Name: Ottimizzazione di proteine sintetiche: identificazione di interposizione Dipendenze Indicazione Strutturalmente e / o residui funzionalmente collegate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Scopri come identificare residui co-evoluti nelle allineamenti proteici utilizzando StickWRLD per visualizzare le dipendenze interposizionali. Questo metodo computazionale migliora l'efficienza del design proteico.

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StickWRLD è stato reso possibile in parte grazie ai finanziamenti forniti al Dr. Ray dall'Istituto di Ricerca presso il Nationwide Children's Hospital e dalla sovvenzione NSF DBI-1262457.

1. Software Download e installazione <ol><li> Utilizzare un computer ha un processore Intel i5 o meglio processore con almeno 4 GB di RAM, e sia in esecuzione Mac OS X o GNU / Linux (ad esempio, Ubuntu) OS. Inoltre, sono necessari Python 2.7.6 10 e il wxPython 2.8 11, SciPy 12, e PyOpenGL librerie 13 pitone - scaricare e installare ogni dalle rispettive repository. </li><li> Scarica <a href="http://www.stickwrld.org" target="_blank">StickWRLD</a> come un archivio zip contenente tutti i relativi script Python. Scaricare lo script &quot;fasta2stick.sh&quot; per la conversione di allineamenti di sequenze / proteine ​​DNA FASTA standard per formato StickWRLD. </li><li> Estrarre l&#39;archivio e mettere la cartella StickWRLD risultante sul tuo desktop. Posizionare lo script &quot;fasta2stick.sh&quot; sul desktop pure. </li></ol> 2. Preparare il Allineamento <ol><li> Creare un allineamento delle sequenze proteiche utilizzando qualsiasi stansoftware allineamento Dard (ad esempio, ClustalX 14). Salvare l&#39;allineamento sul desktop in formato FASTA. </li><li> Aprire l&#39;applicazione terminale sul computer Mac o GNU / Linux e passare al desktop (la posizione del &quot;fasta2stick.sh&quot; script di shell) digitando cd ~ / Desktop e premendo il ritorno. Eseguire lo script &quot;fasta2stick.sh&quot; digitando ./fasta2stick.sh nel terminale. Se lo script non viene eseguito, assicurarsi che sia eseguibile - nel tipo chmod + x terminale fasta2stick.sh per rendere lo script eseguibile. </li><li> Seguire le istruzioni visualizzate fornite dallo script per specificare il nome del file di input (il file creato in 1.2 sopra) e il nome di output desiderato. Salvare il file di output (che ora è nel formato corretto per StickWRLD) sul desktop. </li></ol> 3. Avvio StickWRLD <ol><li> Navigare nelle eseguibili StickWRLD cartella utilizzando la applic terminalezione del computer Mac o GNU / Linux. Ad esempio, se la cartella StickWRLD si trova sul desktop, digitare cd ~ / Desktop / StickWRLD / exec nel terminale. </li><li> Avviare StickWRLD digitando python-32 stickwrld_demo.py nel terminale. </li><li> Verificare che il pannello StickWRLD Data Loader è visibile sullo schermo (Figura 3). </li></ol> 4. Caricamento dei dati <ol><li> Caricare l&#39;allineamento sequenza proteica convertito premendo il pulsante &quot;Load Protein ...&quot; pulsante. </li><li> Selezionare il file creato nel passaggio 3 sopra e premere &quot;Apri&quot;. StickWRLD aprirà numerose finestre, tra cui &quot;StickWRLD Control&quot; (Figura 4) e &quot;StickWRLD - OpenGL&quot; (Figura 5). </li><li> Selezionare la - finestra &quot;StickWRLD OpenGL&quot;. Scegliere &quot;Ripristina vista&quot; dal menu &quot;OpenGL&quot; per visualizzare la visualizzazione StickWRLD default in un &quot;top-downVista &quot;attraverso il cilindro che rappresenta i dati nelle finestre ridimensionabili OpenGL .. </li></ol> 5. Opzioni di visualizzazione <ol><li> Selezionare le caselle per &quot;etichette di colonna&quot; e &quot;Etichette Ball&quot; nel riquadro &quot;StickWRLD Control&quot; (Figura 4) per visualizzare i valori per le colonne e le palle. </li><li> Deselezionare la casella per &quot;Bordi colonna&quot; nel riquadro &quot;StickWRLD Control&quot; per nascondere le strisce di margine di colonna. </li><li> Impostare il &quot;spessore Colonna&quot; per 0,1 nel riquadro &quot;StickWRLD Control&quot; per disegnare una linea sottile attraverso le colonne, rendendo più facile la navigazione nella vista 3D. Premere Invio per accettare la modifica. </li><li> Ripristina la vista nella &quot;StickWRLD - OpenGL&quot; finestra al precedente punto 5.3, quindi premere il pulsante &quot;schermo intero&quot; per massimizzare la vista. </li></ol> 6. Navigation <ol><li> Ruotare il display 3D StickWRLD tenendo premuto il tasto sinistro del mouse WHIle spostando il mouse in qualsiasi direzione. </li><li> Zoom il display 3D StickWRLD tenendo premuto il pulsante destro del mouse mentre si sposta il mouse verso l&#39;alto o verso il basso. </li></ol> 7. Individuazione interposizionale Dipendenze (DPI) <ol><li> Sfoglia la vista panoramica e lo zoom come descritto al punto 6. residui Coevolving superano i requisiti di soglia sia p e residuale sono collegati attraverso strisce di margine come si vede in figura 6. Se ci sono troppi o troppo pochi bordi di collegamento residui, cambiare il residuo soglia (nel riquadro &quot;StickWRLD Control&quot;) per visualizzare un numero inferiore, o più, i bordi. </li><li> Aumentare la soglia residua sul riquadro di controllo fino a quando non StickWRLD strisce di margine IPD sono mostrati e lentamente rampa fino a quando appaiono le relazioni. Continuare ad aumentare il residuo fino ad avere un numero sufficiente di relazioni da esaminare. </li><li> Identificare le relazioni che coinvolgono sia i residui di interesse noto (ad esempio, all&#39;interno di un motivo o di legame / divertimentosito finzionale) o residui che sono distale fra loro entro l&#39;allineamento (suggerendo che sono prossimale nella proteina ripiegata) </li></ol> 8. Selezione e risultati di risparmio <ol><li> Utilizzando il comando + click sinistro su tutti i bordi di interesse. Il riquadro StickWRLD controllo indicherà le colonne e collegare specifici residui, ad esempio, &quot;(124 | G) (136 | H)&quot; (Figura 7). Le linee continue rappresentano associazioni positive; linee tratteggiate rappresentano associazioni negative. </li><li> Premere il pulsante &quot;Edges uscita&quot; sul pannello &quot;StickWRLD di controllo&quot; per salvare un file in formato solo testo (edge_residual.csv) di tutti i bordi visibili, tra cui i residui uniti ei loro valori residui effettivi, in / StickWRLD / exec directory /. </li></ol>

<ol><li>Ray, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressing+the+unmet+need+for+visualizing+conditional+random+fields+in+biological+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC%22%5BJournal%5D)">Addressing the unmet need for visualizing conditional random fields in biological data.</a> BMC. 15, 202(2014).</li>
<li>Sullivan, B. J., Durani, V., Magliery, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triosephosphate+isomerase+by+consensus+design%3A+dramatic+differences+in+physical+properties+and+activity+of+related+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Triosephosphate isomerase by consensus design: dramatic differences in physical properties and activity of related variants.</a> Journal of molecular biology. 413, 195-208 (2011).</li>
<li>Smith, M. A., Bedbrook, C. N., Wu, T., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypocrea+jecorina+cellobiohydrolase+I+stabilizing+mutations+identified+using+noncontiguous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+synthetic+biology%22%5BJournal%5D)">Hypocrea jecorina cellobiohydrolase I stabilizing mutations identified using noncontiguous recombination.</a> ACS synthetic biology. 2, 690-696 (2013).</li>
<li>Ray, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+sequence+requirements+of+protein+families%3A+insights+from+the+BioVis+2013+contests%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+proceedings%22%5BJournal%5D)">Understanding the sequence requirements of protein families: insights from the BioVis 2013 contests.</a> BMC proceedings. 8, S1(2014).</li>
<li>Eddy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+a+hidden+Markov+model%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">What is a hidden Markov model?</a> Nature biotechnology. 22, 1315-1316 (2004).</li>
<li>Ray, W. C., Ozer, H. G., Armbruster, D. W., Daniels, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+identity+-+when+classical+homology+searching+fails%2C+why%2C+and+what+you+can+do+about+it%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+4th+Ohio+Collaborative+Conference+on+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Beyond identity - when classical homology searching fails, why, and what you can do about it.</a> Proceedings of the 4th Ohio Collaborative Conference on Bioinformatics. , IEEE Press. New York, NY. 51-56 (2009).</li>
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<li>Ray, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Visual+Analytics+approach+to+identifying+protein+structural+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE%22%5BJournal%5D)">A Visual Analytics approach to identifying protein structural constraints.</a> IEEE. , Ohio State Univ. Biophys. Program. Columbus, OH. 249-250 (2010).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

StickWRLD è stato utilizzato con successo per identificare tali DPI nel dominio coperchio adenilato chinasi 16, così come le basi del DNA associate in terminatori rho-dipendente 9, e un romanzo splice-site specificità archeali tRNA endonucleasi introni 6 siti di destinazione. Questi DPI non erano rilevabili attraverso un esame diretto degli allineamenti. StickWRLD visualizza ogni posizione di allineamento come una colonna di 20 &quot;sfere&quot;, dove ogni sfera rappresenta uno dei residui 20 aminoacidi e la dimensione della sfera indica la frequenza di occorrenza di quel particolare residuo dentro tale colonna (Figura 4). Le colonne sono disposte in un cilindro, con strisce di margine collegamento residui in colonne diverse (che indica un IPD). Queste strisce di margine sono disegnate solo se i residui corrispondenti sono covarying con una frequenza che supera sia il valore p (significato) e (attesi - osservate) residue soglie. Il rilevamento di residui concomitanti interdipendenti, o DPI, nelle regioni distali di un allineamento di DNA o sequenze proteiche è difficile utilizzare la sequenza standard di strumenti di allineamento 6. Mentre tali strumenti generano un consenso, o motivo, la sequenza, questo consenso è in molti casi una semplice maggioranza regola media e non trasmettere relazioni covariazione che si possono formare uno o più sub-motivi - gruppi di residui che tendono a co-evolvere. Anche i modelli HMM, che sono in grado di rilevare le dipendenze vicini, non possono accuratamente modello motivi di sequenza con DPI distali 5. Il risultato è che il consenso calcolato può infatti essere una sequenza &quot;sintetico&quot; non trovato in natura - e proteine ​​ingegnerizzate basate su tale consenso computazionale non può, infatti, essere ottimale. Infatti, la Pfam HMM per ADK suggerirebbe che una proteina chimerica contenente la metà del motivo tetracysteine, e la metà della H, S, D, T motivo, è funzionalmente altrettanto accettabilicome ogni ADK realmente esistente. Questo non è il caso, in quanto tali chimere (e molti altri blendings di questi motivi) sono cataliticamente morti 4,19. Quando cerchi correlazioni, è fondamentale che la soglia residua essere regolata per consentire la scoperta di correlazioni pertinenti impostando la soglia al di sopra del livello al quale eventuali spigoli sono visti e poi gradualmente rampa soglia indietro. In questo modo solo i bordi più significativi sono considerati inizialmente. Un approccio alternativo è quello di iniziare con la soglia impostata residua estremamente bassa. Ciò provoca la visualizzazione di tutti i bordi significativi. Da qui la soglia residuo può essere aumentata lentamente, permettendo bordi di drop out fino a modelli di emergere. Anche se questo approccio è meno utile quando si cerca per l&#39;inserimento di nodi specifici (ad esempio, l&#39;applicazione della conoscenza di dominio), permette la scoperta di relazioni inaspettate usando StickWRLD come a visUAL strumento analitico per scoprire modelli emergenti nella visualizzazione dei dati. StickWRLD è limitata principalmente dalla memoria disponibile del sistema in cui viene eseguito e la risoluzione del dispositivo di visualizzazione. Mentre non vi è alcun limite teorico al numero di punti dati StickWRLD può esaminare, e sequenze fino a 20.000 posizioni sono stati testati, in pratica StickWRLD funziona meglio con le sequenze fino a circa 1.000 posizioni. Il vantaggio principale di StickWRLD risiede nella sua capacità di identificare gruppi di residui che covary uno con l&#39;altro. Questo è un vantaggio significativo rispetto all&#39;approccio tradizionale della sequenza consenso statistica, che è una semplice media statistica e non tiene conto coevolution. Mentre in alcuni casi i residui covarying possono semplicemente essere un artefatto della filogenesi, anche questi residui hanno resistito alla &quot;test di selezione&quot;, e come tale è improbabile che sminuire l&#39;functionalità di ogni proteina progettata per includerli. Durante l&#39;utilizzo StickWRLD identificare DPI in una sequenza di DNA o proteine ​​canonica consenso / motif prima varianti ingegneria sintetici ridurrà il potenziale di errore e sostenere ottimizzazione rapida della funzione, va notato che StickWRLD può essere usato come strumento di identificazione di correlazione generalizzato e non si limita esclusivamente ai dati di proteine. StickWRLD può essere utilizzato per scoprire visivamente la co-occorrenza di eventuali variabili in ogni insieme di dati codificati correttamente.

Allineamenti proteine ​​sono da tempo utilizzati per valutare la somiglianza dei residui in una famiglia di proteine. Frequentemente le caratteristiche più interessanti di una proteina (per esempio, siti di legame catalitici o altri) sono il risultato di ripiegamento delle proteine ​​portando regioni distali del sequenza lineare a contatto, e di conseguenza queste regioni apparentemente indipendenti l&#39;allineamento tendono ad evolversi e cambiare modo coordinato. In altri casi, la funzione di una proteina può essere dipendente dalla sua firma elettrostatica, e mutazioni che influenzano il dipolo elettronica sono compensate da modifiche residui carichi lontane. Effetti allosterici possono anche indurre a lungo raggio dipendenze sequenziali e spaziali tra le identità di residui. Indipendentemente dalla loro origine, questi covariations funzionalmente richieste di residui - dipendenze tra posizionali (IPDS) - potrebbe non essere evidente con esame visivo del tracciato (Figura 1). Identificazione DPI - nonchéche i residui specifici all&#39;interno di tali posizioni tendono ad covary come unità - può rivelare importanti indizi sui processi di folding delle proteine ​​e la formazione di siti funzionali. Queste informazioni possono poi essere utilizzate per ottimizzare (ingegnerizzati) proteine ​​sintetiche in termini di stabilità termica e di attività. E &#39;noto da tempo che non tutte le mutazioni puntiformi verso consenso forniscono una migliore stabilità o attività. Più recentemente, proteine ​​progettati per sfruttare DPI noti loro sequenza hanno dimostrato di causare un aumento dell&#39;attività della stessa proteina progettata rigorosamente da consensus 1,2 (manoscritto in preparazione), simile al concetto di stabilizzazione mutazioni puntiformi 3. Purtroppo, i modelli di costruzione del consenso tradizionali (ad esempio, la regola di maggioranza) solo catturano DPI per caso. Metodi di consenso e posizione di punteggio specifico Matrix sono ignoranti di DPI e solo &#39;correttamente&#39; li includono nei modelli, quando i residui dipendentisono anche i residui più popolari per quelle posizioni in famiglia. Modelli catena di Markov possono catturare DPI quando sono in sequenza prossimale, ma la loro tipica implementazione ignora tutto tranne vicini sequenziali immediati, e anche al loro meglio, calcoli Hidden Markov Model (vedi figura 2) diventano intrattabile quando le dipendenze sono separati nella sequenza di oltre una dozzina di posizioni 4. Dal momento che questi DPI essenzialmente formano &quot;sub-motivi&quot;, che non può essere previsto da semplice &quot;regola di maggioranza&quot; o modelli consenso addirittura basati su HMM 5,6 il risultato può essere un &quot;consenso&quot; biologicamente non valido, che non è solo mai visto in natura, ma è meno praticabile di qualsiasi proteina esistente. I sistemi basati su Markov casuale Fields, quali GREMLIN 7, tentano di superare questi problemi. Inoltre mentre sofisticate tecniche biologiche / biochimici come noncontiguous ricombinazione 3,8 possono essere utilizzate per identify elementi essenziali di proteine ​​per regione, richiedono molto tempo e banco di lavoro per singolo-base-pair di precisione da raggiungere. StickWRLD 9 è un programma basato su Python che crea una rappresentazione interattiva 3D di un allineamento proteina che rende DPI chiaro e facile da capire. Ogni posizione nell&#39;allineamento è rappresentata come una colonna nella visualizzazione, in cui ogni colonna è costituita da una pila di sfere, una per ciascuno dei 20 aminoacidi che potrebbero essere presenti in quella posizione entro l&#39;allineamento. La dimensione della sfera dipende dalla frequenza di occorrenza degli aminoacidi, in modo tale che l&#39;utente può raccogliere immediatamente il residuo consenso o la relativa distribuzione di amminoacidi all&#39;interno di tale posizione semplicemente guardando le dimensioni delle sfere. Le colonne rappresentano ciascuna posizione sono avvolti attorno ad un cilindro. Questo dà ogni sfera che rappresenta una possibile amminoacido in ciascuna posizione l&#39;allineamento, una chiara &#39;linea di vista&#39;ad ogni altra possibilità ammino acido in ogni altra posizione. Prima della visualizzazione, StickWRLD calcola la forza della correlazione tra tutte le possibili combinazioni di residui per identificare il DPI 9. Per rappresentare DPI, linee sono disegnate tra i residui che sono coevolving ad una maggiore o minore di quanto ci si aspetterebbe se i residui presenti nelle posizioni erano indipendenti (DPI). Non solo questa visualizzazione spettacolo che le posizioni di sequenza interagiscono evolutivamente, ma come le strisce di margine IPD sono disegnate tra le sfere di aminoacidi in ogni colonna, l&#39;utente può determinare rapidamente che gli amminoacidi specifici tendono ad essere coevolving in ciascuna posizione. L&#39;utente ha la possibilità di ruotare e di esplorare la struttura IPD visualizzato, nonché dinamicamente modificare le soglie statistiche che controllano la visualizzazione delle correlazioni, rendendo StickWRLD un potente strumento di scoperta per DPI. Applicazioni come GREMLIN 7 similarly visualizzare le informazioni relazionali complesse tra i residui - ma queste relazioni sono calcolati con più modelli tradizionali di Markov, che non sono progettati per determinare eventuali relazioni condizionate. Come tali, questi sono in grado di essere visualizzato come proiezioni 2D. Per contro, StickWRLD può calcolare e visualizzare le dipendenze condizionali multi-nodo, che può essere offuscati se reso come un grafico 2D (un fenomeno noto come occlusione bordo). Vista 3D di StickWRLD ha anche diversi altri vantaggi. Consentendo agli utenti di manipolare le visuali - caratteristiche che possono essere offuscati o poco intuitivo in una rappresentazione 2D può essere più facilmente visibile nel cilindro 3D di StickWRLD - panning, rotazione e zoom. StickWRLD è essenzialmente uno strumento di analisi visiva, sfruttando la potenza di pattern recognition capacità del cervello umano di vedere i modelli e le tendenze, e la possibilità di esplorare i dati da diversi punti di vista si presta a questo.

<table><tbody><tr><td>Computer Mac o Ubuntu OS</td><td>Vari</td><td></td><td>Qualsiasi computer Mac o GNU/Linux (ad esempio, Ubuntu) in grado di eseguire Python e script di shell associati</td></tr><tr><td>Linguaggio di programmazione Python</td><td>python.org</td><td></td><td>Python versione 2.7.6 o superiore</td></tr><tr><td>Libreria wxPython</td> consigliata <td>wxpython.org</td><td></td><td>Libreria</td></tr> <tr><td></td><td>SciPy consigliata per l'ultima versione</td><td></td> scipy.org <td>Ultima versione consigliata</td></tr><tr><td>Libreria PyOpenGL</td><td>pyopengl.sourceforge.net</td><td></td><td>Ultima versione consigliata</td></tr><tr><td>StickWRLD Python script</td><td>NCH BCCM</td><td></td><td>Disponibile da <a href="http://www.stickwrld.org" target="_blank">http://www.stickwrld.org</a></td></tr><tr><td>fasta2stick.sh convertitore di file</td><td>NCH BCCM</td><td></td><td>Disponibile da <a href="http://www.stickwrld.org" target="_blank">http://www.stickwrld.org</a></td></tr><tr><td>Dati di sequenze</td><td></td><td></td> di proteine e/o DNA <td>Campioni disponibili su <a href="http://www.stickwrld.org" target="_blank">http://www.stickwrld.org</a></td></tr></tbody></table>

ottimizzazione di proteine ​​sintetiche: identificazione di interposizione dipendenze indicazione strutturalmente e / o residui funzionalmente collegate

Optimization of Synthetic Proteins: Identification of Interpositional Dependencies Indicating Structurally and/or Functionally Linked Residues

Allineamenti proteine ​​sono comunemente utilizzati per valutare la somiglianza dei residui proteici, e la sequenza di consenso derivata utilizzati per identificare le unità funzionali (ad esempio domini). Modelli di costruzione del consenso tradizionali non riescono a spiegare le dipendenze interposizione - funzionalmente necessaria covarianza dei residui che tendono ad apparire contemporaneamente in tutta l&#39;evoluzione e attraverso l&#39;albero phylogentic. Queste relazioni possono rivelare importanti indizi circa i processi di ripiegamento delle proteine, termostabilità, e la formazione di siti funzionali, che a loro volta possono essere utilizzati per informare l&#39;ingegneria delle proteine ​​sintetiche. Purtroppo, queste relazioni essenzialmente formano sub-motivi che non può essere previsto da semplice &quot;regola di maggioranza&quot; o modelli di consenso anche a base di HMM, e il risultato può essere un &quot;consenso&quot; biologicamente non valido, che non è solo mai visto in natura, ma è meno praticabile di qualsiasi proteina esistente. Abbiamo sviluppato un un visivostrumento alytics, StickWRLD, che crea una rappresentazione interattiva 3D di un allineamento di proteine ​​e chiaramente mostra covarying residui. L&#39;utente ha la possibilità di pan e zoom, nonché dinamicamente modificare la soglia statistica alla base della individuazione di covarianti. StickWRLD è già stata utilizzata con successo per identificare i residui covarying funzionalmente necessarie in proteine ​​come adenilato chinasi e in sequenze di DNA, come siti di destinazione endonuclease.

StickWRLD è stato utilizzato in precedenza per rilevare le dipendenze interposizione (IPDS) tra residui sia DNA 3 e proteine ​​15-17 allineamenti. Questi residui co-evoluzione, mentre spesso distale uno dall&#39;altro in allineamento di sequenze, sono spesso prossimale tra loro nella proteina ripiegata. StickWRLD permette una rapida scoperta di specifici residui di co-occorrenza di tali siti, ad esempio., Una alanina in posizione &quot;X&quot; è fortemente correlato a una treonina alla posizione &quot;y&quot;. Tali correlazioni possono essere indicativi di relazioni strutturali dimostrabili, e in genere sono siti che, per necessità, co-evolvono. StickWRLD è in grado di rilevare questi rapporti anche se più &quot;tradizionali&quot; Approcci usando HMM per descrivere motivi sicuro. Ad esempio, l&#39;analisi dell&#39;allineamento PFAM del dominio coperchio ADK usando StickWRLD rivela una forte correlazione positiva tra cisteine ​​(C) nelle posizioni 4 e 8 e una coordinatacoppia di C nelle posizioni 35 e 38. Allo stesso tempo, StickWRLD mostrato una simile forte relazione positiva tra istidina (H) e serina (S) a 4 e 8, con forti relazioni negative tra questi e il quartetto C a 4, 8, 35, e 38, e una forte relazione positiva con acido aspartico (D) e treonina (T) in posizioni 35 e 38 rispettivamente. Esistono DPI aggiuntivi tra la H, S, D, T motivo e una T e G alla posizione **** 10 e 29 in b subtilis **** evidenziando la natura condizionale di questi DPI - il motivo tetracysteine ​​non &#39;cura&#39; sulle identità a queste due posizioni, mentre l&#39;H idrofila, S, D, T triade richiede specifici residui in queste posizioni quasi assolutamente. Questi due completamente diversi motivi di residui in funzione della posizione possono svolgere lo stesso ruolo del coperchio ADK. Come si vede in figura 6, un grande cluster di DPI, compresa un&#39;associazione 3-nodo fra G (glicina) alla posizione 132, Y (tirosina) alla posizione 135, e un P (Proline) alla posizione 141, è visibile in primo piano (Figura 6A). In figura 6B, la vista è distorta per posizionare l&#39;utente leggermente sopra il cilindro, rivelando una IPD tra un H (istidina) alla posizione 136 e una M (metionina) alla posizione 29, 107 residui lontana. Un motivo PFAM HMM di derivazione dello stesso dominio (figura 2), nel frattempo, non solo non rileva questi come in particolare le varianti di co-occuring motivi, ma definisce anche i raggruppamenti complessivi in uno schema biologicamente non supportato 16. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52878/52878fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. &quot;Subway Map&quot; rappresentazione del B. subtilis adenosina chinasi struttura di dominio (ADK) coperchio. Le frecce indicano DPI individuati nell&#39;allineamento PFAM di ADK dominio coperchio StickWRLD. StickWRLD è in grado di identificare correttamente DPI all&#39;interno di un cluster of residui che si trovano in prossimità della proteina ripiegata. Di particolare interesse sono la coppia T e G alla posizione 9 e 29, che costituiscono solo IPD quando tetrade di residui a 4, 7, 24, e 27 non è C, C, C, C). Numeri residui visualizzato rappresenta B. subtilis posizione e non Pfam posizioni di allineamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52878/52878fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52878/52878fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2. Skylign 18 Hidden Markov Model (HMM) Sequenza Logo per il dominio coperchio ADK. Mentre HMM sono strumenti potenti per determinare le probabilità in ogni posizione, così come il contributo di ciascun sito per il modello generale, l&#39;indipendenza posizionale di HMM li rende inadatto per la rilevazione di DPI. Questo modello non suggeriscono alcunadipendenze visto nelle rappresentazioni StickWRLD (Figura 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52878/52878fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52878/52878fig3.jpg" /> Figura 3. Il StickWRLD Data Loader. Gli utenti possono scegliere tra i dati demo esistenti oppure caricare i propri dati in forma di DNA o sequenze proteiche allineamenti. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52878/52878fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4. La finestra StickWRLD di controllo. Il pannello di controllo consente all&#39;utente di modificare varie proprietà della vista, nonché regolare le soglie che controllano la visualizzazione delle strisce di margine che indicano le relazioni tra residui (DPI). Cerchiati in rosso sono i valori predefiniti che in genere necessitano di t<html> o essere regolata per una migliore visualizzazione di qualsiasi set di dati. Il valore residuo imposta la soglia di (osservato del previsto) per il quale le linee connettore / associazione sono disegnati. I comandi per colonna e palle etichette controllano se la posizione della colonna e dei valori residui (per esempio, &quot;A&quot; per arginina) vengono visualizzati. La colonna Bordo cavicchi di controllo di linea e fuori la visualizzazione delle linee di bordo che collegano le colonne - per i set di dati densi questo è meglio spento. I controlli Colonna Spessore se la colonna stessa viene visualizzato -. Impostazione a un valore molto piccolo (ad esempio, 0,1) disegnerà una linea attraverso le sfere della colonna, rendendo più semplice per distinguere le colonne le une dalle altre <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52878/52878fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <html> ghres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Figura 5. vista iniziale della finestra StickWRLD OpenGL con l&#39;adenilato chinasi dominio coperchio set di dati proteina caricato. La prospettiva iniziale sembra &quot;down&quot; attraverso il cilindro costituito delle posizioni di allineamento sequenza. L&#39;utente può ruotare il cilindro con sinistro del mouse fare clic e trascinare, e lo zoom in / out con il pulsante destro del mouse fare clic e trascinare. La vista iniziale è abbastanza denso, perché la visualizzazione predefinita mostra anche piccole percentuali di co-evoluzione. Per molte proteine, in questa impostazione, moduli distinti possono essere rilevati, ma anche in aree densamente co-evoluzione proteine ​​il display può essere rapidamente e in modo interattivo semplificato per trovare le IPD più importanti utilizzando l&#39;interfaccia StickWRLD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52878/52878fig5highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande questa cifra.</a> ghres.jpg &quot;width =&quot; 700 &quot;/&gt; Figura 6. Vista del primo piano di una visualizzazione StickWRLD della proteina dominio coperchio adenilato chinasi. Qui abbiamo cambiato il default residuo di 0,2. Questo aumenta la soglia per la visualizzazione dei bordi tra residui, mostrando meno bordi. I bordi che rimangono indicano DPI fortemente associati. Inoltre la vista è stata ruotata e ingrandita per consentire per facilitare la visualizzazione dei bordi. (A) Un grande cluster di DPI è visibile in primo piano, tra cui un&#39;associazione 3-nodo fra G (glicina) alla posizione 132, Y (tirosina) alla posizione 135, e P (prolina) nella posizione 141. (B) Il punto di vista è stata distorta per posizionare l&#39;utente leggermente al di sopra del cilindro, svelando un IPD tra un H (istidina) alla posizione 136 e una M (metionina) alla posizione 29, 107 residui distante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52878/52878fig6highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questo figura.</a><img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52878/52878fig7.jpg" /> Figura 7. Finestra StickWRLD Controllo visualizzare informazioni in basso a destra. CTRL + clic sinistro su un oggetto (ad esempio, sfera o bordo) nella finestra OpenGL visualizza le informazioni per l&#39;oggetto in basso a destra della finestra StickWLRD controllo. Qui vediamo le informazioni per un bordo IPD tra una metionina nella posizione 29 e una istidina in posizione 136.

Le sequenze proteiche sintetiche basate su motivi di consenso tipicamente ignorano i residui co-evolutivi, che implicano dipendenze interposizionali (IPD). Gli IPD possono essere essenziali per l'attività e i progetti che li ignorano possono portare a risultati non ottimali. Questo protocollo utilizza StickWRLD per identificare gli IPD e aiutare a informare la progettazione razionale delle proteine, ottenendo risultati più efficienti.

Ottimizzazione di proteine ​​sintetiche: identificazione di interposizione Dipendenze Indicazione Strutturalmente e / o residui funzionalmente collegate

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional ...

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare residui coevolutivi negli allineamenti proteici che implicano dipendenze interposizionali o IPD. Questo viene ottenuto innanzitutto caricando l'allineamento in Stick World, uno strumento di analisi visiva che crea una rappresentazione interattiva tridimensionale di un allineamento proteico e mostra chiaramente i residui co-variabili in Stick World. Ogni posizione nell'allineamento è rappresentata come una colonna composta da una pila di sfere, una sfera per ciascuno dei 20 aminoacidi possibili in quella posizione all'interno dell'allineamento, dimensionate in modo proporzionale alla frequenza; le colonne che rappresentano ciascuna posizione sono disposte a spirale attorno a un cilindro per rappresentare le IPD.Vengono tracciate linee tra residui che co-evolvono a un livello superiore o inferiore rispetto a quanto ci si aspetterebbe se i residui presenti nelle posizioni fossero dipendenti all'interno del programma. Il residuo viene regolato finché non si ottiene un numero gestibile di archi, quindi vengono identificati gli archi di interesse. Infine, si utilizza stick world per identificare i residui che co-evolvono tra loro.Residui di rivestimento funzionalmente necessari sono stati identificati in una chinasi ventilata. Uno dei motivi per cui le persone incontrano difficoltà in questo processo è la novità. È quasi un'arte quanto una scienza.Dimostrare visivamente Stick World è importante perché si tratta di uno strumento di analisi visiva che richiede l'interazione dell'utente. Utilizzare un computer dotato di un processore Intel i5 o superiore, con almeno quattro gigabyte di RAM, che esegua Mac OS 10 o un sistema operativo Linux, e che sia provvisto delle librerie Python elencate nel protocollo testuale. Scaricare Stick World come archivio zip contenente tutti gli script Python rilevanti.Inoltre, scaricare lo script FASTA two stick per convertire allineamenti di sequenze proteiche o di DNA in formato fasta standard nel formato stick world. Estrarre l'archivio e posizionare la cartella stick world risultante e lo script FASTA two stick sul desktop. Quindi creare un allineamento delle sequenze proteiche utilizzando un qualsiasi software di allineamento standard.Salvare l'allineamento sul desktop. Infestare un formato. Aprire l'applicazione terminale sul computer macro Linux e spostarsi sul desktop digitando CD tilde barra desktop e premendo invio nel terminale.Digiti il comando per rendere eseguibile lo script FASTA two stick, quindi digiti il comando per eseguire lo script. Segua le istruzioni a schermo fornite dallo script per specificare il nome del file di input e il nome desiderato per l'output. Salvare il file di output sul desktop.Accedi alla cartella degli eseguibili di Stick World utilizzando l'applicazione terminale del computer Mac o Linux ed esegui Stick World digitando nel terminale Python -32 stick_world_demo.py. Verifica che il pannello del caricatore dati di Stick World sia visibile sullo schermo. Carica quindi l'allineamento delle sequenze proteiche convertito premendo il pulsante Carica proteina.Selezionare il file creato e premere apri: verranno aperte diverse nuove finestre, tra cui Stick World Control e Stick World Open GL. Selezionare la finestra di Stick World Open GL. Scegliere Ripristina vista dal menu Open GL per visualizzare la rappresentazione predefinita di Stick World in una vista dall'alto verso il basso attraverso il cilindro, che rappresenta i dati nelle finestre ridimensionabili di Open GL.Nel mondo degli stecchini esistono diverse opzioni di visualizzazione. Selezionare le caselle per le etichette delle colonne e le etichette delle sfere nel pannello di controllo del mondo degli stecchini per mostrare i valori delle colonne e delle sfere. Deselezionare la casella per i bordi delle colonne nel pannello di controllo del mondo degli stecchini per nascondere le linee dei bordi delle colonne.Impostare lo spessore della colonna su 0,1 nel pannello di controllo dello stick world per tracciare una linea sottile attraverso le colonne. Per facilitare la navigazione della vista 3D, premere Invio per accettare la modifica. Reimpostare la vista nella finestra OpenGL dello stick world.Quindi premere il pulsante a schermo intero per massimizzare la visualizzazione e navigare all'interno del programma. Ruotare la visualizzazione tridimensionale del modello a bastoncino tenendo premuto il tasto sinistro del mouse mentre si sposta il mouse in qualsiasi direzione. Eseguire lo zoom nella visualizzazione tridimensionale del modello a bastoncino tenendo premuto il tasto destro del mouse mentre si sposta il mouse verso l'alto o verso il basso.Esplora la vista spostandoti e ingrandendo i residui coevolutivi che superano i requisiti soglia sia di p che del residuo, i quali sono collegati tramite linee di connessione. Se ci sono troppe o troppo poche linee di connessione tra i residui, modifica la soglia residua per mostrare meno o più linee. Aumenta la soglia residua sul controllo stick world fino a quando non vengono visualizzate linee di connessione IPD, quindi riducila lentamente finché non compaiono relazioni. Continua ad aumentare il valore residuo finché non si ottiene un numero sufficiente di relazioni da esaminare.Identificare le relazioni che coinvolgono residui di interesse noto o residui distanti tra loro all'interno dell'allineamento utilizzando il tasto comando più clic sinistro, selezionare tutti i collegamenti di interesse. Il pannello di controllo della vista tridimensionale indicherà le colonne e connetterà residui specifici. Le linee continue rappresentano associazioni positive.Le linee tratteggiate rappresentano associazioni negative. Premere il pulsante "output edges" nel pannello di controllo di stick world per salvare un file in formato testo semplice di tutti i bordi visibili nella directory appropriata, inclusi i residui articolari e i loro valori residui effettivi. È visibile in primo piano un ampio cluster di dipendenze interposizionali (IPD), che include un'associazione a tre nodi tra la glicina nella posizione 1 32, la tirosina nella posizione 1 35 e una prolina nella posizione 1 41.Qui, la vista è stata inclinata in modo da posizionare l'utente leggermente al di sopra del cilindro, rivelando un IPD tra un'istidina in posizione 1 36 e una metionina in posizione 29 a 107 residui di distanza. Al contrario, il motivo A-P-A-M-H-M-M dello stesso dominio non rileva queste variazioni del motivo come co-occorrenti in modo specifico e definisce anche i raggruppamenti complessivi secondo uno schema non supportato biologicamente. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di provarla in due modi diversi.Iniziare con un residuo elevato e procedere verso il basso, oppure iniziare con un residuo ridotto e procedere verso l'alto, in modo da poter esplorare lo spazio in due modi diversi.

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