Ottimizzazione di proteine sintetiche: identificazione di interposizione Dipendenze Indicazione Strutturalmente e / o residui funzionalmente collegate
14 luglio 2015
Le sequenze proteiche sintetiche basate su motivi di consenso tipicamente ignorano i residui co-evolutivi, che implicano dipendenze interposizionali (IPD). Gli IPD possono essere essenziali per l'attività e i progetti che li ignorano possono portare a risultati non ottimali. Questo protocollo utilizza StickWRLD per identificare gli IPD e aiutare a informare la progettazione razionale delle proteine, ottenendo risultati più efficienti.
L'obiettivo generale di questa procedura è identificare residui coevolutivi negli allineamenti proteici che implicano dipendenze interposizionali o IPD. Questo viene ottenuto innanzitutto caricando l'allineamento in Stick World, uno strumento di analisi visiva che crea una rappresentazione interattiva tridimensionale di un allineamento proteico e mostra chiaramente i residui co-variabili in Stick World. Ogni posizione nell'allineamento è rappresentata come una colonna composta da una pila di sfere, una sfera per ciascuno dei 20 aminoacidi possibili in quella posizione all'interno dell'allineamento, dimensionate in modo proporzionale alla frequenza; le colonne che rappresentano ciascuna posizione sono disposte a spirale attorno a un cilindro per rappresentare le IPD.
Vengono tracciate linee tra residui che co-evolvono a un livello superiore o inferiore rispetto a quanto ci si aspetterebbe se i residui presenti nelle posizioni fossero dipendenti all'interno del programma. Il residuo viene regolato finché non si ottiene un numero gestibile di archi, quindi vengono identificati gli archi di interesse. Infine, si utilizza stick world per identificare i residui che co-evolvono tra loro.
Residui di rivestimento funzionalmente necessari sono stati identificati in una chinasi ventilata. Uno dei motivi per cui le persone incontrano difficoltà in questo processo è la novità. È quasi un'arte quanto una scienza.
Dimostrare visivamente Stick World è importante perché si tratta di uno strumento di analisi visiva che richiede l'interazione dell'utente. Utilizzare un computer dotato di un processore Intel i5 o superiore, con almeno quattro gigabyte di RAM, che esegua Mac OS 10 o un sistema operativo Linux, e che sia provvisto delle librerie Python elencate nel protocollo testuale. Scaricare Stick World come archivio zip contenente tutti gli script Python rilevanti.
Inoltre, scaricare lo script FASTA two stick per convertire allineamenti di sequenze proteiche o di DNA in formato fasta standard nel formato stick world. Estrarre l'archivio e posizionare la cartella stick world risultante e lo script FASTA two stick sul desktop. Quindi creare un allineamento delle sequenze proteiche utilizzando un qualsiasi software di allineamento standard.
Salvare l'allineamento sul desktop. Infestare un formato. Aprire l'applicazione terminale sul computer macro Linux e spostarsi sul desktop digitando CD tilde barra desktop e premendo invio nel terminale.
Digiti il comando per rendere eseguibile lo script FASTA two stick, quindi digiti il comando per eseguire lo script. Segua le istruzioni a schermo fornite dallo script per specificare il nome del file di input e il nome desiderato per l'output. Salvare il file di output sul desktop.
Accedi alla cartella degli eseguibili di Stick World utilizzando l'applicazione terminale del computer Mac o Linux ed esegui Stick World digitando nel terminale Python -32 stick_world_demo.py. Verifica che il pannello del caricatore dati di Stick World sia visibile sullo schermo. Carica quindi l'allineamento delle sequenze proteiche convertito premendo il pulsante Carica proteina.
Selezionare il file creato e premere apri: verranno aperte diverse nuove finestre, tra cui Stick World Control e Stick World Open GL. Selezionare la finestra di Stick World Open GL. Scegliere Ripristina vista dal menu Open GL per visualizzare la rappresentazione predefinita di Stick World in una vista dall'alto verso il basso attraverso il cilindro, che rappresenta i dati nelle finestre ridimensionabili di Open GL.
Nel mondo degli stecchini esistono diverse opzioni di visualizzazione. Selezionare le caselle per le etichette delle colonne e le etichette delle sfere nel pannello di controllo del mondo degli stecchini per mostrare i valori delle colonne e delle sfere. Deselezionare la casella per i bordi delle colonne nel pannello di controllo del mondo degli stecchini per nascondere le linee dei bordi delle colonne.
Impostare lo spessore della colonna su 0,1 nel pannello di controllo dello stick world per tracciare una linea sottile attraverso le colonne. Per facilitare la navigazione della vista 3D, premere Invio per accettare la modifica. Reimpostare la vista nella finestra OpenGL dello stick world.
Quindi premere il pulsante a schermo intero per massimizzare la visualizzazione e navigare all'interno del programma. Ruotare la visualizzazione tridimensionale del modello a bastoncino tenendo premuto il tasto sinistro del mouse mentre si sposta il mouse in qualsiasi direzione. Eseguire lo zoom nella visualizzazione tridimensionale del modello a bastoncino tenendo premuto il tasto destro del mouse mentre si sposta il mouse verso l'alto o verso il basso.
Esplora la vista spostandoti e ingrandendo i residui coevolutivi che superano i requisiti soglia sia di p che del residuo, i quali sono collegati tramite linee di connessione. Se ci sono troppe o troppo poche linee di connessione tra i residui, modifica la soglia residua per mostrare meno o più linee. Aumenta la soglia residua sul controllo stick world fino a quando non vengono visualizzate linee di connessione IPD, quindi riducila lentamente finché non compaiono relazioni. Continua ad aumentare il valore residuo finché non si ottiene un numero sufficiente di relazioni da esaminare.
Identificare le relazioni che coinvolgono residui di interesse noto o residui distanti tra loro all'interno dell'allineamento utilizzando il tasto comando più clic sinistro, selezionare tutti i collegamenti di interesse. Il pannello di controllo della vista tridimensionale indicherà le colonne e connetterà residui specifici. Le linee continue rappresentano associazioni positive.
Le linee tratteggiate rappresentano associazioni negative. Premere il pulsante "output edges" nel pannello di controllo di stick world per salvare un file in formato testo semplice di tutti i bordi visibili nella directory appropriata, inclusi i residui articolari e i loro valori residui effettivi. È visibile in primo piano un ampio cluster di dipendenze interposizionali (IPD), che include un'associazione a tre nodi tra la glicina nella posizione 1 32, la tirosina nella posizione 1 35 e una prolina nella posizione 1 41.
Qui, la vista è stata inclinata in modo da posizionare l'utente leggermente al di sopra del cilindro, rivelando un IPD tra un'istidina in posizione 1 36 e una metionina in posizione 29 a 107 residui di distanza. Al contrario, il motivo A-P-A-M-H-M-M dello stesso dominio non rileva queste variazioni del motivo come co-occorrenti in modo specifico e definisce anche i raggruppamenti complessivi secondo uno schema non supportato biologicamente. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di provarla in due modi diversi.
Iniziare con un residuo elevato e procedere verso il basso, oppure iniziare con un residuo ridotto e procedere verso l'alto, in modo da poter esplorare lo spazio in due modi diversi.
Panoramica
Questo protocollo utilizza StickWRLD per identificare residui co-evolutivi negli allineamenti proteici, evidenziando dipendenze interposizionali (IPD) fondamentali per l'attività proteica. Incorporando le IPD nella progettazione proteica, i ricercatori possono ottenere risultati più efficienti.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Progettazione di proteine
- Bioinformatica
- Biologia strutturale
Sfondo
- I residui co-evolutivi indicano dipendenze interposizionali (IPDs).
- Ignorare le IPDs può portare a progetti proteici subottimali.
- StickWRLD è uno strumento di analisi visiva per l'analisi dell'allineamento proteico.
- Comprendere le IPDs è essenziale per la progettazione razionale delle proteine.
Scopo dello studio
- Identificare residui coevolutivi che implicano IPD.
- Migliorare l'efficienza dei processi di progettazione proteica.
- Dimostrare l'utilità di StickWRLD nella visualizzazione degli allineamenti proteici.
Metodi Utilizzati
- Caricare allineamenti proteici in StickWRLD.
- Visualizzare residui in co-evoluzione mediante rappresentazioni 3D.
- Regolare le soglie residue per identificare relazioni significative.
- Generare i dati sui IPD identificati per ulteriori analisi.
Risultati principali
- Identificazione di IPD significativi nelle sequenze proteiche.
- Visualizzazione di residui co-evolutivi mediante modelli 3D interattivi.
- Dimostrazione dell'importanza degli IPD nella funzionalità proteica.
- Applicazione con successo di StickWRLD nell'analisi di allineamenti proteici.
Conclusioni
- L'integrazione dei dominii di interazione proteica (IPD) nella progettazione proteica può potenziare l'attività.
- StickWRLD rappresenta uno strumento efficace per la visualizzazione delle interazioni proteiche.
- La comprensione della co-evoluzione è fondamentale per l'ingegneria razionale delle proteine.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'identificazione delle dipendenze interposizionali (IPD) nelle sequenze proteiche consente una progettazione sintetica più accurata delle proteine, rivelando relazioni tra residui conservate durante l'evoluzione che influenzano il ripiegamento, la stabilità e la funzione. Ignorare queste covariazioni comporta il rischio di generare sequenze consenso non vitali, prive di rilevanza biologica. StickWRLD offre un approccio basato sull'analisi visiva per rilevare tali dipendenze, supportando l'ingegnerizzazione razionale di proteine terapeutiche con una maggiore affidabilità predittiva.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Rivela residui collegati funzionalmente che possono indicare siti strutturali o catalitici critici nelle proteine bersaglio.
- Valore operativo: Consente un'analisi basata su ipotesi della covariazione dei residui per ridurre i rischi associati ai meccanismi del bersaglio nelle fasi iniziali della scoperta.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Identifica coppie di residui in co-evoluzione che possono guidare la progettazione di varianti proteiche stabilizzate per migliorare l'affidabilità del saggio.
- Valore operativo: Favorisce lo sviluppo di input proteici standardizzati con interfacce funzionali preservate per schermature riproducibili.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega la covariazione delle sequenze a motivi strutturali che potrebbero correlare con domini funzionali rilevanti per i meccanismi delle malattie.
- Valore operativo: Facilita la traduzione di progetti informati dall'IPD in modelli preclinici preservando interazioni tra residui simili a quelle native.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel flusso di lavoro di scoperta fornendo informazioni sulla validazione del bersaglio attraverso un'analisi meccanicistica e consentendo l'ottimizzazione del composto leader mediante un design guidato dalla struttura, basato sulla covariazione evolutiva.
- Discovery Biology: Supporta la riduzione del rischio meccanicistico evidenziando reti di residui che potrebbero essere alla base della funzione proteica o della regolazione alosterica.
- Screening: Consente la preparazione di varianti proteiche con superfici di interazione conservate, migliorando la coerenza dell'interazione con la proteina bersaglio nei saggi.
- Analytics: Genera dati quantitativi sugli archi (valori residui) tra residui co-evoluti per classificare e prioritizzare ipotesi strutturali.
- Ricerca Translazionale: Collega i modelli evolutivi alla continuità strutturale, facilitando la progettazione di proteine con funzione preservata attraverso diversi modelli.
- Riutilizzo Aziendale: Fornisce una piattaforma analitica visiva riutilizzabile per la progettazione iterativa di proteine su più bersagli e progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella progettazione delle proteine considerando le interazioni tra residui vincolate dall'evoluzione.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità grazie a una visualizzazione standardizzata e a un rilevamento regolabile delle soglie per le coppie in co-evoluzione.
- Valore strategico: Riduce il rischio di fallimento nelle fasi avanzate migliorando la plausibilità biologica delle proteine sintetiche già nei primi stadi di sviluppo.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione consapevole dei rischi nei candidati per l'ingegneria proteica basata sulle dipendenze strutturali e funzionali dei residui.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'allineamento di sequenze proteiche e nell'analisi evolutiva.
- Necessita di una workstation con Python 3.2+, supporto OpenGL e librerie specificate per eseguire StickWRLD.
- Richiede allineamenti in ingresso standardizzati e impostazioni di soglia coerenti per una rilevazione riproducibile delle IPD tra diversi gruppi di lavoro.
- Comporta l'ispezione manuale di visualizzazioni tridimensionali per identificare interazioni tra residui biologicamente rilevanti.
- È limitato dalla qualità e dalla profondità dell'allineamento multiplo di sequenze in ingresso, che influisce sull'intensità del segnale di covariazione.
