Automated quantificazione di cellule ematopoietiche - Interazioni cellule stromali in istologici Immagini di Undecalcified Bone
8 aprile 2015
Viene presentata una strategia per analizzare quantitativamente i dati istologici nel midollo osseo. La microscopia confocale di cellule marcate in fluorescenza in sezioni di tessuto produce immagini bidimensionali, che vengono analizzate automaticamente. Le analisi di co-localizzazione di diversi tipi di cellule vengono confrontate con i dati provenienti da immagini simulate, fornendo informazioni quantitative sulle interazioni cellulari.
L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare le associazioni tra specifici sottoinsiemi cellulari nel midollo osseo. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo sezioni istologiche crioconservate dai tumori del femore del topo. Nel secondo passaggio, le sezioni vengono colorate per l'analisi in immunofluorescenza e vengono acquisite immagini al microscopio confocale.
Le immagini vengono quindi analizzate in modo digitale. In definitiva, le posizioni dei diversi tipi cellulari possono essere simulate per calcolare le velocità e la frequenza di contatto tra le specifiche cellule immunologiche di interesse e il loro microambiente. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando stavamo analizzando nicchie microambientali per cellule plasmatiche a lunga vita nel midollo osseo, e abbiamo riscontrato la necessità di un metodo per quantificare in modo univoco le associazioni cellulari all'interno del tessuto midollare.
RA Maya mostrerà la procedura per eseguire la criosuzione di ossa femorali da un topo adulto. Prima, impostare la temperatura del campione e della lama su -24 gradi Celsius in un microtomo standard dotato di lama per tessuti duri. Dopo un'acclimatazione di 15 minuti.
Fissare un blocco di campione al supporto metallico per campioni utilizzando un mezzo di inclusione criogenico e regolare l'orientamento del blocco secondo necessità. Tagliare il campione fino a quando l'osso non è completamente esposto e il midollo risulta visibile. Successivamente, regolare lo spessore delle sezioni a sette micron.
Successivamente, fissare un pezzo di nastro adesivo Kawamoto con il lato adesivo verso l'alto su un blocco campione utilizzando una spatola di legno rivestita di pelle morbida. Tagliare il campione con pinzette. Ruotare il nastro in modo che il taglio si trovi sul lato superiore. Trasferire quindi il nastro su un vetrino da microscopio in vetro.
Fissare il nastro al vetrino con del nastro adesivo quando è stata raccolta l'ultima sezione. Lasciare asciugare i campioni per almeno 30 minuti e conservare i vetrini a meno 80 gradi Celsius. Due donne analizzano i campioni colorando le sezioni crioconservate scongelate secondo protocolli comuni di immunofluorescenza.
Assicurarsi di includere un colorante nucleare per visualizzare l'integrità del tessuto. Dopo aver colorato le sezioni, aggiungere una goccia di mezzo di montaggio per coprivetri a ogni campione, seguita da un coprivetri in vetro numero uno su un microscopio confocale a scansione laser. Selezionare l'obiettivo 20x e impostare un campo visivo di 708,15 per 708,15 micron.
Quindi acquisire i campioni uno alla volta a 2048 per 2048 pixel per immagine per mantenere i risultati confrontabili. Registrare le immagini in un canale per la visualizzazione delle strutture stromali, un canale per i nuclei e canali aggiuntivi per le cellule ematopoietiche di interesse, se necessario. Registrare le immagini utilizzando la media delle linee.
Catturare idealmente singole immagini adiacenti per coprire l'intera sezione femorale. Successivamente salvare le immagini in un formato file per immagini microscopiche. Quindi esportare un file JPEG per canale per ciascuna area acquisita e utilizzare uno strumento di analisi delle immagini per eseguire la quantificazione della segmentazione dell'immagine, l'analisi della colocalizzazione e dell'adiacenza prima di eseguire le simulazioni della cellula casuale.
Posizionamento sulle immagini del midollo osseo analizzate per ciascuna immagine da simulare. Posizionare i seguenti file in una singola cartella: i singoli file CSV forniti dallo strumento di contatto cellulare. I file JPEG originali del canale DPI e i file JPEG originali del canale stromale per eseguire simulazioni in serie sulle immagini provenienti da un singolo campione femorale, trasferendo tutti i file JPEG originali e i corrispondenti file CSV singoli in un'altra cartella già in questa fase.
Una volta assemblati tutti i file, avviare lo strumento di simulazione. Quindi selezionare la casella di caricamento automatico dei dati dell'immagine. Con questa opzione selezionata, i file CSV corrispondenti alle immagini analizzate vengono aperti automaticamente.
Successivamente, inserire il tag comune per i file CSV e il numero di set di immagini da utilizzare per la simulazione in modalità batch. Caricare quindi il file J peg generato dal canale S stroma con un nome di file che termina con tre per generare la maschera per il canale DPI. Selezionare la casella applica maschera e impostare la soglia per la conversione dell'immagine DPI in una maschera binaria a 10.
Selezionare le caselle "eight bit" e "dilate" e impostare il grado di dilatazione a cinque pixel. Quindi selezionare la casella "width erosion". Successivamente, inserire il valore desiderato per il raggio di vicinanza utilizzato per l'analisi delle immagini simulate e selezionare la casella "use OSU" per utilizzare l'algoritmo OSU per la rilevazione automatica delle strutture stromali delle cellule ematopoietiche.
Simulati come forme circolari. Misurare la distribuzione delle dimensioni cellulari dei tipi cellulari analizzati con qualsiasi software di analisi delle immagini che includa le appropriate funzioni di segmentazione degli oggetti e determinare la sigma per tutti i tipi ematopoietici a partire da queste misurazioni. Può essere determinata la soglia dimensionale cellulare, ovvero il diametro in pixel che descrive l'oggetto più piccolo ancora riconosciuto come cellula completa dallo strumento di analisi delle immagini.
Quindi inserire la soglia di dimensione delle cellule e il valore sigma in pixel per la simulazione della distribuzione della dimensione delle cellule per le cellule rosse, verdi e blu. Successivamente, nella scheda cellule e maschera, selezionare la casella di eliminazione per consentire al programma di scegliere una nuova posizione per una cellula se si sovrappone ad almeno un pixel all'interno di un'area vietata della maschera. Nella scheda esclusione cellule, selezionare anche la casella evita sovrapposizione cellule.
Quindi inserire la distanza minima consentita tra i centri di due cellule, espressa in pixel. Se l'overlap è definito dalla distanza minima tra il centro di una cellula e il centro di un'altra, impostare l'area massima di overlap al 100%. Successivamente, impostare lo strumento di simulazione su 1000 ripetizioni. Quindi selezionare la casella di salvataggio automatico per salvare le coordinate degli oggetti simulati per tutte le ripetizioni di ciascuna immagine del batch come file di testo.
Inserire anche un tag comune per i file salvati. Infine, fare clic su "run simulation" e determinare le frequenze medie di contatto e di vicinanza dei gruppi di 1000 immagini simulate corrispondenti a ciascuna immagine registrata. A tale scopo, dividere i conteggi medi di contatto e di vicinanza per il numero di cellule registrate per immagine e confrontare le frequenze con i risultati dell'analisi automatizzata di codistribuzione dell'immagine registrata.
In questa figura viene presentata un'analisi della localizzazione di eosinofili, cellule plasmatiche e cellule B all'interno del microambiente delle cellule stromali mediante midollo osseo chimera fluorescente. I file CSV generati dagli strumenti di contatto cellulare e di vicinanza contengono il numero di cellule e l'area totale per ciascuna popolazione cellulare in pixel, nonché i conteggi di contatto o di vicinanza. Prima di eseguire una simulazione del posizionamento cellulare casuale, è necessario determinare i parametri che descrivono la distribuzione della dimensione cellulare come distribuzione gaussiana; in questa simulazione, i valori relativi della sigma misurata per le tre popolazioni cellulari sono stati mantenuti.
Mentre i valori Sigma definiti in pixel sono stati impostati per corrispondere all'aspetto visivo delle cellule registrate al fine di definire le aree in cui le cellule possono essere posizionate, una maschera è stata generata dal canale DAPI. Un valore di 10 è stato quindi determinato come soglia di densità ottimale per la generazione delle immagini binarie. La rilevanza dei contatti tra le cellule plasmatiche, gli eosinofili o le cellule B con le cellule stromali è stata quindi verificata come previsto.
Queste analisi hanno rivelato tassi di contatto significativamente più elevati nelle immagini registrate rispetto alla simulazione per le cellule plasmatiche e le cellule B. Al contrario, non è stata osservata alcuna differenza evidente per il contatto tra eosinofili e cellule stromali. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in qualsiasi campo che richieda l'analisi della complessa struttura tissutale del midollo osseo, come l'immunologia, l'ematonologia, la patologia o la biologia delle cellule staminali.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per analizzare quantitativamente dati istologici nel midollo osseo mediante microscopia confocale. La tecnica prevede la colorazione di sezioni di tessuto e l'analisi digitale delle immagini risultanti per valutare le interazioni cellulari.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Istologia
Sfondo
- Comprendere le interazioni cellulari nel midollo osseo è fondamentale per la ricerca immunologica.
- Le sezioni crioistologiche vengono utilizzate per visualizzare i diversi tipi cellulari.
- La microscopia confocale consente un'analisi dettagliata delle cellule colorate.
- L'analisi quantitativa di queste interazioni può fornire informazioni sulle risposte immunitarie.
Scopo dello studio
- Quantificare le associazioni tra specifici sottoinsiemi cellulari nel midollo osseo.
- Sviluppare un metodo per quantificare in modo inequivocabile le associazioni cellulari.
- Simulare le posizioni cellulari al fine di calcolare le frequenze di contatto tra cellule immunologiche.
Metodi Utilizzati
- Prelevamento di sezioni crioistologiche da femori di topo.
- Colorazione delle sezioni per l'analisi immunofluorescente.
- Acquisizione di immagini confocali per l'analisi.
- Analisi digitale per determinare le interazioni cellulari e le associazioni con il microambiente.
Risultati principali
- Quantificazione riuscita delle associazioni cellulari nel midollo osseo.
- Identificazione dei tassi di contatto tra specifiche cellule immunologiche.
- Convalida del metodo mediante confronti con immagini simulate.
- Informazioni sui nicchi microambientali per le plasmacellule a lunga vita.
Conclusioni
- Il metodo sviluppato fornisce un approccio solido per analizzare le interazioni cellulari.
- Dati quantitativi possono migliorare la comprensione della dinamica delle cellule immunitarie.
- Questa tecnica può essere applicata a diversi studi che coinvolgono il midollo osseo e le risposte immunitarie.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La quantificazione della co-localizzazione cellulare nel midollo osseo affronta una sfida fondamentale nella ricerca in immunologia ed ematologia: distinguere vere associazioni biologiche dal posizionamento cellulare casuale. Questo metodo fornisce un'analisi quantitativa e riproducibile delle interazioni ematopoietiche-stromali, riducendo il bias dipendente dall'osservatore e migliorando l'affidabilità tra diversi osservatori. L'approccio supporta la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico nella scoperta preclinica, consentendo una valutazione basata sui dati della dinamica del microambiente cellulare.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche quantificando i contatti diretti tra cellule ematopoietiche e stromali in tessuti complessi.
- Valore operativo: Fornisce una misurazione oggettiva delle associazioni cellulari, riducendo la variabilità derivante dal conteggio manuale e migliorando la riproducibilità del saggio.
- Valore predittivo: Supporta la selezione di portafogli attraverso la distinzione tra associazioni cellulari preferenziali e co-localizzazione casuale, mediante simulazione statistica.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera output quantitativi standardizzati (frequenze di contatto e di vicinanza) per sottoinsiemi di cellule ematopoietiche all'interno del microambiente del midollo osseo.
- Valore operativo: Consente flussi di lavoro di acquisizione di immagini ad alta risoluzione e di analisi digitale compatibili con piattaforme di microscopia confocale.
- Scalabilità: Facilita l'elaborazione in batch di multiple sezioni femorali mediante strumenti di simulazione automatizzati per una generazione di dati costante.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega i dati sulle interazioni cellulari della fase di scoperta alla validazione preclinica caratterizzando le nicchie microambientali per le cellule plasmatiche a lunga vita e altri sottoinsiemi immunitari.
- De-risking meccanicistico: Utilizza strumenti di simulazione per verificare se la co-localizzazione osservata riflette una preferenza biologica piuttosto che un posizionamento casuale, rafforzando la fiducia sul bersaglio.
- Sistema rilevante per la patologia: Applicabile a studi di immunologia, ematologia, patologia e biologia delle cellule staminali in cui l'analisi del microambiente del midollo osseo è fondamentale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale della proteina bersaglio fino alla ricerca preclinica, sostenendo la verifica delle ipotesi e la riduzione del rischio biologico nelle interazioni tra cellule ematopoietiche e stromali.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi quantificando le associazioni cellulari e il contesto microambientale nei tessuti del midollo osseo.
- Screening: Permette la prontezza del saggio attraverso flussi di lavoro standardizzati di acquisizione delle immagini, segmentazione e quantificazione della codistribuzione.
- Analisi: Fornisce parametri quantitativi (frequenze di contatto, frequenze di vicinanza) e confronti statistici basati su simulazioni per valutare il significato biologico.
- Ricerca traslazionale: Collega le scoperte alla continuità preclinica caratterizzando nicchie cellulari rilevanti per la funzione e la persistenza delle cellule immunitarie.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile di analisi istologica quantitativa in diversi studi sul midollo osseo e modelli di malattia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi fornendo una quantificazione oggettiva, supportata da simulazioni, delle interazioni cellulari.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione attraverso protocolli automatizzati di analisi delle immagini e simulazioni in serie.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione riducendo l'ambiguità meccanicistica nei dati di associazione cellulare.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione adeguata al rischio degli obiettivi basata su interazioni microambientali validate quantitativamente.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'immunofluorescenza, nella microscopia confocale e nell'analisi digitale delle immagini per il rilevamento di cellule ematopoietiche e stromali.
- È dipendente dalla microscopia confocale a scansione laser con obiettivi adeguati e mediazione delle linee per un'acquisizione d'immagine comparabile.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo ai formati dei file di immagine, alla gestione dei dati in formato CSV e ai parametri degli strumenti di simulazione, al fine di ottenere risultati riproducibili.
- Comporta considerazioni di adattamento per diversi tipi cellulari e sezioni di tessuto, inclusi il valore limite per le dimensioni cellulari e la determinazione di sigma per una simulazione accurata.
- Limite pratico: l'accuratezza della simulazione dipende da una misurazione precisa della distribuzione delle dimensioni cellulari e dalla generazione della maschera a partire dal canale DAPI per la definizione della struttura stromale.
