Automated quantificazione di cellule ematopoietiche - Interazioni cellule stromali in istologici Immagini di Undecalcified Bone

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare le associazioni tra specifici sottogruppi di cellule nel midollo osseo. Ciò si ottiene raccogliendo prima sezioni criogeniche istologiche da tumori di femori di topo. Nella seconda fase, le sezioni vengono colorate per l'analisi in immunofluorescenza e vengono acquisite immagini confocali.

Le immagini vengono poi analizzate digitalmente. In definitiva, le posizioni dei diversi tipi di cellule possono essere simulate per calcolare i tassi e la frequenza di contatto tra le specifiche cellule immunologiche di interesse e il loro microambiente. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando stavamo analizzando nicchie microambientali per plasmacellule a lunga vita nel midollo osseo, ed eravamo alla ricerca di un metodo per quantificare in modo inequivocabile le associazioni cellulari all'interno del tessuto del midollo osseo.

RA Maya dimostrerà la procedura per te per crioaspirare le ossa femorali da un topo adulto. Innanzitutto, impostare la temperatura del campione e della lama di un microtomo standard dotato di una lama per tessuti duri a una temperatura negativa di 24 gradi Celsius. Dopo un acclimatamento di 15 minuti.

Fissare un blocco campione al portacampione in metallo con il mezzo di inclusione criogenico e regolare l'orientamento del blocco secondo necessità. Tagliare il campione fino a quando l'osso non è completamente aperto e il midollo è visibile. Quindi regolare lo spessore di una sezione a sette micron.

Quindi, fissa un pezzo di nastro adesivo kawamoto con il lato adesivo sulla parte superiore di un blocco di campioni usando una spatola di legno rivestita di pelle Cara Seziona il campione e usando una pinza. Girare il nastro in modo che la sezione sia posizionata sul lato superiore. Quindi trasferire il nastro su un vetrino da microscopio.

Fissare il nastro adesivo al vetrino con lo scotch quando l'ultima sezione è stata raccolta. Lasciare guidare i campioni per almeno 30 minuti e conservare i vetrini a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Due donne riprendono i campioni mentre colorano le sezioni criogeniche scongelate secondo i comuni protocolli di immunofluorescenza.

Assicurati di includere una colorazione nucleare per visualizzare l'integrità del tessuto. Dopo che le sezioni sono state colorate, aggiungere una goccia di montaggio a pavimento a ciascun campione, seguita da un vetrino di vetro numero uno su un microscopio confocale a scansione laser. Selezionare l'obiettivo 20x e impostare un campo visivo di 708 punti 15 per 708 punti 15 micron.

Quindi visualizza i campioni uno alla volta a 2048 x 2048 pixel per immagine per mantenere i risultati comparabili. Registrazione delle immagini in un canale per la visualizzazione delle strutture stromali, un canale per i nuclei e canali aggiuntivi per le cellule ematopoietiche di interesse, se necessario. Registrare le immagini utilizzando la media delle linee.

Idealmente cattura singole immagini adiacenti per coprire l'intera sezione femorale. Quindi salvare le immagini in un formato di file immagine per microscopia. Quindi esporta un file JPEG per canale per ogni area ripresa e utilizza uno strumento di analisi delle immagini per eseguire la quantificazione della segmentazione dell'immagine della colocalizzazione e l'analisi del vicinato prima di eseguire le simulazioni della cella casuale.

Posizionamento sulle immagini del midollo osseo analizzate per ogni immagine da simulare. Inserire i seguenti file in un'unica cartella, i singoli file CSV forniti dallo strumento di contatto cellulare. I file JPEG del canale DPI originale e i file JPEG del canale stromale originale per eseguire simulazioni batch sulla serie di immagini da un singolo campione femorale per trasferire tutti i file JPEG originali e i singoli file CSV corrispondenti in un'altra cartella in questo momento.

Quando tutti i file sono stati assemblati, avviare lo strumento di simulazione. Quindi seleziona la casella di caricamento automatico dei dati dell'immagine. Con questa opzione selezionata, i file CSV corrispondenti alle immagini analizzate vengono aperti automaticamente.

Quindi, inserisci il tag comune per i file CSV e il numero di set di immagini da utilizzare per la simulazione in modalità batch. Quindi caricare il file peg J generato dal canale S stroma con un nome file che termina con tre per generare la maschera per il canale DPI. Seleziona la casella Applica maschera e imposta la soglia per la conversione dell'immagine DPI in una maschera binaria su 10.

Seleziona le caselle a otto bit e dilatazione e imposta il grado di dilatazione su cinque pixel. Quindi seleziona la casella di erosione della larghezza. Quindi inserire il valore desiderato per il raggio di prossimità utilizzato per l'analisi delle immagini simulate e selezionare la casella usa OSU per utilizzare l'algoritmo OSU per il rilevamento automatico delle strutture stromali per le cellule ematopoietiche.

Simulato come forme circolari. Misura la distribuzione delle dimensioni dei tipi di cellule analizzati con qualsiasi software di analisi delle immagini che includa le funzioni di segmentazione degli oggetti appropriate e determina il sigma per tutti i tipi ematopoietici da queste misurazioni. È possibile determinare il cutoff della dimensione della cella, ovvero il diametro in pixel, che descrive l'oggetto più piccolo ancora riconosciuto come cella completa dallo strumento di analisi delle immagini.

Quindi inserisci il limite della dimensione della cella e il sigma in pixel per la simulazione della distribuzione delle dimensioni della cella per le celle rosse, verdi e blu. Successivamente, nella scheda celle e maschera, selezionare la casella di eliminazione per consentire al programma di scegliere una nuova posizione per una cella se si sovrappone ad almeno un pixel all'interno di un'area vietata della maschera. Nella scheda di esclusione delle celle, seleziona anche la casella Evita sovrapposizione celle.

Quindi inserisci la distanza minima consentita tra i centri di due celle in pixel. Se la sovrapposizione è definita dalla distanza minima dal centro di una cella al centro di un'altra, impostare l'area massima di sovrapposizione su 100%Quindi impostare lo strumento di simulazione su 1000 ripetizioni. Quindi seleziona la casella di salvataggio automatico delle vendite per salvare le coordinate degli oggetti simulati per tutte le ripetizioni di ogni immagine del batch come file danneggiati in formato testo.

Immettere un tag comune anche per i file salvati. Infine, fare clic su esegui simulazione e determinare le frequenze medie di contatto e di prossimità dei set di 1000 immagini simulate corrispondenti a ciascuna immagine registrata. Per questa divisione, il contatto medio e la vicinanza contano in base al numero di cellule registrate per immagine e confrontano le frequenze con i risultati dell'analisi di colocalizzazione automatizzata dell'immagine registrata.

In questa figura viene presentata un'analisi di localizzazione di eosinofili, plasmacellule e cellule B con il microambiente della cellula stromale con midollo osseo chimerico fluorescente. I file CSV generati dagli strumenti di contatto e prossimità delle celle contengono il conteggio delle celle e l'area totale per ogni popolazione cellulare in pixel, nonché i conteggi dei contatti o delle vicinanze. Prima di eseguire una simulazione del posizionamento casuale delle celle, in questa simulazione devono essere determinati i parametri che descrivono la distribuzione delle dimensioni delle celle come distribuzione gaussiana, sono stati mantenuti i valori relativi del sigma misurati per le tre popolazioni di cellule.

Mentre i valori Sigma definiti in pixel sono stati impostati in modo che corrispondano all'aspetto visivo delle celle registrate per definire le aree in cui le celle possono essere posizionate, è stata generata una maschera dal canale DAPI. È stato quindi determinato un valore di 10 come soglia di densità ottimale per la generazione delle immagini binarie. La rilevanza dei contatti delle plasmacellule, degli eosinofili o delle cellule B con le cellule stromali è stata quindi testata come previsto.

Queste analisi hanno rivelato tassi di contatto significativamente più elevati nelle immagini registrate rispetto alla simulazione per le plasmacellule e le cellule B. Al contrario, non è stata osservata alcuna chiara differenza per il contatto con le cellule stromali eosinofile. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in qualsiasi campo che richieda l'analisi della complessa struttura tissutale del midollo osseo, come l'immunologia, l'ematologia, la patologia o la biologia delle cellule staminali.