione a non danneggiare la dura e / o cerebrale sottostante tessuto durante la rimozione di frammenti ossei utilizzando l&#39;ago piegato. NOTA: Utilizzando un ago smussato o pinza sottile contundenti è anche un&#39;opzione. </li><li> Fissare il gruppo doppio elettrodo al manico girevole del telaio stereotassico e fissare il manico con un angolo di 90 °. Utilizzando le regolazioni del telaio stereotassico, posizionare l&#39;elettrodo sinistra esattamente sopra il bregma. </li><li> Utilizzando lo stereorettifiche tattiche di posizionamento mediolaterale, muovono precisamente l&#39;elettrodo sinistra da 1,5 mm per il lato sinistro del bregma tale che vi sono due elettrodi perfettamente allineati lungo la sutura coronale ma distanziate a 1,5 millimetri mediolaterally dal bregma. </li><li> Utilizzando le regolazioni stereotassica anterioposterior, spostare gli elettrodi 1,6 millimetri posteriormente al sutura coronale. </li><li> Utilizzare le regolazioni dorsoventrale per abbassare gli elettrodi al primo controllo se i fori bave sono state effettuate nella posizione giusta in modo che gli elettrodi possono essere inseriti con facilità, senza toccare gli spigoli dei fori bave. Se è così, inserire gli elettrodi ad una profondità di 5,2 mm dalla superficie del cranio. </li><li> Collegare gli elettrodi tramite porta ad uno stimolatore fissato a 130 Hz, 2,5 V e 90 msec pulsewidth 1. </li><li> Invia stimolazione ad alta frequenza per un&#39;ora (o per un periodo di tempo desiderato secondo apparato sperimentale). Nel corso della stimolazione, ricordarsi di assicurare proper profondità dell&#39;anestesia regolarmente controllando l&#39;assenza di recesso piede in risposta ad una presa punta. Supplemento anestesia con circa metà della dose iniziale usato per indurre anestesia. Evitare la contaminazione dei tuoi guanti sterili durante il controllo profondità dell&#39;anestesia e modificarle, se necessario. Eseguire la stimolazione unilaterale o bilaterale in base alle esigenze sperimentali di uno. Includere controlli come la stimolazione a bassa frequenza (per es., 10 Hz) e gli animali non stimolate (inserimento elettrodi senza stimolazione successiva). </li><li> Dopo la stimolazione è fatto, rimuovere con attenzione gli elettrodi e suturare l&#39;incisione con 3-0 punti di sutura o con punti chirurgici sterili. </li><li> Somministrare buprenorfina (0,05 mg / kg) per via sottocutanea in analgesia. Monitorare l&#39;animale fino a tornare alla normale attività e poi tornare alla struttura alloggiativa. </li><li> Dopo un periodo di tempo sulla base del disegno sperimentale (per esempio, 0, 3, 6 o 12 ore dopo l&#39;intervento chirurgico DBS), Eutanasia l&#39;animale con overdose anestesia. Dopo aver confermato l&#39;assenza di segni vitali, decapitare il animali. </li><li> Sezionare il cervello prima di rimuovere la pelle con le forbici. Tagliare l&#39;osso lungo la sutura sagittale con le forbici dissezione. Effettuare altre due incisioni (circa un pollice ciascuna) attraverso l&#39;osso su entrambi i lati laterali. Utilizzando pinze, sollevare il pezzo di osso parzialmente reciso dalla sommità del cranio per esporre il cervello. </li><li> Utilizzando forbici o pinze sottili, staccare il cervello dal cranio e trasferire ad una capsula di Petri con PBS freddo sul ghiaccio. NOTA: Fare attenzione per evitare danni al cervello rendendo le incisioni attraverso l&#39;osso. </li></ol> 3. Hippocampus Isolation NOTA: Eseguire tutte le fasi successive di questa sezione sul ghiaccio. <ol><li> Posizionare il cervello su una matrice acrilica cerebrale pre-raffreddata in ghiaccio. Utilizzando una lama di rasoio, tagliare il cervello coronale a circa 7-8 mm dal antero-più edge del cervello. Fare un secondo taglio coronale e posteriore per il primo taglio in modo tale che una fetta cervello di circa 5 mm di spessore può essere rimosso. </li><li> Trasferire la fetta cervello di una capsula di Petri con PBS freddo. Utilizzando lama di rasoio, tagliare le due sezioni emisferiche e prendersi cura notare che emisfero corrisponde, rispettivamente, ai lati sinistro e destro. Questo è particolarmente importante durante l&#39;esecuzione stimolazioni unilaterali. </li><li> Utilizzando una pinza sottile e forbici rimuovere con attenzione l&#39;ippocampo. </li><li> Flash congelare il tessuto dell&#39;ippocampo in ghiaccio secco e conservare in freezer a -20 ° C fino al momento per le fasi di estrazione RNA successive. NOTA: Per la conservazione a lungo termine, si consiglia di conservare il tessuto in una -80 ° C freezer. </li></ol> 4. RNA Estrazione e PCR quantitativa <ol><li> Assicurarsi che il tessuto rimane congelato in ghiaccio secco fino al momento omogeneizzazione. </li><li> NOTA: Eseguire questo passaggio nella cappa. <ol><li> Aggiungere 1 ml di Tri reagente Hipptessuto ocampal in una provetta da centrifuga da 1,5 ml ed omogeneizzare dal primo pipettaggio più volte fino a quando il tessuto è rotto in pezzi più piccoli. Ulteriori omogeneizzare il tessuto passando attraverso una siringa con un ago 25 G fino a quando nessun tessuto ininterrotta visibile. Eseguire le operazioni di omogeneizzazione sul ghiaccio. </li><li> Dopo omogeneizzazione del tessuto, permette la sospensione cellulare a riposare a temperatura ambiente per 5 minuti per consentire la lisi cellulare. NOTA: Dopo questo punto la sospensione cellulare può essere veloce congelate e conservate a -70 ° C fino ad ulteriore lavorazione. </li></ol></li><li> Aggiungere 0,2 ml di cloroformio e mescolare nel vortex per 20 secondi e lasciare la soluzione riposo a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Centrifugare i campioni a 12.000 xg per 15 min a 4 ° C. Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione i tubi senza disturbare i tre strati separati che saranno visibili. NOTA: La fase (rosso) in basso contiene proteine, mezzo fase nuvoloso contiene DNA e la fase superiore libero contiene RN / A. </li><li> Trasferire il top fase chiaro (RNA) in un nuovo 1,5 ml tubo da centrifuga (tipicamente 500 ml di RNA contenente fase si ottiene). Per questo aggiungere 0,5 ml di isopropanolo e mescolare nel vortex. A questo si aggiunge 2-3 glicogeno microlitri (20 mg / ml) come vettore per l&#39;RNA. Lasciare il campione a riposo sul tavolo a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Centrifugare il campione a 12.000 xg per 1 ora a 4 ° C. Assicurarsi che il pellet di RNA è visibile nella parte inferiore del tubo. </li><li> Eliminare il surnatante e lavare il pellet di RNA aggiungendo 1 ml di etanolo al 75% (a base di acqua priva di nucleasi). Invertire le più volte campione finché il pellet dislodges dal fondo del tubo e galleggia nella soluzione. Centrifugare la soluzione a 12.000 xg per 10 min a 4 ° C. NOTA: Il precipitato in 75% etanolo può essere conservato a -20 ° C fino ulteriori passi. </li><li> Consentire il pellet di RNA asciugare lasciando le provette aperte per 5 min a temperatura ambiente. Prendere precauzioni per evitare over essiccazione del pellet in quanto questo potrebbe compromettere la dissoluzione in acqua nel passaggio successivo. </li></ol> 5. Rimozione DNA dal RNA Preparazione <ol><li> Aggiungere 9 ml di acqua priva di nucleasi al pellet di RNA e assicurarsi che il pellet viene sciolto prima di procedere vortex delicatamente il tubo. Per questo aggiungere 1 ml di 10x DNasi I Buffer e 1 ml DNasi ricombinante (da DNase kit I), mescolare delicatamente sfogliando i tubi, brevemente girare i tubi e incubare a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua per 30 minuti. </li><li> Aggiungere 2 ml di reagente inattivazione DNasi (da DNasi kit I) al campione e incubare a temperatura ambiente per 2 minuti e mescolare spesso muovendo delicatamente il tubo. Centrifugare a 12.000 xg per 10 minuti e il trasferimento di circa 10 ml di surnatante limpido di un nuovo 1,5 ml provetta da centrifuga. </li><li> Misurare la concentrazione di RNA con un NanoDrop o spettrofotometro. </li></ol> 6. Fare cDNA da RNA <ol><li> Aggiungi th volumi richiestiin contiene 1 mg di RNA e portare il volume totale a 8 microlitri aggiungendo acqua priva di nucleasi. Per questo aggiungere dNTP 1 ml 10 mM mix e 1 ml di esameri casuali dal Kit Apice First Strand Synthesis. Mescolare delicatamente e incubare a 65 ° C per 5 minuti in una vasca di acqua o in un termociclatore pre-programmato. </li><li> Fare un premiscelato contenente i seguenti reagenti: 2 ml di 10x RT Buffer, 4 ml di 25 M MgCl 2, 2 ml di 0,1 M DTT e 1 ml di RNAsi OUT (40 U / ml). NOTA: I volumi indicati sono per reazione, l&#39;utente avrebbe bisogno di scalare fino in base alle proprie esigenze sperimentali. </li><li> Dopo aver rimosso l&#39;RNA contenente campioni da 65 ° C, impostare il tubo a temperatura ambiente per un minuto. Aggiungere la soluzione prediluita 9 ml e incubare a temperatura ambiente per 2 min. Aggiungere 1 ml di Superscript II enzima trascrittasi inversa (50 U / mL) e poi incubare a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Incubare i campioni a 42 ° C per 50min per la trascrizione inversa a verificarsi. </li><li> Incubare i campioni a 70 ° C per 15 minuti per terminare la reazione. </li><li> Mettere i campioni in ghiaccio brevemente e aggiungere 1 ml RNaseH (2 U / ml) e incubare a 37 ° C per 20 min. </li><li> Brevemente centrifugare le provette a 3000 xg per centrifugare il liquido di condensa. NOTA: Questo è il cDNA che verrà utilizzato per la PCR quantitativa. cDNA può essere conservato in congelatore a -20 ° C finché configurazione PCR. cDNA può essere diluito con acqua priva di nucleasi prima di procedere alla PCR. </li></ol> 7. PCR quantitativa <ol><li> Fai un master mix contenente i seguenti reagenti (i volumi indicati sono per reazione): 6.3 ml di 2x Sybr verde Mix, 0,6 ml di Forward Primer (10 micron), 0,6 ml di Reverse Primer (10 micron) e 0,5 ml di acqua priva di nucleasi . NOTA: il design Primer è stato fatto con il &#39;pick Primer&#39; opzione nella pagina di sequenza nucleotidica del NCBI per il gene di interesse. </li><li> Aggiungere 10 microlitri mastermix a ciascun pozzetto di una piastra PCR 96 ben. Aggiungere 2,5 ml di cDNA fatte in precedenza per il pozzetto contenente il Mastermix. Assicurati di impostare reazioni PCR in triplicato per ogni campione. </li><li> Dopo aver completato l&#39;aggiunta di mastermix e cDNA, coprire la piastra PCR utilizzando un foglio adesivo ottico per sigillare i pozzetti. Spin brevemente la piastra per 5 minuti a 500 xg in una centrifuga da tavolo per risolvere tutto il liquido sul fondo del pozzo. </li><li> Caricare la piastra PCR su una macchina di RT-PCR pre-programmato. Utilizzare i parametri PCR di cui alla tabella 1. </li><li> Analisi dei dati: Utilizzare i valori C t dall&#39;uscita qPCR per ulteriori calcoli. Insieme con il gene di prova, impostare reazioni PCR per i geni di controllo interno, 18S rRNA (garantire parità di ingresso) e β-actina (controllo negativo). Calcola modifiche piega secondari di ΔΔCt 37. </li></ol>

Gli autori non hanno divulgazioni.

Dopo il lavoro di riferimento per Benabid et al. Utilizzando la stimolazione cerebrale profonda per il trattamento di malattia di Parkinson e tremore essenziale, la tecnica chirurgica DBS è stata studiata con molto interesse negli ultimi dieci anni per il trattamento di molti disturbi neurologici 6,10,43. Studi DBS rivolti varie regioni neuro-anatomica del circuito cerebrale sono attualmente svolte da molti gruppi per affrontare le principali malattie neuronali e sono in varie fasi di sperimentazione...

La storia dietro lo sviluppo di stimolazione cerebrale profonda come tecnica neurochirurgica risale al 1870, quando è stata esplorata la possibilità di stimolare elettricamente il circuito cerebrale 2. L&#39;uso della stimolazione ad alta frequenza cronica come trattamento per disturbi neuronali iniziato nel 1960 3. Successivamente nel 1990 con l&#39;avvento di impiantazione cronica DBS elettrodi 4-6, il numero di disturbi neuronali che sono stati trattati con DBS continuato ad aumentare. Stimolazione cerebrale profonda è stato utilizzato negli Stati Uniti come trattamento per il tremore essenziale 6. Oggi l&#39;intervento è ampiamente utilizzato per il trattamento di disturbi neuronali che sono attualmente incurabili dall&#39;intervento farmacologico. DBS è attualmente utilizzato per il trattamento di disturbi del movimento del morbo di Parkinson e distonia 7-9. Alzheimer tipo di demenza, la malattia, l&#39;epilessia, il dolore e le malattie neuropsichiatriche come la depressione di Huntington, OCD, Tourette7; s sindrome e la dipendenza sono alcune delle condizioni suscettibili di trattamento con DBS 10-12. Mentre la chirurgia DBS è approvato dalla FDA per il trattamento del morbo di Parkinson, distonia e tremore essenziale, l&#39;utilizzo di DBS per il trattamento di altre condizioni di cui sopra sono in varie fasi di laboratorio e studi clinici che offrono molte promesse ai pazienti 13,14. Clinicamente, la chirurgia DBS viene eseguita in due fasi. La prima fase consiste chirurgicamente posizionamento degli elettrodi DBS nella posizione anatomica mirata utilizzando una combinazione di posizionamento radiologica, CT, MRI e letture di microelettrodi per una maggiore precisione. La seconda fase prevede l&#39;impianto di un generatore di impulsi nella parte superiore del torace del paziente e l&#39;estensione installazione conduce dal cuoio capelluto al generatore di impulsi. Sulla base della condizione neurologica, diversi schemi di programmazione per il generatore di impulsi sono stati standardizzati e vengono utilizzati per fornire la tensione desiderata. Il vol finaletage viene raggiunta in modo graduale in modo da ricevere la migliore risposta clinica con la minima tensione 15. Tuttavia, nei nostri studi, a differenza degli impianti croniche DBS usato in clinica, per semplicità, si è fatto ricorso a studiare una stimolazione ad alta frequenza di una volta (per 1 ora) nei nostri modelli animali. Parte della ricerca del nostro gruppo si concentra sullo studio l&#39;uso della chirurgia DBS per il trattamento-refrattaria epilessia. Approcci chirurgici stereotassica con stimolazione ad alta frequenza è stato esplorato da molti altri come un&#39;opzione efficace per il trattamento dell&#39;epilessia medico-refrattario che costituisce circa il 30% di tutti i casi di epilessia 10,16,17. Stimolazione cerebellare mira la superficie corticale, nonché i nuclei profondi del cervelletto sono stati utilizzati in passato come bersagli per il trattamento dell&#39;epilessia 10,18,19. Inoltre, la stimolazione ippocampo è stato anche provato ma con risultati alterni 20,21. Alcuni degli altri indagatiObiettivi DBS per l&#39;epilessia comprendono la corteccia cerebrale, nel talamo, nucleo subtalamico e nervo vago 8. Tuttavia, a seguito dei risultati di diversi studi negli ultimi anni, il nucleo del talamo anteriore (ATN) è emerso come la destinazione più comune DBS per il trattamento dell&#39;epilessia 10,22. Sulla base delle conoscenze su circuiti neuroanatomici e risultati di modelli animali, molti studi si sono concentrati sull&#39;effetto terapeutico di stimolazione cerebrale profonda del ATN nel trattamento dell&#39;epilessia 23-26. La ATN è parte del circuito limbico e si trova nella regione del cervello che colpisce frequenza delle crisi. Gli studi di Hamani et al., Hanno testato l&#39;efficacia di ATN-DBS in un pilocarpina indotta modello di epilessia e ha scoperto che la stimolazione bilaterale ATN latenze per convulsioni pilocarpina indotta e lo stato epilettico prolungato 24. Inoltre, la stimolazione ad alta frequenza della ATN è stato trovato per ridurre la frequenza delle crisi in un pentylenetetrazol (PTZ) il modello di epilepsy 25,27-29. Lee et al., Hanno riportato una riduzione media della frequenza delle crisi di circa il 75% al momento della stimolazione cerebrale profonda cronica della ATN nel trattamento epilessia parziale refrattaria 30. Un recente studio clinico sul trattamento dell&#39;epilessia refrattaria ha mostrato risultati promettenti dopo l&#39;intervento chirurgico DBS rivolte al nucleo talamico anteriore (ATN) 22. Uno studio clinico multicentrico randomizzato con 110 pazienti sottoposti a DBS bilaterale del ATN per il trattamento dell&#39;epilessia refrattaria (prova SANTE) ha indicato una diminuzione della frequenza delle crisi di circa il 40% 31. I risultati di questo studio ha anche accennato a un effetto anti-epilettico ottimale ritardo osservato 2-3 mesi dopo l&#39;intervento chirurgico. Ulteriori studi di Toda et al., Corroborate con questi risultati in cui hanno dimostrato neurogenesi accadendo in un momento post successivo DBS (giorni 3-5) in modelli animali 1. Inoltre, Encinas et al., Hanno riportato neurogena hippocampalsis nel topo adulto giro dentato dopo stimolazione ad alta frequenza della ATN 32. Precedenti studi hanno segnalato in calo 33-35 neurogenesi ippocampale in alcuni casi di epilessia come l&#39;epilessia del lobo temporale cronica e un&#39;associazione con deficit di apprendimento, disturbi della memoria e spontanee crisi motorie ricorrenti. Inoltre, c&#39;è stata una riduzione in fattori neurali progenitrici di cellule staminali, come FGF2 e IGF-1 nell&#39;ippocampo cronicamente epilettico in modelli animali 33. Considerando questo, strategie di intervento come la DBS che mostrano un aumento della neurogenesi nel giro dentato sono strade interessanti per la ricerca. Questi risultati ci hanno incoraggiato a esplorare ulteriormente in profondità nel meccanismo sottostante trattamento neurogenesi post-DBS per l&#39;epilessia. Abbiamo preso di mira il ATN sia unilateralmente (dati non riportati) e bilaterale (in risultati rappresentativi) e visto elevati neurotrofina (BDNF) espressione del giro dentato di ratto. Il nostro corrente ipotesi è che l&#39;espressione di BDNF avvia una cascata di espressione genica che culmina in neurogenesi che traduce l&#39;effetto anti-epilettico di chirurgia DBS. In questo articolo presentiamo i nostri metodi per la chirurgia DBS mira la ATN nei ratti seguita da analisi di espressione genica come approccio interessante per studiare il meccanismo alla base dei benefici di DBS.

<table><tbody><tr>Chirurgia <td></td><td></td><td></td>di <td>stimolazione cerebrale profonda</td></tr><tr><td>Telaio stereotassico</td><td>Kopf Instruments</td><td>Modello 900</td><td></td></tr><tr><td>Drill&nbsp;</td><td>Dremmel</td><td>7700, 7.2 V</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>BD</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Patterson Veterinario</td><td>07-803-6637</td><td>Tabella III Sostanza controllata, approvvigionamento, uso e conservazione secondo le regole istituzionali</td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Patterson Veterinario</td><td>07-808-1947</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Patterson Veterinario</td><td>07-850-2280</td><td>Tabella III Sostanza controllata, approvvigionamento, uso e stoccaggio secondo le regole istituzionali</td></tr><tr><td>Graffette chirurgiche</td><td>ConMed Corporation</td><td>8035</td><td></td></tr><tr><td>Suture (3-0)&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-3333</td><td></td></tr><tr><td>Siringa (1 ml, 29 1/2 G)</td><td>BD</td><td>329464</td><td>sterile, uso per la somministrazione di anestesia per via intraperitoneale</td></tr><tr><td>Siringa (3 ml, 25 G)</td><td>BD</td><td>309570</td><td>Sterile, uso per la somministrazione di analgesia per via sottocutanea</td></tr><tr><td>Aghi</td><td>BD</td><td>305761</td><td>Sterile, uso per rimuovere pezzi di osso rotti dai fori della bava</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Uso scientifico</td><td>S25309B</td><td>per la sterilizzazione generale&nbsp;</td></tr><tr><td>Lubrificante per gli occhi</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-898-350</td><td></td></tr><tr><td>Stimolatore</td><td>Medtronic</td><td>Modello 3628</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodi DBS</td><td>Rhodes Medical Instruments, CA</td><td>SNEX100x-100 mm</td> Gli <td>elettrodi sono in platino, concentrici e bipolari</td></tr><tr><td>Betadine (Povidone-Iodio)&nbsp;</td><td>PDI</td><td>S23125</td><td>Bastoncini monouso, da utilizzare per sterilizzare il cuoio capelluto prima di eseguire l'incisione.</td></tr><tr><td>&nbsp; Dissezione cerebrale e isolamento</td><td></td><td></td><td></td>del tessuto ippocampale</tr><tr><td>Microscopia elettronica acrilica per roditori</td><td>Microscopia cerebrale Scienze</td><td>175-300 www.emsdiasum.com</td><td></td></tr><tr><td>lama di rasoio</td><td>V W R</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a ghigliottina</td><td>Clauss</td><td>18039</td><td>Per la decapitazione, assicurarsi che queste forbici siano mantenute in condizioni pulite e funzionanti</td></tr><tr><td></td><td>Forbici Codman Classic</td><td>34-4098</td><td>Utilizzare per rimuovere il cervello dal cranio</td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>72957-06</td><td>Utilizzare per rimuovere il cervello dal cranio e per la manipolazione durante la dissezione</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato&nbsp;</td><td>Boston Bioproducts</td><td>BM-220</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Estrazione dell'RNA e preparazione del cDNA Tri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagente</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td>Utilizzare sempre in una cappa aspirante e indossare occhiali protettivi durante la manipolazione; evitare il contatto con la pelle</td></tr><tr><td>Siringa (3 ml, 25 G)</td><td>BD</td><td>309570</td><td>Utilizzare per l'omogeneizzazione tissutale</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td>Utilizzare sempre in una cappa aspirante e indossare occhiali protettivi durante la manipolazione; evitare il contatto con pelle</td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416-1</td><td></td></tr><tr><td>Glicogeno</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1906</td><td></td></tr><tr><td>Kit di sintesi del primo filamento Superscript</td><td>Invitrogen</td><td>11904-018</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga da tavolo</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; PCR quantitativa</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit PCR verde</td><td>SYBR Qiagen</td><td>204143</td><td></td></tr> Piastre PCR <tr><td>10668051</td><td></td><td>Oligo personalizzate</td><td></td></tr><tr><td>(96 pozzetti)</td><td>Denville Scientific</td><td>C18080-10</td><td></td></tr><tr><td>Fogli adesivi ottici</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB1170</td><td></td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30538-02</td><td></td></tr><tr><td>Real Macchina per PCR a tempo</td><td>Applied Biosystems</td><td>7500</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi delle variazioni di espressione genica nel rat hippocampus dopo stimolazione cerebrale profonda del nucleo anteriore talamiche

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Stimolazione cerebrale profonda (DBS) Chirurgia, mira diverse regioni del cervello, come i gangli basali, talamo, e le regioni subtalamico, è un trattamento efficace per diversi disturbi del movimento che non sono riusciti a rispondere ai farmaci. I recenti progressi nel campo della chirurgia DBS ha iniziato a estendere l&#39;applicazione di questa tecnica chirurgica per altre condizioni diverse come obesità patologica, depressione e disturbo ossessivo compulsivo. Nonostante queste indicazioni in espansione, si sa ancora poco sui meccanismi fisiologici di base che facilitano gli effetti benefici della chirurgia DBS. Un approccio a questa domanda è quello di eseguire analisi di espressione genica nei neuroni che ricevono la stimolazione elettrica. Precedenti studi hanno dimostrato che la neurogenesi nel giro dentato di ratto è suscitato in DBS mira del nucleo anteriore del talamo 1. Chirurgia DBS mira il ATN è ampiamente utilizzato per il trattamento di epilessia refrattaria. E &#39;quindi di molto interest per noi per esplorare i cambiamenti trascrizionali indotte stimolando elettricamente il ATN. In questo manoscritto, descriviamo le nostre metodologie per la chirurgia DBS stereotassica guidata mira la ATN in adulti ratti maschi Wistar. Discutiamo anche i passi successivi per la dissezione dei tessuti, l&#39;isolamento di RNA, la preparazione cDNA e RT-PCR quantitativa per misurare i cambiamenti di espressione genica. Questo metodo può essere applicato e modificate per stimolare i gangli basali e altre regioni del cervello comunemente clinicamente mirata. Lo studio dell&#39;espressione genica descritto qui assume un approccio del gene bersaglio candidato per scoprire attori molecolari che potrebbero essere dirigere il meccanismo di DBS.

Le figure 1A e 1B mostrano la relativa espressione di BDNF e GABRD rispetto al gene di controllo β-actina. BDNF, una neurotrofina è spesso associata a effetti neuroprotettivi in molte malattie neuronali 38-41. È quindi interessante analizzare il profilo di espressione di BDNF in risposta alla stimolazione della ATN che produce benefici terapeutici per pazienti epilettici. Nella figura 1A che mostra il profilo di espressione genica del BDNF attraverso i punti ...

Il meccanismo alla base degli effetti terapeutici della chirurgia di Stimolazione Cerebrale Profonda (DBS) deve essere studiato. I metodi presentati in questo manoscritto descrivono un approccio sperimentale per esaminare gli eventi cellulari innescati dalla DBS analizzando il profilo di espressione genica di geni candidati che possono facilitare la neurogenesi dopo l'intervento chirurgico di DBS.

Analisi delle variazioni di espressione genica nel Rat Hippocampus Dopo stimolazione cerebrale profonda del nucleo anteriore talamiche

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire una stimolazione cerebrale profonda del nucleo talamico anteriore e studiare le variazioni nell'espressione genica nell'ippocampo del ratto. Questo viene realizzato anestetizzando innanzitutto l'animale. Successivamente, l'animale viene preparato per l'intervento chirurgico.Viene praticata un'incisione nel cuoio capelluto ed esposta la scatola cranica. Successivamente, nella posizione corretta rispetto al bgma, vengono realizzati i fori trapanati. Gli elettrodi per la stimolazione cerebrale profonda vengono inseriti e viene effettuata la stimolazione.Infine, l'animale viene soppresso e il cervello viene dissezionato. Per rimuovere l'ippocampo, il tessuto viene processato per l'estrazione di RNA e viene effettuata la preparazione di cDNA seguita da QPCR. In definitiva, i risultati dimostrano che la stimolazione cerebrale profonda influenza l'espressione genica nell'ippocampo del ratto.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nella chirurgia della stimolazione cerebrale profonda, ad esempio quali sono i meccanismi molecolari alla base dell'effetto terapeutico della stimolazione cerebrale profonda? Le implicazioni di questa tecnica riguardano non solo la terapia dell'epilessia, ma anche altre condizioni neuronali come il morbo di Parkinson, la malattia di Alzheimer e la distonia. Poiché la stimolazione cerebrale profonda sta emergendo come un approccio chirurgico per il trattamento di numerose patologie neuronali, per prepararsi all'intervento chirurgico utilizzare garze sterili per coprire il piano di lavoro e assicurarsi che sia disponibile un contenitore per lo smaltimento dei rifiuti biologici.Pesare il ratto e calcolare la dose di anestetico in base al protocollo descritto nel testo; montare e fissare due elettrodi sul supporto degli elettrodi di un telaio chirurgico stereotassico e, con l'aiuto di un microscopio, controllare le punte degli elettrodi per verificarne l'allineamento corretto. Fissare gli elettrodi a tre millimetri di distanza l'uno dall'altro, avendo cura di non far toccare la punta degli elettrodi su superfici dure. Iniettare la ketamina xilazina.Somministrare per via intraperitoneale all'animale e verificare che l'animale abbia raggiunto un piano chirurgico di anestesia controllando il riflesso alla pressione sulle dita dei piedi, la frequenza respiratoria e la profondità e regolarità della respirazione. Fissare e posizionare l'animale sul telaio stereotassico. Applicare un lubrificante oculare sugli occhi dell'animale per proteggerli dall'eccessiva disidratazione e disinfettare il cuoio capelluto con tre passaggi alternati, ciascuno con Betadine e alcol o soluzione salina sterile.Posizionare l'animale su un tappetino riscaldante a circolazione di acqua calda o utilizzare lampade riscaldanti per mantenere la temperatura corporea dell'animale a un livello ottimale. In base all'atlante del cervello del ratto di Paxinos e Watson, utilizzare le seguenti coordinate stereotassiche per puntare il nucleo talamico anteriore: anteriore-posteriore -1,6 millimetri, mediale-laterale 1,5 millimetri e dorso-ventrale 5,2 millimetri.Successivamente, effettuare un'incisione nel cuoio capelluto in senso sagittale per esporre il cranio. Utilizzando una coppia di retrattori, fissare il cuoio capelluto inciso per esporre il cranio. Quindi, con tamponi sterili imbevuti di etanolo, pulire la zona incisa per evidenziare chiaramente le suture. Individuare il bgma e utilizzare un pennarello nero per segnare la posizione guida dei fori di trapanazione.Effettuare altri due segni a circa 1,5 millimetri di distanza lateralmente su entrambi i lati dalla sutura sagittale e a 1,6 millimetri posteriormente rispetto alla sutura coronale. Per realizzare i due fori di trapanazione, utilizzare etanolo per disinfettare la punta del trapano.Utilizzando un trapano tenuto a un angolo di 45 gradi, praticare i fori a trapano alternando frequentemente tra i due fori per evitare un eccessivo riscaldamento al centro di ciascun foro. Continuare a trapanare fino a quando non viene esposta la dura. Utilizzando un ago con la punta piegata a forma di L, rimuovere eventuali frammenti ossei rotti che potrebbero ostacolare l'inserimento dell'elettrodo.Si presti attenzione a non danneggiare la dura madre sottostante e/o il tessuto cerebrale durante la rimozione dei frammenti ossei. Fissare l'assiemino a doppio elettrodo al manico rotante del telaio stereotassico e bloccare il manico a un angolo di 90 gradi. Utilizzando le regolazioni del telaio stereotassico, posizionare esattamente l'elettrodo sinistro sopra il bgma.Utilizzando gli aggiustamenti stereotassici per la posizione mediale. Il posizionamento laterale ha spostato con precisione l'elettrodo sinistro di 1,5 millimetri sul lato sinistro del bgma, in modo che ora ci siano due elettrodi perfettamente allineati lungo la sutura coronale, ma distanziati tra loro di 1,5 millimetri in senso mediale-laterale rispetto al bgma.Quindi, mediante gli aggiustamenti stereotassici antero-posteriori, spostare gli elettrodi di 1,6 millimetri in posizione posteriore rispetto alla sutura coronale. Successivamente, mediante gli aggiustamenti dorso-ventrali, abbassare gli elettrodi per verificare innanzitutto se i fori di trapanazione sono stati eseguiti nella posizione corretta, in modo che gli elettrodi possano essere inseriti agevolmente senza toccare i bordi irregolari dei fori. In caso affermativo, inserire gli elettrodi fino a una profondità di 5,2 millimetri dalla superficie del cranio.Collegare gli elettrodi tramite cavi a un stimolatore impostato a 130 hertz, 2,5 volt e larghezza dell'impulso di 90 microsecondi. Erogare una stimolazione ad alta frequenza per un periodo di tempo desiderato. Eseguire una stimolazione unilaterale o bilaterale.Al termine della stimolazione, rimuovere con attenzione gli elettrodi e suturare l'incisione con tre punti di sutura zero o punti metallici chirurgici sterili, somministrare buprenorfina per via sottocutanea e monitorare l'animale fino al ritorno a un'attività normale, quindi riportarlo nella struttura di alloggio. Posizionare il cervello su una matrice cerebrale in acrilico preraffreddata su ghiaccio utilizzando una lametta. Tagliare il cervello in senso coronale a circa sette-otto millimetri dal margine più anteriore del cervello.Eseguire un secondo taglio in modo preciso e posteriormente al primo taglio, in modo da poter rimuovere una sezione cerebrale di spessore approssimativamente di cinque millimetri. Trasferire la sezione cerebrale in una capsula di Petri contenente PBS ghiacciato utilizzando una lametta, dividere le due emisferiche e prestare attenzione a identificare quale sezione corrisponde rispettivamente ai lati sinistro e destro. Utilizzando pinzette fini e forbici, rimuovere con cura la porzione dell'ippocampo, congelare il tessuto su ghiaccio secco e conservarlo a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo per i successivi passaggi di RNA, eseguiti secondo il protocollo descritto qui; riportati sono i livelli di espressione relativi di BDNF rispetto al gene di controllo beta-actina nei diversi punti temporali indicati.Stimolazione post DBS. L'upregolazione del BDNF viene osservata immediatamente dopo l'intervento di DBS, insieme all'espressione massima rilevata a tre ore dalla stimolazione. Questa osservazione suggerisce che un'espressione potenziata di BDNF e la conseguente neuroprotezione potrebbero contribuire all'effetto terapeutico della DBS nei pazienti epilettici.Questo pannello illustra l'espressione del recettore GABA, G-A-B-R-D, che mostra un'espressione aumentata negli animali stimolati rispetto ai controlli non stimolati a tre ore dal DBS. Considerando che gli agonisti del GABA sono utilizzati come efficaci inibitori delle crisi epilettiche, è interessante osservare un'espressione aumentata di G-A-B-R-D dopo il DBS, il che suggerisce un possibile ruolo del GABA nell'effetto anti-epilettico del DBS. A seguito di questa procedura.Possono essere eseguiti altri metodi come il western blot, l'immunoprecipitazione della cromatina e molti altri saggi molecolari standard. Questo consente di rispondere a domande relative alle variazioni nell'espressione proteica, alle modifiche post-traduzionali, al legame dei fattori di trascrizione su specifiche regioni promoter di geni, ecc. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un intervento chirurgico di stimolazione cerebrale profonda nei ratti.Isolare il tessuto ippocampale e analizzarlo per rilevare variazioni nell'espressione genica.

analysis-gene-expression-changes-rat-hippocampus-after-deep-brain

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Fonte: Casquero-Veiga, M. et al. Tomografia a emissione di positroni in vivo per rivelare modelli di attività indotti dalla stimolazione cerebrale profonda nei ratti. J. Vis. Exp. (2022).Questo video mostra gli effetti metabolici della stimolazione cerebrale profonda (DBS) utilizzando l'imaging FDG-PET in un modello di ratto. Descrive i passaggi coinvolti nella somministrazione di FDG, nell'applicazione della DBS e nell'imaging PET/CT per mappare le regioni cerebrali con attività metabolica...

Valutazione della neuromodulazione metabolica indotta dalla stimolazione cerebrale acuta profonda nei ratti utilizzando FDG-PET in vivo

Fonte: Selvakumar, T., et al., Analisi dei cambiamenti dell'espressione genica nell'ippocampo del ratto dopo la stimolazione cerebrale profonda del nucleo talamico anteriore. J. Vis. Exp. (2015)Questo video mostra la procedura per l'impianto di elettrodi nel cervello di ratto per applicare la stimolazione cerebrale profonda (DBS), che modula l'attività neuronale e migliora la comunicazione con l'ippocampo, supportando la sopravvivenza neuronale e la neurogenesi.

Effetti della stimolazione cerebrale profonda sull'attività neuronale dell'ippocampo in un modello di ratto

Questo video mostra il rilevamento della sintesi dell'RNA del recettore della serotonina utilizzando sonde oligonucleotidiche nel tessuto cerebrale di ratto affetto da sindrome serotoninergica. Il protocollo include il pretrattamento tissutale, l'ibridazione della sonda e il rilevamento enzimatico per visualizzare e quantificare l'espressione dell'RNA del recettore della serotonina al microscopio.

Ibridazione in situ mediante sonde oligonucleotidiche per studiare l'espressione dell'RNA in sezioni cerebrali di ratto

Ci viene descritto come utilizzare la cattura microdissezione laser (LCM) per ottenere popolazioni arricchite di neuroni ippocampali o neuroni singoli da sezioni congelate di cervello di ratto feriti per la successiva analisi di espressione genica mediante real time PCR quantitativa e / o dell'intero genoma microarray.

Laser Microdissezione Cattura di popolazioni Arricchito di neuroni singoli neuroni o per analisi di espressione genica dopo trauma cranico

Questo protocollo descrive un metodo standard per la simultanea risonanza magnetica funzionale e la stimolazione cerebrale profonda nei roditori. L'uso combinato di questi strumenti sperimentali consente l'esplorazione di attività downstream globale in risposta alla stimolazione elettrica a qualsiasi bersaglio cervello.

La stimolazione cerebrale profonda con simultanea fMRI in Roditori

Viene descritto un metodo per impiantare elettrodi nel nucleo subtalamico (STN) dei ratti. Una migliore localizzazione dell'STN è stata ottenuta utilizzando un sistema di microregistrazione. Inoltre, viene presentato un set-up di stimolazione caratterizzato da connessioni di lunga durata tra la testa dell'animale e lo stimolatore.

Microelettrodo guidata impianto di elettrodi nel subtalamico Nucleo di Ratti per lungo termine stimolazione cerebrale profonda

La stimolazione cerebrale profonda (DBS) è un'opzione di trattamento efficace per il morbo di Parkinson. Abbiamo stabilito un disegno di studio per lo screening di nuovi paradigmi di stimolazione nei ratti. Il protocollo descrive l'uso del test delle scale e del test del cilindro per la valutazione dell'esito motorio nei ratti emiparkinsoniani trattati con DBS.

Un nuovo approccio per valutare il risultato del motore di cerebrale profonda effetti di stimolazione nel ratto Hemiparkinsonian: Scala e cilindro di prova

Abbiamo applicato la stimolazione magnetica transcranica ripetitiva (rTMS) all'emisfero unilaterale del cervello di ratto, posizionando una bobina a forma di 8 da 25 mm 1 cm lateralmente al vertice sulla linea biauricolare e angolando la bobina di 45°. Per rTMS è stato utilizzato un sistema di raffreddamento ad acqua interno per più di 20 minuti.

Repetitive stimolazione magnetica transcranica al unilaterale emisfero del cervello di ratto

Questo protocollo viene illustrato come impostare un metodo affidabile di HFS in topi. Neuroni nel giro dentato dell'ippocampo sono stimolati elettricamente da HFS direttamente e indirettamente in vivo. Attività neuronale e induzione di segnali molecolari sono esaminate dal c-fos e macchiatura immunofluorescente Notch1, rispettivamente; neurogenesi è quantificata mediante analisi di etichettatura della bromodeossiuridina.

Un metodo invasivo per l'attivazione della circonvoluzione dentata del Mouse dalla stimolazione ad alta frequenza

La stimolazione transcranica corrente continua (tDCS) è una tecnica terapeutica proposta per il trattamento di malattie psichiatriche. Un modello animale è essenziale per comprendere le specifiche alterazioni biologiche evocate da TDC. Questo protocollo descrive un modello di topo tDCS che utilizza un elettrodo cronicamente impiantato.

Stimolazione transcranica corrente continua (tDCS) in topi

Descriviamo un metodo sperimentale preclinico per valutare la neuromodulazione metabolica indotta dalla stimolazione cerebrale profonda acuta con FDG-PET in vivo . Questo manoscritto comprende tutte le fasi sperimentali, dalla chirurgia stereotassica all'applicazione del trattamento di stimolazione e all'acquisizione, elaborazione e analisi di immagini PET.

In vivo Tomografia ad emissione di positroni per rivelare i modelli di attività indotti dalla stimolazione cerebrale profonda nei ratti

Scopri come eseguire la stimolazione cerebrale profonda del nucleo anteriore talamico nel ratto e analizzare le variazioni di espressione genica nell'ippocampo. Questo metodo consente di studiare i meccanismi molecolari alla base degli effetti terapeutici della DBS.

Analisi delle variazioni di espressione genica nel Rat Hippocampus Dopo stimolazione cerebrale profonda del nucleo anteriore talamiche (Video) | JoVE Journal

Analisi delle variazioni di espressione genica nel Rat Hippocampus Dopo stimolazione cerebrale profonda del nucleo anteriore talamiche

Esplora altri video