Name: Automated quantificazione di cellule ematopoietiche - Interazioni cellule stromali in istologici Immagini di Undecalcified Bone (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Scopri come quantificare le associazioni tra sottopopolazioni cellulari nel midollo osseo utilizzando sezioni istologiche criogeniche di femore di topo, microscopia confocale e analisi digitale. Questo metodo fornisce dati quantitativi sulle dinamiche delle cellule immunitarie.

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Ringraziamo Andreas Radbruch per le discussioni di valore. Siamo grati a Sabine Gruczek, Patrick Thiemann e Manuela Ohde per l&#39;assistenza con la cura degli animali e Robert Günther per un&#39;eccellente assistenza tecnica. Ringraziamo i nostri valutatori qualificati Laura Oehme, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, Katrin Roth, Firenze Pache e Katharina Horn per la valutazione dei campioni istologici e Randy Lindquist per revisione del manoscritto. Ringraziamo J. e N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, Arizona, Stati Uniti d&#39;America per gli anticorpi MBP-specifici. Questo lavoro è stato sostenuto dalla DFG HA5354 / 4-1, da Jimi-una sovvenzione nucleo DFG rete impianto per la microscopia intravitale e TRR130 / TP17 e DFG PER 2165 (HA5354 / 6-1) per AEHSZ è stata sostenuta dalla Max Planck Internazionale Scuola per le Malattie Infettive e Immunologia (IMPRS-IDI), Berlino.

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dai comitati statali appropriate per il benessere degli animali (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlino) e sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e le disposizioni vigenti (licenza esperimento animale G0194 / 11). 1. Generazione di topi fluorescente Midollo Osseo chimerici NOTA: La generazione di midollo osseo fluorescente topi chimerici per visualizzare le cellule stromali del midollo osseo viene eseguita come descritto prima delle 9. <ol><li> Inizia il trattamento di Del-Cre x topi ROSA-tdRFP (topi che esprimono la proteina tandem rosso fluorescente (tdRFP) ubiquitariamente 11-13) per prepararli per irraggiamento. In alternativa, utilizzare qualsiasi altro ceppo con l&#39;espressione ubiquitaria di proteina fluorescente. Somministrare 1 mg / ml di neomicina e 1 mg / ml di vitamine (A, D3, E, C) attraverso l&#39;acqua potabile due giorni prima irradiazione. </li><li> Irradiare topi due volte con 3,8 grigio con un Cesio-137 gamma-irradiatore wisottile un intervallo di 3 ore. Per questo, posizionare topi in una gabbia torta irraggiamento adatto per il rispettivo irradiatore. NOTA: Per l&#39;irradiazione dei topi, il nostro Istituto non richiede anestesia. Seguire le politiche istituzionali locali riguardanti l&#39;anestesia per l&#39;irradiazione. Trattare gli animali con 5 mg / kg per via sottocutanea di carprofen (sc) al giorno dopo l&#39;irradiazione, se ci sono segni di dolore. </li><li> Il giorno successivo, ricostituire topi da una iniezione endovenosa di 3 x 10 6 cellule di midollo osseo ottenuti da ossa lunghe di C57BL / 6 topi donatori nel buffer di trasferimento 9. Mantenere i topi su neomicina e vitamine per un massimo di 2 settimane e monitorare il loro benessere e il peso durante questo periodo. Attendere almeno 4 settimane per consentire la ricostituzione del sistema immunitario prima di iniziare i trattamenti sperimentali specifici (ad esempio, l&#39;immunizzazione) 9. </li><li> Sacrificio topi e metterli su una tavola di dissezione, sterilizzare le gambe con il 70% di etanolo. Euthanize topi in conformità con le politiche istituzionali locali. Il nostro Istituto svolge dislocazione cervicale. </li><li> Utilizzare pinze e forbici per rimuovere la pelle dalle cosce. Rimuovere il tessuto muscolare per esporre l&#39;osso femorale. Luxate l&#39;osso femorale dal dell&#39;anca e del ginocchio con pinze e forbici. Fare attenzione a non rompere o tagliare l&#39;osso. </li><li> Rimuovere accuratamente restanti grandi pezzi di tessuto muscolare e la cartilagine dall&#39;osso con le forbici. Rimuovere restante tessuto muscolare strofinando l&#39;osso con la carta velina di laboratorio. Raccogliere le ossa pulite in una capsula di Petri con tampone fosfato (PBS). </li><li> Fissare intere ossa femorali in 4% paraformaldeide (PFA, microscopia elettronica-grade) per 4 - 6 ore. </li><li> Eliminare PFA e incubare le ossa nel 10% di saccarosio in PBS O / N. Il giorno successivo, incubare le ossa nel 20% di saccarosio O / N. Il giorno dopo, incubare le ossa di 30% di saccarosio O / N. </li></ol> 2. criosezionamento of Bones NOTA: Dopo 16-24 ore nel 30% di saccarosio, congelare le ossa e cryosection loro secondo il metodo del nastro di Kawamoto 14,15. <ol><li> Preparare un grande bicchiere (2,000 ml volume) con ghiaccio secco e acetone (circa 2: 1 rapporto in volume, ad esempio, 400 ml di ghiaccio secco e 200 ml di acetone) sotto una cappa aspirante. Mettere un piccolo bicchiere (150-250 ml di volume) con esano interna (30 - 50 ml circa). Attendere la miscela si raffreddi (circa 10 min, fino a visualizzare gelo all&#39;esterno della grande becher). </li><li> Riempire ¾ della cryomold marcato con Super Cryoembedding Medium (SCEM); posizionare con cura le ossa dentro fino a quando non sono completamente immersi, facendo attenzione che non si tocchino i bordi dello stampo. Con grandi pinze tenere la cryomold nel becher con il fondo dello stampo sfiora la superficie del esano. <ol><li> Sia i bordi esterni del congelamento SCEM (indicato da opacità, questo richiede circa 15 sec). Poi rilasciare completamente lo stampo in esano e lasciarlo freEze 1 - 2 min. Estrarre il campione congelato e avvolgere nel cellophane e poi un foglio di alluminio (per proteggere il campione dalla disidratazione e per evitare l&#39;esposizione alla luce). Conservare a -80 ° C fino criosezionamento. </li></ol></li><li> Per criosezionamento delle ossa femorali utilizzare uno standard di lame microtomo e microtomo per tessuti duri. </li><li> Impostare la temperatura del campione e la lama del microtomo a -24 ° C. Lasciate riposare il campione all&#39;interno del microtomo per circa 15 minuti prima del taglio. <ol><li> Fissare il blocco campione al porta-campioni di metallo con SCEM o la temperatura ottimale di taglio (OCT) medio. Regolare l&#39;orientamento del blocco se necessario. Tagliare il campione fino all&#39;osso è completamente aperta e il midollo è visibile. Regolare lo spessore della sezione di 7 micron (scartare la prima sezione). </li><li> Fissare un pezzo di nastro Kawamoto con la parte adesiva sulla parte superiore del blocco campione utilizzando una spatola di legno cervi rivestita in cuoio. Successivamente, tagliare il campione e ruotare il nastro in modo che la sezioneposizionato sul lato superiore. Trasferire il nastro di un vetrino con pinze. Fissare il nastro al vetro scorrevole con scotch. </li></ol></li><li> Lasciate sezioni asciutti per almeno 30 minuti e conservare a -80 ° C fino al loro utilizzo. Conservare vetrini non colorati e montati in scatole di diapositive di plastica con distanziali tra singole diapositive in modo da evitare che si attaccano insieme. Macchiato e montati diapositive possono essere conservati fino a una settimana in cartone cartelle di diapositive a 4 ° C. </li></ol> 3. Immagine Collection <ol><li> Scongelare e criosezioni macchia secondo protocolli di immunofluorescenza comuni 9. Includere una macchia nucleare, ad esempio, 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo dicloridrato (DAPI) per visualizzare l&#39;integrità dei tessuti. NOTA: Mordente, per esempio, per RFP di visualizzare le cellule stromali (anti-RFP-biotina anticorpi e streptavidina Alexa Fluor 555), eosinofili macchia con topo anti-principale proteina di base (MBP) e anticorpi anti-rat-Alexa Fluor 647 anticorpi cellule B,con il ratto anti-B220-Alexa Fluor 594 anticorpi e PC con la luce anti-κ catena fluoresceina-iso-tiocianato (FITC) e anticorpi catena-FITC luce anti-λ1 (dettagli della procedura di colorazione sono descritti in 9). </li><li> Montare sezioni colorate: mettere una goccia di Fluoromount sulla sezione e poi coprire con un # 1 copertura in vetro antiscivolo, evitando accuratamente la formazione di bolle d&#39;aria. Successivamente, effettuare microscopio confocale a scansione laser con uno strumento equipaggiato con linee laser adatti per la colorazione. </li><li> Al fine di registrare le immagini per l&#39;analisi automatizzata di co-localizzazione di cellule ematopoietiche del midollo osseo con cellule stromali utilizzando lo strumento Wimasis, applicare le seguenti impostazioni: <ol><li> Utilizzare una lente obiettivo 20X e un campo visivo di 708,15 x 708,15 micron. Per l&#39;analisi automatizzata, mantenere le dimensioni di tutte le immagini coerenti a 2.048 x 2.048 pixel (px) per mantenere i risultati comparabili. </li><li> Registra un canale per strutture stromali (es, </em&gt; 561 linea laser nm), un canale per nuclei (ad esempio, DAPI, 405 nm) e canali aggiuntivi per le cellule ematopoietiche di interesse (ad esempio, 3 canali, 488/594/633 nm per eosinofili, cellule B e PC). </li><li> Registrare le immagini utilizzando la linea media di 4 16. Idealmente, coprono l&#39;intera sezione femorale prendendo immagini adiacenti singoli. In alternativa, scattare foto non adiacenti provenienti da varie regioni del midollo osseo (diafisario e epifisi). NOTA: Fare attenzione a non produrre sovrapposizioni tra immagini adiacenti (per evitare analisi ripetute delle cellule nelle zone di sovrapposizione). </li></ol></li><li> Salvare le immagini in un formato di file immagine al microscopio. Controllare e, se necessario, regolare il contrasto per tutti i canali del software immagine viewer / analisi. </li><li> Export 3 file .jpg per file immagine: un file .jpg per il canale DAPI (formato rosso / verde / blu (RGB), falso codice colore in giallo), un file .jpg per il canale stroma (scala di grigi) e uno .jpg file contenentei canali di cellule ematopoietiche (3 canali al massimo, formato RGB, ad esempio, FITC (PC, falsi colori: verde) / Alexa Fluor 594 (cellule B, falsi colori: blu) / Alexa Fluor 647 (eosinofili, falsi colori: rosso)) . </li></ol> 4. Automated Image Analysis <ol><li> Utilizzare uno strumento di analisi di immagine per eseguire la segmentazione di immagini, la quantificazione di co-localizzazione e dintorni analisi (vedi Discussione). </li><li> Se si utilizzano gli strumenti Wimasis, procedere come segue: <ol><li> Caricare i set di 3 file .jpg per immagine con lo stesso nome del file seguito da una sottolineatura e da un numero che indica il tipo di immagine. </li><li> Utilizzare _1 per il file jpg con le cellule ematopoietiche, _2 per il file .jpg per il canale DAPI, _3 per il file .jpg per il canale stroma. Per esempio: Image1_1.jpg (cellule ematopoietiche), Image1_2.jpg (canale DAPI), e Image1_3.jpg (canale stroma). Carica le immagini attraverso il conto cliente. </li><li> Per contatti cell quantificazionescegliere lo strumento di contatto delle cellule cliccando sul rispettivo campo. Per vicinanze cellule quantificazione, scegliere lo strumento vicinanze cellulare e inserire il raggio vicinanze preferito in micron (che si misura dai bordi delle celle). </li><li> Scarica i risultati. NOTA: I risultati sono forniti come file jpg mostrano le cellule ematopoietiche e il canale stroma i confini degli oggetti rilevati evidenziati, così come file .csv singoli contenenti le misurazioni per ogni immagine, in aggiunta a una sintesi .csv che contiene i dati relativi a tutte le immagini caricate. </li></ol></li><li> Dal contatto misurazioni determinano la frequenza di cellule ematopoietiche (rosso, verde, blu) o cellule a contatto con le cellule stromali, o le frequenze di globuli rossi, verdi, blu o contattando gli altri tipi di cellule ematopoietiche (un esempio è mostrato nella Rappresentante dei risultati , Figura 4). Per determinare le frequenze, dividere i dati di contatto conteggi per immagine dala cella totale conta per immagine. <ol><li> Per gli esperimenti con singoli topi, riassumere i conteggi totali contatto di tutte le immagini da singoli topi e dividere la somma della conta delle cellule totali di tutte le immagini. </li></ol></li><li> Dalle misurazioni vicinanze, determinare la frequenza di cellule rosse, verde o blu all&#39;interno della distanza selezionata da cellule stromali e / o le frequenze di globuli rossi, verdi o blu in prossimità preferito agli altri tipi di cellule ematopoietiche come descritto al punto 4.3 ( vedi anche Rappresentante dei risultati, Figura 4). </li></ol> 5. Simulazione di Random Midollo Osseo Posizionamento <ol><li> Prima di eseguire le simulazioni di posizionamento cellulare casuale sul midollo osseo immagini istologiche analizzate, preparare i seguenti file in anticipo: i file .csv singoli forniti dallo strumento di contatto delle cellule, i file .jpg originali per il canale DAPI ei file .jpg originali per il canale stromale. </li><li> Per effettuaresimulazioni lotti su una serie di immagini (ad esempio, tutte le immagini di una sezione femorale), raccolgono tutti i file originali .jpg (_1, _2 e _3) ei relativi file .csv singoli in una cartella. NOTA: Lo strumento di simulazione per il posizionamento di cellule di midollo osseo casuale è disponibile su richiesta. </li><li> Avviare lo strumento di simulazione, selezionare la casella &quot;Auto-load dati di immagine&quot;. NOTA: Il programma leggerà i conteggi cellulari e dimensione media delle cellule dal file .csv automaticamente. Questi valori vengono visualizzati nelle caselle per &quot;numero Cell&quot; e &quot;size cellulare AVG&quot; (Figura 5A). </li><li> Inserisci il tag comune per i file .csv, cioè, il fattore comune nei loro nomi. Inserire il numero di set di immagini che dovrebbero essere utilizzati per la simulazione in modalità batch. </li><li> Caricare il file .jpg generato dal canale stroma (con il nome del file che termina _3). </li><li> Immettere le impostazioni per la generazione la maschera dal canale DAPI: <ol><li> Seleziona la casella &quot;? Applicare maschera &quot;Impostare la soglia per convertire l&#39;immagine DAPI in una maschera binaria a 10 (gamma 0 - 255). </li><li> Seleziona la casella &quot;8-bit?&quot; Seleziona la casella &quot;Dilatare?&quot; E impostare il grado di dilatazione di 5 px. Seleziona la casella &quot;w / erosione?&quot;. </li><li> Inserire il valore desiderato per il raggio vicinanze (raggio quartiere) utilizzati per l&#39;analisi delle immagini simulate. Per un&#39;immagine di 708,15 x 708,15 micron con una dimensione di 2.048 x 2.048 px (pixel scala xy: 0,346 micron), 29 px corrisponde a 10 micron. </li></ol></li><li> Casella &quot;Usa Otsu?&quot;, Per usare l&#39;algoritmo di Otsu 17 per il rilevamento automatico delle strutture stromali. NOTA: Questo è lo stesso algoritmo utilizzato dallo strumento di contatto e dintorni. Utilizzando lo stesso algoritmo di segmentazione di immagini in analisi automatizzata dell&#39;immagine registrata e l&#39;immagine simulata è cruciale per mantenere i dati comparabili. </li><li> Immettere le impostazioni per le cellule ematopoietiche, che are simulato come forme circolari. NOTA: I numeri di cellulari per i globuli rossi, verdi e blu sono direttamente caricate dal file .csv (vedi anche punto 5.6). <ol><li> Utilizzare lo strumento di simulazione per calcolare il diametro medio in px dei globuli rossi, verdi e blu. Determinare la superficie media di una singola cella, la superficie complessiva di ogni tipo di cellula nell&#39;immagine px diviso per il numero totale di cellule per immagine. Utilizzare l&#39;area media per calcolare il raggio del disco usando la formula. Raddoppiare la distanza per determinare il diametro medio. </li></ol></li><li> Misurare la distribuzione delle dimensioni delle cellule dei tipi di cellule analizzate con qualsiasi software di analisi delle immagini che include funzioni di segmentazione degli oggetti. Determinare σ per tutti i tipi di cellule ematopoietiche (18 e Figura 5B). NOTA: Poiché le distribuzioni dimensionali cella delle celle registrati non sono determinati dalla analisi di immagine automatica, utilizzare una distribuzione gaussiana come approssimazione delle distribuzioni reali. La larghezza di tegli curva di distribuzione è descritto da σ e può essere molto diverso per i vari tipi di cellule. (Per i dettagli, vedere la Figura 5B). <ol><li> Da queste misurazioni, determinare il &quot;dimensioni della cella cutoff&quot;: il diametro in px che descrive l&#39;oggetto più piccolo ancora riconosciuta come cella completo con lo strumento di analisi dell&#39;immagine. </li></ol></li><li> Immettere i parametri nelle rispettive caselle sull&#39;interfaccia utente grafica (Figura 5A). <ol><li> Inserire la dimensione della cella tagliato, cioè, la dimensione minima consentita celle nella simulazione, come diametro px. </li><li> Inserire σ in px per la simulazione della distribuzione delle dimensioni delle cellule per cellule rosse, verde e blu (dal punto 5.9). </li><li> Seleziona la casella &quot;Elimina&quot; nella sottosezione &quot;Celle in Maschera&quot;. Con questa impostazione, il programma sceglierà una nuova posizione per una cella se si sovrappone con almeno un pixel con una zona no-go della maschera. Seleziona la casella &quot;evitare sovrapposizioni cellulare? ̶1; nella sottosezione &quot;esclusione Cell&quot;. </li><li> Inserire la distanza minima consentita tra i centri di due cellule in px. NOTA: La distanza minima deve essere determinato dalle immagini registrate. Erroneamente distanze minime misurate porteranno a / risultati artificiali parziali per il confronto delle immagini registrate e simulati. </li><li> Impostare la massima area di sovrapposizione al 100% se la sovrapposizione è definita dalla distanza minima da centro a centro. </li><li> Impostare lo strumento di simulazione a 1.000 ripetizioni. </li><li> Selezionare la casella &quot;cellule di salvataggio automatico?&quot; Per salvare le coordinate degli oggetti simulati per tutte le ripetizioni di ogni immagine del lotto come file .rect (in formato testo). Selezionare la casella &quot;immagini di salvataggio automatico?&quot; Per salvare un file TIFF per ciascuna immagine simulata. Immettere un tag comune per i file salvati. NOTA: Il &quot;? Cellule di salvataggio automatico&quot; opzione riduce la simulazione in esecuzione il tempo e la dimensione complessiva dei dati, rispetto a quando si salva l&#39;attuale simulato imaGES. I file .rect memorizzare le coordinate delle celle simulati come rettangoli e possono quindi essere convertiti in immagini simulate se necessario. </li></ol></li><li> Avviare la simulazione facendo clic su &quot;Esegui simulazione&quot;. NOTA: Lo strumento di simulazione genera automaticamente un file .csv per 1.000 simulazioni di ogni immagine, compresi i conti di contatto medi e conta vicinanze di globuli rossi, verdi e blu con globuli rossi, verdi, blu, e stromali per ogni serie di simulazioni ripetute . Inoltre, per tutti questi valori, vengono forniti medie dei 1.000 simulazioni con deviazione standard (STD) e l&#39;errore standard della media (SEM). </li><li> Determinare la media frequenza di contatto e le frequenze vicinanze di un gruppo di 1.000 immagini simulate. Per questo, dividere il contatto media e conta vicinanze del conteggio delle cellule registrate per immagine. Confrontare le frequenze ai risultati dell&#39;analisi co-localizzazione automatizzata dell&#39;immagine registrata. </li><li> Applicare STATI appropriateMetodi stical funzione dell&#39;analisi del 19 (per la figura 7, abbiamo usato un Wilcoxon a due code firmato rank test). </li></ol>

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Juan Escribano Navarro è affiliato con Wimasis GmbH, Monaco di Baviera, Germania. Gli altri autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Nonostante i progressi in moderni metodi di imaging ottico, l&#39;analisi dei dati istologica è ancora spesso ostacolato dalla mancanza di strumenti di quantificazione ei modi, o da analisi parziali che si concentrano su una piccola area di interesse. L&#39;approccio sinergico qui presentato combina analisi dell&#39;immagine che copre l&#39;intera regione di midollo osseo, la segmentazione automatica e rilevamento di oggetti di diversi tipi di cellule ematopoietiche e stromali, analisi co-localizzazione, ed infine uno s...

A causa di recenti sviluppi tecnologici rapidi microscopio, tra cui imaging ottico, l&#39;analisi di cellule nel contesto di tutto il tessuto è diventato sempre più accessibile per immunologi. La caratterizzazione di singole cellule in sospensione rappresenta un metodo prezioso e indispensabile per comprendere la funzione cellulare e molecolare. Tuttavia, l&#39;analisi delle cellule all&#39;interno del loro (micro) ambiente -anatomical è essenziale per la comprensione delle interazioni tra i vari tipi di cellule che collaborano in processi complessi come lo sviluppo delle risposte immunitarie. Mentre è relativamente facile per microscopisti di ottenere informazioni qualitative da immagini, rimane una sfida per quantificare questi dati, in parte a causa del fatto che i metodi di analisi in questo campo sono in ritardo rispetto a quanto è possibile in acquisizione dell&#39;immagine. Molti ricercatori si affidano ancora a conteggio manuale delle cellule nelle loro immagini istologici che richiede tempo,introducendo così una polarizzazione tra i diversi valutatori e ostacolare la replica da parte di altri gruppi. Spesso, una immagine rappresentativa viene scelto per sottolineare una dichiarazione sulla posizione di cellulare o di co-localizzazione in una pubblicazione, il che rende difficile per il lettore a giudicare la rilevanza statistica di un tale evento. Insieme con il fatto che l&#39;intero contenuto informazioni di dati dell&#39;immagine è raramente sfruttata, questo sottolinea la necessità di un approccio più imparziale, veloce e completo per analizzare immagini istologiche. Il midollo osseo è un tessuto complesso, che assume importanti funzioni vitali come organo di ematopoiesi in vertebrati adulti. Oltre ad essere il luogo di nascita di cellule ematopoietiche 1,2 e giocando un ruolo importante nello sviluppo dei linfociti B 3, agisce anche come un luogo in cui vengono avviate le reazioni immunitarie 4 e supporta, le cellule B mature ricircolo 5. Inoltre, il suo ruolo nel mantenere imemoria mmunological è diventato sempre più apprezzato negli ultimi dieci anni, come sono stati trovati per soggiornarvi 6-9 diversi tipi di cellule che costituiscono la memoria immunitaria. Il rapporto tra l&#39;architettura tissutale complesso del midollo osseo e delle sue funzioni rimangono ancora sfuggente. A differenza di organi linfoidi secondari, che sono organizzati in macro-comparti, come le zone delle cellule T e B, il midollo osseo non ha un chiaro macro-compartimentazione. Finora compartimenti distinti nel midollo osseo sono definite dalla loro vicinanza al corticale ossea o vascolare. L&#39;importanza delle varie popolazioni cellulari stromali residenti nel midollo osseo per un certo numero di processi come le cellule staminali di supporto, sviluppo di cellule B o manutenzione di popolazioni di cellule immunitarie memoria (quali cellule plasmatiche lunga durata (PC), CD4 + e CD8 + cellule T di memoria) indica chiaramente che vi sia un certo grado di micro-compartimentalizzazione nel midollo osseo. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Queste osservazioni hanno portato al concetto di nicchie microanatomical distinte, che sono specializzati in alcune funzionalità (staminali mantenimento delle cellule, lo sviluppo delle cellule B in varie fasi, e il mantenimento della memoria immunologica) nel midollo osseo. Anche se sembra esserci una certa eterogeneità tra le nicchie che servono diverse funzioni, alcuni dei fattori prodotte dalle cellule stromali, quali CXC-chemochina legante 12 (CXCL12) o interleuchina 7 (IL-7), sono componenti essenziali per molte di queste nicchie 10. La visualizzazione e la caratterizzazione delle cellule stromali del midollo osseo è difficile a causa delle loro caratteristiche morfologiche con lunghi, sottili estensioni dendritiche formando una rete attraverso il midollo osseo, e la mancanza di marcatori appropriati per discriminare sottopopolazioni stromali. Non è ancora chiaro in quale misura queste nicchie condividono caratteristiche comuni rispetto alla loro compositio cellulare e molecolaren, e quali elementi rendono una certa nicchia unico. Oltre alle cellule stromali, tipi di cellule ematopoietiche hanno dimostrato di giocare un ruolo cruciale fornendo alcuni segnali almeno per alcune delle nicchie. Chiaramente, la complessità della composizione nicchia richiede loro analisi in situ, ed è diventato sempre più importante per immunologi e hematologists per ingrandire osseo microarchitettura ossea, ad esempio, analizzando le relazioni spaziali tra i suoi componenti cellulari. Qui, una strategia per quantificare cellulari co-localizzazione e di vicinato relazioni nel midollo osseo in modo automatizzato e imparziale è presentato. Un flusso di lavoro dettagliate inclusa la generazione di topi chimerici, l&#39;ospitare cellule fluorescenti stromali e cellule ematopoietiche non fluorescenti, preparazione di sezioni istologiche di ossa undecalcified, acquisizione di immagini confocali coprono l&#39;intero osso, così come l&#39;analisi delle immagini automatizzata di c cellulareo-localizzazione e la convalida / discriminazione dal posizionamento casuale per uno strumento di simulazione è fornito (Figura 8).

<table><tbody><tr><td>Neomicina</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma</a></td><td>N6386 SIGMA</td><td>Sale triidrato di neomicina solfato, codice di pericolo UE: GHS08</td></tr><tr><td>Ursovit AD3EC</td><td>Serumwerke Bernburg</td><td></td><td>1 ml contiene: 50.000 I.E. palmitato di retinile, 5.000 I.E. colocalciferolo, 30 mg acetato di tocoferile, 100 mg acido ascorbico, 1 mg acido sorbico, 200 mg olio di ricino poliossi 35, 0,5 mg galato di propile</td></tr><tr><td>Tampone di trasferimento (100 ml PBS, 1 ml HEPES 1 M, 50 U/ml penicillina/streptomicina)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma</a></td><td>P4333, H3375</td><td></td></tr><tr><td>Emicarattere 4-idrossi-3-nitrofenilacetil coniugato alla gamma globulina di pollo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gamma globulina di pollo (CGG) 100 mg</td><td><a href="http://www.rockland-inc.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Rockland</a></td><td>D602-0100</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di paraformaldeide al 20% (grado EM)</td><td>Science Services</td><td>15713</td><td>Codici di pericolo UE: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08</td></tr><tr><td>Saccarosio D(+)</td><td><a href="http://www.carlroth.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Carl Roth</a></td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Ghiaccio secco</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>179124 SIGMA-ALDRICH</td><td>Codici di pericolo UE: GHS02, GHS07</td></tr><tr><td>Esano</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>208752 SIGMA-ALDRICH</td><td>Codici di pericolo UE: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09</td></tr><tr><td>Stampi criogenici Tissue-Tek (standard)</td><td><a href="http://www.sakuraus.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sakura</a></td><td>4557</td><td>25 x 20 x 5 mm</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T.</td><td><a href="http://www.sakuraus.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sakura</a></td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di inclusione SCEM di Kawamoto</td><td><a href="http://section-lab.jp/index.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Section-Lab, JP</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit di preparazione per criosezioni di Kawamoto&amp;nbsp;</td><td><a href="http://section-lab.jp/index.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Section-Lab, JP</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryofilm di Kawamoto tipo 2C(9)</td><td><a href="http://section-lab.jp/index.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Section-Lab, JP</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lama per microtomo MX35 premier plus, profilo basso</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thermo Scientific</a></td><td>3052835</td><td>L x L: 80 x 8 mm (31,5 x 3,13"), spessore: 0,25 mm (0,01")</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonale coniugato con biotina, anti-RFP da coniglio</td><td><a href="http://www.rockland-inc.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Rockland</a></td><td>600-406-379</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina Alexa Fluor 555</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>S-32355</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-MBP da ratto</td><td>J. e N. Lee</td><td></td><td>disponibile da: J. e N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ, USA, clone MT-14.7</td></tr><tr><td>Secondario anti-ratto da capra coniugato con Alexa Fluor 647</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-B220 da ratto - Alexa Fluor 594</td><td></td><td></td><td>prodotto e coniugato in sede (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 da Life Technologies</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-catena leggera l1 da topo - FITC</td><td></td><td></td><td>prodotto e coniugato in sede (DRFZ), clone LS136</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-catena leggera k da ratto - FITC</td><td></td><td></td><td>prodotto e coniugato in sede (DRFZ), clone 187.1</td></tr><tr><td>DAPI (4&amp;prime;,6-diamidino-2-fenilindolo cloridrato)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma</a></td><td>D9542 SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio fluorescente</td><td><a href="http://www.dako.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> DAKO</a></td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Coprioggetti (24 x 24 x 0,13-0,16 mm)</td><td><a href="http://www.carlroth.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Carl Roth</a></td><td>H875.2</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini Superfrost (75 x 25 mm)</td><td><a href="http://www.vwr.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> VWR</a></td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale a scansione laser</td><td></td><td></td><td>dotato di linee laser a 405, 488, 561, 594, 633 nm e obiettivo ad aria con NA 20X/0,8. Abbiamo utilizzato un Zeiss LSM710 e il software Zen 2010 Versione 6.0.</td></tr><tr><td>Strumenti automatizzati di analisi delle immagini per il midollo osseo</td><td><a href="http://www.wimasis.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Wimasis, Monaco</a></td><td></td><td>Lo strumento per il contatto cellulare e lo strumento per la vicinanza cellulare saranno messi a disposizione da Wimasis su richiesta.</td></tr><tr><td>Runtime VC2012</td><td>Microsoft</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=30679" target="_blank"&gt;download gratuito&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Strumento di simulazione per il posizionamento casuale delle cellule</td><td></td><td></td><td>disponibile da noi, su richiesta</td></tr><tr><td>Software di analisi delle immagini con funzioni di segmentazione</td><td></td><td></td><td>Abbiamo utilizzato Volocity (Perkin Elmer) per misurare le distribuzioni dimensionali delle cellule ematopoietiche nel midollo osseo (&lt;strong&gt;Figura 5&lt;/strong&gt;). Alternative sono Definiens Image Analysis (Definiens) o Cell Profiler (&lt;a href="http://www.cellprofiler.org" target="_blank"&gt;download gratuito&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>Software di analisi delle immagini Fiji&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;a href="http://fiji.sc/Fiji" target="_blank"&gt;download gratuito&lt;/a&gt;. Fiji è stato utilizzato da valutatori esperti per il conteggio manuale delle cellule (&lt;strong&gt;Figura 3&lt;/strong&gt;).</td></tr></tbody></table>

automated quantificazione di cellule ematopoietiche - interazioni cellule stromali in istologici immagini di undecalcified bone

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Microscopia confocale è il metodo di scelta per l&#39;analisi della localizzazione di molteplici tipi di cellule all&#39;interno dei tessuti complessi come il midollo osseo. Tuttavia, l&#39;analisi e la quantificazione di localizzazione cellulare è difficile, come in molti casi si basa sul conteggio manuale, portando così il rischio di introdurre una polarizzazione rater-dipendente e riducendo l&#39;affidabilità interrater. Inoltre, è spesso difficile giudicare se la co-localizzazione tra due celle risultati di posizionamento casuale, soprattutto quando tipi cellulari differiscono fortemente la frequenza del loro verificarsi. Qui, viene introdotto un metodo per la quantificazione obiettiva cellulari co-localizzazione nel midollo osseo. Il protocollo descrive la preparazione del campione utilizzato per ottenere sezioni istologiche di intere murini ossa lunghe, compreso il midollo osseo, così come il protocollo di colorazione e l&#39;acquisizione di immagini ad alta risoluzione. Un flusso di lavoro di analisi che va dal riconoscimento di ematopoietiche e non-hemattipi di cellule opoietic in 2 dimensioni immagini midollo (2D) ossa alla quantificazione dei contatti diretti tra queste cellule è presentato. Questo include anche un&#39;analisi quartiere, per ottenere informazioni sul microambiente cellulare che circonda un certo tipo di cellula. Per valutare se la co-localizzazione di due tipi di cellule è il semplice risultato del posizionamento cella casuale o riflette associazioni preferenziali tra le cellule, uno strumento di simulazione che è adatto per testare questa ipotesi nel caso di ematopoietiche e cellule stromali, è utilizzato. Questo approccio non è limitato al midollo osseo, e può essere estesa ad altri tessuti per consentire riproducibili, analisi quantitativa dei dati istologici.

Taglio criosezioni di osso undecalcified con il metodo del nastro Kawamoto permette l&#39;osso intero da tagliare come sezione intatta, con midollo osseo della regione endosseo ancora attaccato all&#39;osso mineralizzato, sia nella diafisi nonché nelle zone epifisarie con la loro alta densità trabecolare ossea (Figura 1). Colorazione nucleare delle sezioni rivela che anche se piccole crepe nel preparato non possono essere completamente evitati, la struttura delle sinusoidi e arterie e la rete reticolare...

Viene presentata una strategia per analizzare quantitativamente i dati istologici nel midollo osseo. La microscopia confocale di cellule marcate in fluorescenza in sezioni di tessuto produce immagini bidimensionali, che vengono analizzate automaticamente. Le analisi di co-localizzazione di diversi tipi di cellule vengono confrontate con i dati provenienti da immagini simulate, fornendo informazioni quantitative sulle interazioni cellulari.

Automated quantificazione di cellule ematopoietiche - Interazioni cellule stromali in istologici Immagini di Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare le associazioni tra specifici sottoinsiemi cellulari nel midollo osseo. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo sezioni istologiche crioconservate dai tumori del femore del topo. Nel secondo passaggio, le sezioni vengono colorate per l'analisi in immunofluorescenza e vengono acquisite immagini al microscopio confocale.Le immagini vengono quindi analizzate in modo digitale. In definitiva, le posizioni dei diversi tipi cellulari possono essere simulate per calcolare le velocità e la frequenza di contatto tra le specifiche cellule immunologiche di interesse e il loro microambiente. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando stavamo analizzando nicchie microambientali per cellule plasmatiche a lunga vita nel midollo osseo, e abbiamo riscontrato la necessità di un metodo per quantificare in modo univoco le associazioni cellulari all'interno del tessuto midollare.RA Maya mostrerà la procedura per eseguire la criosuzione di ossa femorali da un topo adulto. Prima, impostare la temperatura del campione e della lama su -24 gradi Celsius in un microtomo standard dotato di lama per tessuti duri. Dopo un'acclimatazione di 15 minuti.Fissare un blocco di campione al supporto metallico per campioni utilizzando un mezzo di inclusione criogenico e regolare l'orientamento del blocco secondo necessità. Tagliare il campione fino a quando l'osso non è completamente esposto e il midollo risulta visibile. Successivamente, regolare lo spessore delle sezioni a sette micron.Successivamente, fissare un pezzo di nastro adesivo Kawamoto con il lato adesivo verso l'alto su un blocco campione utilizzando una spatola di legno rivestita di pelle morbida. Tagliare il campione con pinzette. Ruotare il nastro in modo che il taglio si trovi sul lato superiore. Trasferire quindi il nastro su un vetrino da microscopio in vetro.Fissare il nastro al vetrino con del nastro adesivo quando è stata raccolta l'ultima sezione. Lasciare asciugare i campioni per almeno 30 minuti e conservare i vetrini a meno 80 gradi Celsius. Due donne analizzano i campioni colorando le sezioni crioconservate scongelate secondo protocolli comuni di immunofluorescenza.Assicurarsi di includere un colorante nucleare per visualizzare l'integrità del tessuto. Dopo aver colorato le sezioni, aggiungere una goccia di mezzo di montaggio per coprivetri a ogni campione, seguita da un coprivetri in vetro numero uno su un microscopio confocale a scansione laser. Selezionare l'obiettivo 20x e impostare un campo visivo di 708,15 per 708,15 micron.Quindi acquisire i campioni uno alla volta a 2048 per 2048 pixel per immagine per mantenere i risultati confrontabili. Registrare le immagini in un canale per la visualizzazione delle strutture stromali, un canale per i nuclei e canali aggiuntivi per le cellule ematopoietiche di interesse, se necessario. Registrare le immagini utilizzando la media delle linee.Catturare idealmente singole immagini adiacenti per coprire l'intera sezione femorale. Successivamente salvare le immagini in un formato file per immagini microscopiche. Quindi esportare un file JPEG per canale per ciascuna area acquisita e utilizzare uno strumento di analisi delle immagini per eseguire la quantificazione della segmentazione dell'immagine, l'analisi della colocalizzazione e dell'adiacenza prima di eseguire le simulazioni della cellula casuale.Posizionamento sulle immagini del midollo osseo analizzate per ciascuna immagine da simulare. Posizionare i seguenti file in una singola cartella: i singoli file CSV forniti dallo strumento di contatto cellulare. I file JPEG originali del canale DPI e i file JPEG originali del canale stromale per eseguire simulazioni in serie sulle immagini provenienti da un singolo campione femorale, trasferendo tutti i file JPEG originali e i corrispondenti file CSV singoli in un'altra cartella già in questa fase.Una volta assemblati tutti i file, avviare lo strumento di simulazione. Quindi selezionare la casella di caricamento automatico dei dati dell'immagine. Con questa opzione selezionata, i file CSV corrispondenti alle immagini analizzate vengono aperti automaticamente.Successivamente, inserire il tag comune per i file CSV e il numero di set di immagini da utilizzare per la simulazione in modalità batch. Caricare quindi il file J peg generato dal canale S stroma con un nome di file che termina con tre per generare la maschera per il canale DPI. Selezionare la casella applica maschera e impostare la soglia per la conversione dell'immagine DPI in una maschera binaria a 10.Selezionare le caselle "eight bit" e "dilate" e impostare il grado di dilatazione a cinque pixel. Quindi selezionare la casella "width erosion". Successivamente, inserire il valore desiderato per il raggio di vicinanza utilizzato per l'analisi delle immagini simulate e selezionare la casella "use OSU" per utilizzare l'algoritmo OSU per la rilevazione automatica delle strutture stromali delle cellule ematopoietiche.Simulati come forme circolari. Misurare la distribuzione delle dimensioni cellulari dei tipi cellulari analizzati con qualsiasi software di analisi delle immagini che includa le appropriate funzioni di segmentazione degli oggetti e determinare la sigma per tutti i tipi ematopoietici a partire da queste misurazioni. Può essere determinata la soglia dimensionale cellulare, ovvero il diametro in pixel che descrive l'oggetto più piccolo ancora riconosciuto come cellula completa dallo strumento di analisi delle immagini.Quindi inserire la soglia di dimensione delle cellule e il valore sigma in pixel per la simulazione della distribuzione della dimensione delle cellule per le cellule rosse, verdi e blu. Successivamente, nella scheda cellule e maschera, selezionare la casella di eliminazione per consentire al programma di scegliere una nuova posizione per una cellula se si sovrappone ad almeno un pixel all'interno di un'area vietata della maschera. Nella scheda esclusione cellule, selezionare anche la casella evita sovrapposizione cellule.Quindi inserire la distanza minima consentita tra i centri di due cellule, espressa in pixel. Se l'overlap è definito dalla distanza minima tra il centro di una cellula e il centro di un'altra, impostare l'area massima di overlap al 100%. Successivamente, impostare lo strumento di simulazione su 1000 ripetizioni. Quindi selezionare la casella di salvataggio automatico per salvare le coordinate degli oggetti simulati per tutte le ripetizioni di ciascuna immagine del batch come file di testo.Inserire anche un tag comune per i file salvati. Infine, fare clic su "run simulation" e determinare le frequenze medie di contatto e di vicinanza dei gruppi di 1000 immagini simulate corrispondenti a ciascuna immagine registrata. A tale scopo, dividere i conteggi medi di contatto e di vicinanza per il numero di cellule registrate per immagine e confrontare le frequenze con i risultati dell'analisi automatizzata di codistribuzione dell'immagine registrata.In questa figura viene presentata un'analisi della localizzazione di eosinofili, cellule plasmatiche e cellule B all'interno del microambiente delle cellule stromali mediante midollo osseo chimera fluorescente. I file CSV generati dagli strumenti di contatto cellulare e di vicinanza contengono il numero di cellule e l'area totale per ciascuna popolazione cellulare in pixel, nonché i conteggi di contatto o di vicinanza. Prima di eseguire una simulazione del posizionamento cellulare casuale, è necessario determinare i parametri che descrivono la distribuzione della dimensione cellulare come distribuzione gaussiana; in questa simulazione, i valori relativi della sigma misurata per le tre popolazioni cellulari sono stati mantenuti.Mentre i valori Sigma definiti in pixel sono stati impostati per corrispondere all'aspetto visivo delle cellule registrate al fine di definire le aree in cui le cellule possono essere posizionate, una maschera è stata generata dal canale DAPI. Un valore di 10 è stato quindi determinato come soglia di densità ottimale per la generazione delle immagini binarie. La rilevanza dei contatti tra le cellule plasmatiche, gli eosinofili o le cellule B con le cellule stromali è stata quindi verificata come previsto.Queste analisi hanno rivelato tassi di contatto significativamente più elevati nelle immagini registrate rispetto alla simulazione per le cellule plasmatiche e le cellule B. Al contrario, non è stata osservata alcuna differenza evidente per il contatto tra eosinofili e cellule stromali. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in qualsiasi campo che richieda l'analisi della complessa struttura tissutale del midollo osseo, come l'immunologia, l'ematonologia, la patologia o la biologia delle cellule staminali.

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