Monitoraggio parte dell'Assemblea di una Secreted batterica Virulence Factor Uso site-specific reticolazione

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di esaminare le dinamiche delle interazioni proteina-proteina all'interno di una cellula vivente. Ciò si ottiene esprimendo prima una proteina di interesse in e coli, incorporando l'analogo dell'amminoacido benzoilfenilalanina nella proteina in una posizione specifica ed eseguendo la marcatura radio a inseguimento di impulsi per etichettare una piccola popolazione di molecole proteiche sintetizzate in modo sincrono. Come secondo passo.

Aliquote di cellule raccolte in vari punti temporali durante l'inseguimento vengono irradiate per innescare la formazione di legami covalenti tra la proteina di interesse e qualsiasi fattore con cui interagisce. Successivamente le proteine vengono immuno precipitate con anticorpi specifici e risolte mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS al fine di identificare i fattori interagenti, si ottengono risultati che mostrano cambiamenti nelle interazioni tra la proteina di interesse e altri fattori intracellulari nel tempo in base ai cambiamenti nella mobilità elettroforetica dei prodotti di reticolazione. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la co-immunoprecipitazione o il cross-linking chimico, è la sua capacità di generare informazioni temporali sulle interazioni che si verificano tra un residuo specifico in una proteina di interesse e altre molecole.

Tali dati sono particolarmente preziosi quando si studia la progressione di una proteina attraverso un percorso di assemblaggio a più fasi e per identificare gli intermedi di assemblaggio. Sebbene questo metodo sia stato ottimizzato per l'uso nell'e coli, può essere utilizzato anche in altri sistemi, inclusi altri batteri, lieviti e cellule di mammifero. I dettagli per la preparazione alla coltura sono disponibili nel protocollo di testo.

Preparare brevemente cinque millilitri di terreno M nine contenente lo 0,2% di glicerolo, tutti gli amminoacidi el tranne metionina e cistina e gli antibiotici iniziano le colture notturne aggiungendo e coli trasformati con un plasmide che codifica per la proteina di interesse con una mutazione ambra e il plasmide che codifica per il sistema di soppressione dell'ambra incubare a 37 gradi Celsius. Il giorno dell'esperimento, aggiungere una quantità appropriata di cellule dalla coltura notturna a un pallone di erlenmeyer da 250 millilitri contenente 50 millilitri di terreno M nove e antibiotici per ottenere una densità ottica a 550 nanometri di 0,03. Incubare le colture a 37 gradi Celsius in un bagno d'acqua agitante.

Quando le colture raggiungono la fase logaritmica precoce e media, aggiungere 50 microlitri di benzoilfenilalanina molare o BPA a ciascuna coltura. Aggiungere BPA una goccia alla volta mentre si agita il pallone per evitare precipitazioni. Quindi, aggiungi tutti gli induttori necessari per guidare l'espressione del mutante ambra.

Continuare a incubare le colture a 37 gradi Celsius per altri 30 minuti durante il periodo di induzione di 30 minuti. Etichettare sei provette da centrifuga monouso da 15 millilitri con il punto temporale e più UV o meno UV. Posizionare i tubi etichettati sul ghiaccio.

Posizionare una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti sopra un secondo secchiello per il ghiaccio pieno di ghiaccio. Accendere la lampada UV cinque minuti prima dell'etichettatura radio. Quindi aggiungere circa due millilitri di ghiaccio a ciascuna provetta etichettata meno UV e a due dei pozzetti nella piastra a più pozzetti.

È essenziale far entrare il ghiaccio direttamente nelle provette e nei pozzetti per arrestare immediatamente le reazioni intracellulari in ogni momento e ottenere così un'istantanea accurata del percorso biochimico Al termine del periodo di induzione di 30 minuti. Trasferire 25 millilitri di coltura in un pallone di erlenmeyer monouso preriscaldato da 125 millilitri. Mettere il pallone nel bagnomaria agitando a 37 gradi Celsius.

Le fasi della marcatura a impulsi e dell'irradiazione UV devono essere eseguite in modo tempestivo e richiedono una notevole organizzazione e una preparazione avanzata. Aggiungere 30 micro curie per millilitro di metionina e cisteina marcate con S 35 alla coltura e agitare rapidamente per mescolare alla volta. Un minuto e zero secondi.

Aggiungere 250 microlitri di una soluzione non radioattiva di metionina cisteina da 100 millimolari e agitare rapidamente. Per miscelare immediatamente, pipettare quattro millilitri di coltura in uno dei pozzetti della piastra a pozzetti multipli raffreddata che contiene ghiaccio, pipettare una seconda aliquota da quattro millilitri nella provetta da 15 millilitri etichettata zero minuti meno UV alla volta. Due minuti e zero secondi.

Pipettare quattro millilitri di coltura in un secondo pozzetto della piastra multipozzetto raffreddata che contiene ghiaccio. Quindi pipettare un'altra aliquota di quattro millilitri nella provetta da 15 millilitri etichettata un minuto meno UV immediatamente prima del punto temporale di cinque minuti a circa due millilitri di ghiaccio in un terzo pozzetto nella piastra multipozzetto a volte sei minuti e zero secondi. Pipettare quattro millilitri di coltura nel terzo pozzetto della piastra multipozzetto raffreddata che contiene il tubo del ghiaccio.

Avevo un'altra aliquota di quattro millilitri nel tubo da 15 millilitri etichettato cinque minuti meno uv. Posizionare il secchiello del ghiaccio con la piastra multipozzetto sotto la lampada UV preriscaldata e irradiare ogni campione singolarmente per quattro minuti. Trasferisci le cellule nelle provette refrigerate da 15 millilitri etichettate zero minuti più uv, un minuto più UV e così via.

Quindi centrifugare le celle a 2.500 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Risospendere ogni campione in 300 microlitri di terreno M nove o PBS e 33 microlitri di acido tricloroacetico freddo al 100% o TCA per precipitare le proteine centrifugare il TCA precipita in una micro fuga alla massima velocità per 10 minuti. Prima di rimuovere lo stato, aggiungere 50 microlitri di tampone di solubilizzazione a ciascun campione e riscaldare agitando a 95 gradi Celsius per cinque minuti per solubilizzare la proteina precipitata.

Dopo aver aggiunto un millilitro di tampone per il saggio di immunoprecipitazione radio, esegue le precipitazioni immunologiche standard utilizzando da un quinto alla metà di ciascun campione. Risolvere le proteine immuno precipitate mediante solfato ESAL di sodio, elettroforesi su gel di poliacrilammide o pagina SDS. Infine, esporre i gel colorati ed essiccati a uno schermo fosfoico durante la notte e rilevare le proteine radioattive, compresi i prodotti di reticolazione con un imager fosfoscopico. Il fotoreticolo specifico è stato utilizzato per identificare le proteine che interagiscono con l'ESPP durante il suo viaggio verso la membrana esterna.

Per questo esperimento, i codoni di alanina di pH ai residui 1113 e 1214 del dominio beta ESPP sono stati sostituiti con codoni di ambra. La struttura cristallina del dominio beta ESPP mostra che i due residui si trovano entrambi sul lato periplasmatico del cilindro beta, separati da circa 120 gradi. Due diversi polipeptidi sono stati immunoprecipitati sia dalle cellule irradiate che da quelle di controllo dal C terminale anti ESPP e dal siero.

Inizialmente, una forma precursore della proteina di circa 135 kilodalton che contiene domini passeggeri e beta legati in modo covalente ha predominato in punti temporali successivi. Il livello di PRO ESPP diminuì e il dominio beta libero iniziò a predominare poiché il dominio passeggero era translocalizzato attraverso la membrana esterna e separato dal dominio beta da una scissione proteolitica. I campioni irradiati da UV I, tuttavia, avevano chiaramente bande di peso molecolare più elevate che non erano presenti nei campioni di controllo.

Queste bande derivano dalla reticolazione di PRO ESPP a proteine interagenti in base alla mobilità di questi polipeptidi, le dimensioni delle proteine interagenti sono state stimate per verificare se potrebbero corrispondere a fattori noti di assemblaggio delle proteine della membrana esterna. Sono state eseguite ulteriori immunoprecipitazioni utilizzando anti cera generate contro i presunti partner interagenti. Un polipeptide di circa 150 kilodalton che è stato osservato quando il BPA è stato incorporato in entrambi i residui 1113 e 1214 potrebbe essere immunoprecipitato con un antisiero contro il salto di chaperone periplasmatico da 17 kilodalton.

Inoltre, abbiamo scoperto che i polipeptidi più grandi che sono stati osservati quando il BPA è stato incorporato in una sola delle due posizioni potrebbero essere immunoprecipitati con anti cera contro le subunità del complesso BAM, rispettivamente BAM B e BAM D. Dopo aver eseguito questa procedura, i prodotti reticolanti possono essere purificati e possono essere eseguiti altri metodi, tra cui la spettrometria di massa, per aiutare a identificare i fattori che interagiscono con una proteina di interesse. Dopo aver guardato con il video, dovresti avere una buona comprensione di come combinare con successo l'etichettatura a inseguimento di impulsi con il reticolazione fotografica specifico del sito per studiare le dinamiche di interazione della tua proteina, di interesse con altre molecole all'interno della cellula vivente.