Name: Monitoraggio parte dellAssemblea di una Secreted batterica Virulence Factor Uso site-specific reticolazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Scopri la foto-reticolazione sito-specifica per studiare le interazioni proteiche dinamiche in vivo in E. coli. Questo metodo consente di monitorare l'assemblaggio di fattori di virulenza batterici con risoluzione temporale.

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Questo lavoro è stato supportato dal Programma di Ricerca Intramurale dell'Istituto Nazionale del Diabete e delle Malattie Digestive e Renali.

1. Costruzione di plasmidi
<ol>
	<li>Dopo aver clonato un gene che codifica per una proteina di interesse in un vettore di espressione appropriato, introdurre mutazioni ambrate nelle posizioni desiderate utilizzando un kit di mutagenesi sito-diretta. 
	NOTA: Le informazioni strutturali e le previsioni dell'esposizione superficiale possono servire come guide utili per determinare le posizioni delle mutazioni. Poiché l'efficienza della soppressione dell'ambra e della reticolazione può variare considerevolmente, le mutazioni dell'ambra dovrebbero essere introdotte in più posizioni. Inoltre, poiché il Bpa è un analogo della tirosina e della fenilalanina, cercare di introdurre mutazioni dell'ambra in posizioni che normalmente codificano grandi amminoacidi idrofobici per minimizzare le perturbazioni della struttura e della funzione delle proteine. Infine, quando si sceglie un vettore di espressione, tenere presente che la sovrapproduzione di una proteina di interesse a un livello molto alto potrebbe limitare l'efficienza dell'incorporazione di Bpa.</li>
</ol>
2. Preparazione alla cultura
<ol>
	<li>Utilizzare l'elettroporazione per trasformare un ceppo appropriato di E. coli con un plasmide che codifica per il sistema di soppressione dell'ambra (pDULE-p Bpa; vedi riferimento4) e un plasmide compatibile che codifica per la proteina di interesse con una mutazione ambra.</li>
	<li>Piastre su agar LB contenenti antibiotici appropriati (utilizzare 5 μg/ml di tetraciclina per selezionare pDULE-p Bpa). Incubare le piastre O/N a 37 °C.</li>
	<li>Il giorno seguente, iniziare le colture O/N da singole colonie in 3-5 ml di terreno M914 contenente lo 0,2% di glicerolo, tutti gli L-amminoacidi tranne metionina e cisteina (40 μg/ml) e antibiotici. Incubare a 37 °C.</li>
	<li>Il giorno successivo, centrifugare le colture O/N a 2.500 x g per 5 minuti a RT su cellule a pellet. Risospendere le cellule in 5 ml di terreno M9 fresco e ripetere la centrifugazione. 
	NOTA: Questa fase di lavaggio è fondamentale per mantenere i plasmidi che codificano la resistenza all'ampicillina perché piccole quantità di b lattamasi presenti nel terreno dalle colture O/N degradano l'ampicillina appena aggiunta prima che si verifichi una crescita cellulare significativa.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 2 ml di terreno fresco e misurare la concentrazione cellulare in uno spettrofotometro (OD550).</li>
	<li>Aggiungere le cellule a un pallone di Erlenmeyer da 250 ml contenente 50 ml di terreno M9 e antibiotici con OD550=0,03. Incubare le colture a 37 °C in un bagno d'acqua agitante.</li>
</ol>
3. Incorporazione Bpa e preparazione per la fotoreticolazione
NOTA: Il protocollo descritto di seguito è per un corso temporale di esempio che ha tre punti temporali (0, 1 e 5 min). Regolare i volumi di conseguenza se si desidera un numero diverso di punti temporali. Uno schema della procedura è illustrato nella Figura 1.
<ol>
	<li>Mentre le colture crescono, preparare una soluzione fresca 1 M (1.000x) di Bpa in 1 M NaOH (27 mg di Bpa in 100 μl 1 M NaOH). Usa un tubo a pareti scure per mantenere la soluzione al buio.</li>
	<li>Quando le colture raggiungono la fase di log iniziale e medio (OD550=0,2), aggiungere 50 μl di 1 M Bpa a ciascuna coltura. Aggiungere Bpa una goccia alla volta mentre si agita il pallone per evitare precipitazioni. Quindi, aggiungi tutti gli induttori necessari per guidare l'espressione del mutante ambra. Continuare a incubare le colture a 37 °C per altri 30 minuti.</li>
	<li>Durante il periodo di induzione di 30 minuti, etichettare sei provette da centrifuga monouso da 15 ml con il punto temporale (0 min, 1 min, 5 min) e "+ UV" o "- UV". Metti i tubi sul ghiaccio.</li>
	<li>Riempi un secondo secchiello del ghiaccio con ghiaccio e posiziona una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti sopra il ghiaccio.</li>
	<li>Scongelare un'elevata attività specifica (1.000 mCi/mmol) 35S-metionina e 35S-cisteina (o una miscela preconfezionata dei due composti) per la marcatura degli impulsi e preparare (o scongelare) una soluzione di L-cisteina non radioattiva e L-metionina (100 mM ciascuna) per l'inseguimento.</li>
	<li>Accendere la lampada UV cinque minuti prima della radiomarcatura. 
	NOTA: La lampada deve essere regolabile in modo da poter essere posizionata a ~3-4 cm dai campioni nella piastra multipozzetto.</li>
	<li>Aggiungere ghiaccio (~2 ml) a ciascuna provetta etichettata "- UV" e a due dei pozzetti della piastra multipozzetto. 
	NOTA: Il ghiaccio deve essere aggiunto a un terzo pozzetto immediatamente prima del tempo di 5 minuti. È essenziale posizionare il ghiaccio direttamente nelle provette e nei pozzetti per fermare immediatamente le reazioni intracellulari in ogni momento e ottenere così "istantanee" accurate di una specifica via biochimica.</li>
	<li>Al termine del periodo di induzione di 30 minuti, trasferire 25 ml di coltura in un pallone monouso preriscaldato da 125 ml. Porre il pallone nel bagnomaria con agitazione a 37 °C.</li>
</ol>
4. Etichettatura a caccia di impulsi e irradiazione UV
NOTA: Il protocollo di etichettatura a caccia di impulsi e irradiazione UV ha molti passaggi che devono essere eseguiti in modo tempestivo e che richiedono una notevole organizzazione e preparazione anticipata. Tutti i reagenti e le provette devono essere facilmente accessibili. Di seguito viene presentato un protocollo per un esperimento con punti temporali di 0, 1 e 5 minuti.
<ol>
	<li>Al tempo 0:00 (min:sec) trasferire 25 ml di coltura in un matraccio da 125 ml.</li>
	<li>Al tempo 0:30 aggiungere 30 μCi/ml di amminoacidi radioattivi; agitare rapidamente per mescolare. Immergere il matraccio nel bagnomaria con agitazione a 37 °C.</li>
	<li>Al minuto 1:00 aggiungere 250 μl della soluzione 100 mM di metionina-cisteina; agitare rapidamente per mescolare.
	<ol>
		<li>Pipettare immediatamente 4 ml di coltura in uno dei pozzetti della piastra multipozzetto refrigerata che contiene ghiaccio. Pipettare una seconda aliquota da 4 ml nella provetta da 15 ml etichettata "0 min - UV". Rimettere il pallone nel bagnomaria.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alle ore 2:00 pipettare 4 ml di coltura nel secondo pozzetto della piastra multipozzetto raffreddata che contiene ghiaccio. Pipettare un'altra aliquota da 4 ml nella provetta da 15 ml etichettata "1 min - UV". Rimettere il pallone nel bagnomaria.</li>
	<li>Alle 6:00 pipettare 4 ml di coltura nel terzo pozzetto della piastra multipozzetto raffreddata che contiene ghiaccio. Pipettare un'altra aliquota da 4 ml nella provetta da 15 ml etichettata "5 min - UV".</li>
	<li>Posizionare il secchiello del ghiaccio con la piastra multipozzetto sotto la lampada UV preriscaldata e irradiare ogni campione singolarmente per 4 min. 
	NOTA: Negli esperimenti in cui i punti temporali sono distanziati di almeno 4 minuti l'uno dall'altro, ogni campione deve essere irradiato non appena viene pipettato nella piastra multipozzetto.</li>
	<li>Trasferire le cellule nelle provette refrigerate da 15 ml etichettate "0 min +UV", 1 min +UV", ecc.</li>
	<li>Centrifugare le celle a 2.500 x g per 10 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Risospendere ogni campione in 300 μl di terreno M9 o PBS e aggiungere 33 μl di acido tricloroacetico freddo (TCA) al 100% per precipitare le proteine. Centrifugare il TCA precipita in microfuga alla massima velocità per 10 minuti e rimuovere il surnatante. A questo punto i campioni possono essere conservati a - 20 °C.</li>
</ol>
5. Immunoprecipitazione e rilevamento di prodotti reticolanti
<ol>
	<li>Aggiungere 50 μl di tampone di solubilizzazione (15% di glicerolo, 200 mM di Trisbase, 15 mM di EDTA, 4% di SDS, 2 mM di PMSF) a ciascun campione e riscaldare agitando a 95 °C per 5 minuti per solubilizzare la proteina precipitata.</li>
	<li>Aggiungere 1 ml di tampone per il saggio di radioimmunoprecipitazione (RIPA) (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 1,0% Igepal CA-630, 0,5% desossicolato, 0,1% SDS) ed eseguire immunoprecipitazioni standard15 utilizzando da un quinto alla metà di ciascun campione. 
	NOTA: Igepal CA-630 (ottilfenil-polietilenglicole) viene utilizzato al posto di NP-40, che non è più disponibile in commercio. I due composti sono chimicamente indistinguibili.</li>
	<li>Risolvere le proteine immunoprecipitate mediante SDS-PAGE. Colorare, decolorare e asciugare i gel.</li>
	<li>Esporre i gel a uno schermo al fosforo O/N e rilevare le proteine radioattive (compresi i prodotti reticolanti) con un phosphorimager.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic code.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 225-249 (2006).</li>
<li>von Mering, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assessment+of+large-scale+data+sets+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comparative assessment of large-scale data sets of protein-protein interactions.</a> Nature. 417, 399-403 (2002).</li>
<li>Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+a+photocrosslinking+amino+acid+to+the+genetic+code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichia coli.</a> PNAS. 99, 11020-11024 (2002).</li>
<li>Farrell, I. S., Toroney, R., Hazen, J. L., Mehr, R. A., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-cross-linking+interacting+proteins+with+a+genetically+encoded+benzophenone%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Photo-cross-linking interacting proteins with a genetically encoded benzophenone.</a> Nat. Methods. 2 (5), 377-384 (2005).</li>
<li>Wittelsberger, A., Mierke, D. F., Rosenblatt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+ligand-receptor+interfaces%3A+approaching+the+resolution+limit+of+benzophenone-based+photaffinity+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol.+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">Mapping ligand-receptor interfaces: approaching the resolution limit of benzophenone-based photaffinity scanning.</a> Chem. Biol. Drug Des. 71, 380-383 (2008).</li>
<li>Ieva, R., Tian, P., Peterson, J. H., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+and+spatially+restricted+interactions+of+assembly+factors+with+an+autotransporter+beta+domain%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Sequential and spatially restricted interactions of assembly factors with an autotransporter beta domain.</a> PNAS. 108, 383-391 (2011).</li>
<li>Wang, F., Robbins, S., Guo, J., Shen, W., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+incorporation+of+unnatural+amino+acids+into+proteins+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Deiters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+amino+acids+with+novel+reactivity+to+the+genetic+code+of+Saccharyomycescerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharyomycescerevisiae.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 11782-11783 (2003).</li>
<li>Young, T. S., Ahmad, I., Brock, A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+repertoire+of+the+methylotrophic+yeast+Pichiapastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic repertoire of the methylotrophic yeast Pichiapastoris.</a> Biochemistry. 48 (12), 2643-2653 (2009).</li>
<li>Hino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+photo-cross-linking+in+mammalian+cells+by+site-specific+incorporation+of+a+photoreactive+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid.</a> Nat. Methods. 2 (3), 201-206 (2005).</li>
<li>Liu, W., Brock, A., Chen, S., Chen, S., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+incorporation+of+unnatural+amino+acids+into+proteins+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 4 (3), 239-244 (2007).</li>
<li>Leyton, D. L., Rossiter, A. E., Henderson, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+self+sufficiency+to+dependence%3A+mechanisms+and+factors+important+for+autotransporter+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">From self sufficiency to dependence: mechanisms and factors important for autotransporter biogenesis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 10 (3), 213-225 (2012).</li>
<li>Ieva, R., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+an+autotransporter+passenger+domain+with+BamA+during+its+translocation+across+the+bacterial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Interaction of an autotransporter passenger domain with BamA during its translocation across the bacterial outer membrane.</a> PNAS. 106, 19120-19125 (2009).</li>
<li>Pavlova, O., Peterson, J. H., Ieva, R., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+link+between+barrel+assembly+and+the+initiation+of+autotransporter+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Mechanistic link between barrel assembly and the initiation of autotransporter secretion.</a> PNAS. 110, (2013).</li>
<li>Harlow, D., Lane, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+D+%22Using+antibodies%3A+a+laboratory+manual%22">Using antibodies: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laborator Press. Cold Spring Harbor, NY. (1999).</li>
<li>Barnard, T. J., Dautin, N., Lukacik, N., Bernstein, P., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autotransporter+structure+reveals+intra-barrel+cleavage+followed+by+conformational+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Autotransporter structure reveals intra-barrel cleavage followed by conformational changes.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14 (12), 1214-1220 (2007).</li>
<li>Akiyama, Y., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SecY+protein%2C+a+membrane-embedded+secretion+factor+of+E.+coli%2C+is+cleaved+by+the+ompT+protease+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">SecY protein, a membrane-embedded secretion factor of E. coli, is cleaved by the ompT protease in vitro.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 167 (2), 711-715 (1990).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questo articolo descrive un metodo che combina la fotoreticolazione sito-specifica con l'etichettatura pulse-chase per esaminare la dinamica delle interazioni tra una proteina di interesse e altri componenti di una cellula vivente. Il metodo è particolarmente utile per studiare processi a più fasi in cui la proteina interagisce in sequenza con altri fattori. A differenza dei tradizionali approcci chimici di reticolazione, la fotoreticolazione sito-specifica fornisce informazioni dettagliate sullo stato dei singoli segmen...

Spesso è essenziale identificare e caratterizzare le interazioni tra una proteina di interesse e altri componenti cellulari per definire il suo ruolo in un percorso biologico, per comprenderne l'assemblaggio o per chiarire il suo meccanismo d'azione. Un'ampia varietà di approcci è comunemente utilizzata per studiare le interazioni proteina-proteina, ma tutti hanno i loro limiti. Il metodo più semplice e imparziale per identificare le proteine che si legano a una proteina di interesse è la copurificazione (o coimmunoprecipitazione), ma questo approccio richiede che un complesso proteico rimanga intatto durante la procedura di purificazione. Le interazioni proteiche deboli o transitorie possono essere stabilizzate attraverso la reticolazione chimica, ma questo metodo richiede tipicamente l'uso di composti che legano le proteine attraverso ammine primarie che sono ampiamente sparse nella sequenza proteica. Possono essere generati modelli di reticolazione complicati e difficili da interpretare, soprattutto quando le proteine di interesse sono componenti di complessi multiproteici. Inoltre, poiché i bracci spaziatori dei reticolanti chimici generalmente superano i 10 Å di lunghezza, i legami covalenti possono essere formati con proteine che si trovano in prossimità ma non interagiscono direttamente con la proteina di interesse, ma non interagiscono direttamente con essa. Anche metodi come la cromatografia di affinità e gli screening a due ibridi sono spesso utili per identificare le interazioni proteina-proteina. Il primo approccio, tuttavia, richiede la riproduzione di condizioni che promuovono interazioni fisiologicamente significative e non possono essere utilizzate per rilevare interazioni deboli. Quest'ultimo approccio richiede che le interazioni di legame possano essere replicate nell'organismo ospite e siano mantenute quando una proteina di interesse e i suoi partner di legame vengono inseriti nel contesto di una proteina di fusione. I metodi a due ibridi tendono anche a generare risultati falsi positivi2. Una volta stabilita un'interazione proteina-proteina, è spesso necessario un lavoro considerevole per mappare il sito di interazione. Forse lo svantaggio più significativo degli approcci tradizionali è che non forniscono alcuna informazione sulla sequenza temporale delle interazioni intermolecolari o sulla cinetica del legame.
Questo articolo descrive un metodo semplice che supera alcuni dei limiti di altri approcci utilizzati per studiare le interazioni proteina-proteina. Inizialmente una singola mutazione ambra viene introdotta nel gene che codifica per una proteina di interesse. Il mutante ambra è quindi coespresso con un tRNA soppressore dell'ambra e un ammino-acil-tRNA sintetasi derivato da Methanococcus jannaschii che sono stati ingegnerizzati per incorporare l'analogo dell'amminoacido fotoattivabile p-benzoililalanina (Bpa) solo ai codoni ambrati3. L'irradiazione di cellule con luce ultravioletta (UV) a lunga lunghezza d'onda (~365 nm) facilita quindi la formazione di un legame covalente tra Bpa e proteine che si trovano entro ~3-8 Å4,5. In alcuni contesti sperimentali, possono anche formarsi legami incrociati tra Bpa attivato e componenti non proteici di cellule come lipidi e acidi nucleici6. Le molecole che terminano nel codone ambrato dovrebbero generalmente essere facilmente distinguibili dalla proteina a lunghezza intera su SDS-PAGE e non possono essere reticolate con altre proteine. Sottoponendo le cellule alla radiomarcatura pulse-chase prima del cross-linking e quindi all'immunoprecipitazione o ai prodotti di cross-linking purificanti per affinità, è possibile stabilire la sequenza e la durata delle interazioni proteina-proteina. La capacità di generare informazioni temporali sulle interazioni intermolecolari è particolarmente preziosa per studiare la progressione di una proteina di interesse attraverso qualsiasi assemblaggio multistep ordinato, traffico o via di segnalazione e per identificare gli intermedi della via. Come il cross-linking chimico, il cross-linking sito-specifico rileva le interazioni proteina-proteina che si verificano in condizioni fisiologiche, ma l'introduzione di un cross-linker in una singola posizione facilita l'analisi delle interazioni tra i singoli segmenti di una proteina e altri fattori. Questa caratteristica unica del cross-linking sito-specifico è particolarmente vantaggiosa quando la proteina di interesse ha più segmenti o domini che hanno il potenziale di interagire con partner di legame distinti. Inoltre, il cross-linking sito-specifico può essere utilizzato in combinazione con metodi come la spettrometria di massa per mappare con precisione i residui che mediano le interazioni proteina-proteina. Sebbene questo metodo sia ottimizzato per l'uso in E. coli, l'incorporazione di analoghi fotofruttiferi di amminoacidi nelle proteine mediante soppressione dell'ambra è stata riportata in Mycobacterium, lievito e cellule di mammifero7-11. Pertanto, in linea di principio, il nostro metodo può essere utilizzato in altri sistemi.
Abbiamo utilizzato ampiamente questo metodo per identificare le interazioni intermolecolari che facilitano la biogenesi di EspP, un fattore di virulenza O157:H7 di E. coli. L'EspP è un membro di una superfamiglia di proteine note come "autotrasportatori" che contengono un grande dominio extracellulare N-terminale ("dominio passeggero") e un dominio aC-terminale ("dominio b") che si ripiega in una struttura cilindrica b barrel e ancora la proteina alla membrana esterna (OM)12. Il meccanismo con cui il dominio del passeggero viene traslocato attraverso l'OM è stato un mistero di lunga data. Come tutte le proteine della superficie cellulare batterica, l'EspP deve essere trasportata attraverso la membrana interna, trasportata attraverso il periplasma (lo spazio tra la membrana interna ed esterna) e indirizzata all'OM in una serie di eventi ordinati. A seguito della sua traslocazione attraverso l'OM, anche il dominio passeggero EspP viene separato dal dominio b da una scissione proteolitica e rilasciato dalla superficie cellulare. Combinando il cross-linking sito-specifico con la radiomarcatura pulse-chase, abbiamo dimostrato che entrambi i domini della proteina interagiscono inizialmente con il chaperone molecolare Skp nel periplasma6. Successivamente, segmenti discreti del dominio b interagiscono in modo stereospecifico con i componenti di un eterooligomero chiamato complesso Bam, che catalizza l'integrazione delle proteine b barrel nell'OM batterico attraverso un meccanismo sconosciuto. Forse la cosa più interessante è che abbiamo scoperto che il dominio del passeggero è in contatto con una delle subunità del complesso Bam (BamA) mentre attraversa l'OM13. I nostri risultati ci hanno permesso di costruire un modello dettagliato per l'assemblaggiodell'autotrasportatore 14 e hanno implicato il complesso Bam nel trasporto del dominio passeggeri attraverso l'OM.

<table><tbody><tr><td>QuikChange II Kit per mutagenesi sito-specifica</td><td>Agilent</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>BPA (H-p-Bz-Phe-OH)</td><td>Bachem</td><td>F-2800</td><td></td></tr><tr><td>TRAN35S-LABEL, reagente per marcatura metabolica (35S-L-metionina e 35S-L-cisteina, >1.000 Ci/mmol)</td><td>MP Biomedicals</td><td>51006</td><td></td></tr><tr><td>Spectroline SB-100P Lampada UV ad altissima intensità, 365 nm</td><td>Spectronics Corporation</td><td>SB-110P</td><td></td></tr><tr><td>Lampadina di ricambio per spettrolina 100S</td><td>Spectronics Corporation</td><td>11-992-15</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale Falcon</td>, <td>353046</td><td></td>da <td>laboratorio Becton Dickinson</td> a 6 pozzetti</tr><tr><td>Pallone monouso da 125 ml</td><td>Corning</td><td>430421</td><td></td></tr><tr><td>Innova 3100 Bagno d'acqua agitante</td><td>Nuovo Brunswick Scientific</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoraggio parte dell&#39;assemblea di una secreted batterica virulence factor uso site-specific reticolazione

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

Questo articolo descrive un metodo per rilevare e analizzare le interazioni dinamiche tra una proteina di interesse e altri fattori in vivo. Il nostro metodo si basa sulla tecnologia di soppressione dell'ambra originariamente sviluppata da Peter Schultz e colleghi1. Una mutazione ambra viene introdotta per la prima volta in un codone specifico del gene che codifica per la proteina di interesse. Il mutante ambra è quindi espresso in E. coli insieme a geni che codificano per un tRNA soppressore dell'ambra e un ammino-tRNA sintetasi derivato da Methanococcus jannaschii. Utilizzando questo sistema, l'analogo dell'amminoacido fotoattivabile p-benzoilfenilalanina (Bpa) viene incorporato nel codone ambrato. Le cellule vengono quindi irradiate con luce ultravioletta per legare in modo covalente il residuo di Bpa alle proteine che si trovano entro 3-8 Å. La fotoreticolazione viene eseguita in combinazione con la marcatura a inseguimento di impulsi e l'immunoprecipitazione della proteina di interesse al fine di monitorare i cambiamenti nelle interazioni proteina-proteina che si verificano in una scala temporale da secondi a minuti. Abbiamo ottimizzato la procedura per studiare l'assemblaggio di un fattore di virulenza batterico che consiste di due domini indipendenti, un dominio integrato nella membrana esterna e un dominio traslocato nello spazio extracellulare, ma il metodo può essere utilizzato per studiare molti processi di assemblaggio e percorsi biologici diversi sia nelle cellule procariotiche che in quelle eucariotiche. In linea di principio, i fattori interagenti e anche i residui specifici di fattori interagenti che si legano a una proteina di interesse possono essere identificati mediante spettrometria di massa.

Abbiamo utilizzato il photocrosslinking sito-specifico per identificare le proteine che interagiscono con EspP durante il suo tragitto verso la membrana esterna (OM). Negli esperimenti qui mostrati, i codoni di fenilalanina nei residui 1113 e 1214 sono stati sostituiti con codoni ambra. Entrambe le posizioni si trovano nel dominio β, che si integra nella membrana esterna e funge da ancoraggio di membrana. La struttura cristallina del dominio β di EspP16 mostra che i due residui si trovano sul lato periplasmati...

Questo articolo illustra l'uso della marcatura radio a caccia di impulsi in combinazione con la fotoreticolazione sito-specifica per monitorare le interazioni tra una proteina di interesse e altri fattori in E. coli. A differenza dei tradizionali metodi chimici di reticolazione, questo approccio genera "istantanee" ad alta risoluzione di un percorso di assemblaggio ordinato in una cellula vivente.

Monitoraggio parte dell&#39;Assemblea di una Secreted batterica Virulence Factor Uso site-specific reticolazione

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è esaminare la dinamica delle interazioni tra proteine all'interno di una cellula vivente. Questo viene ottenuto innanzitutto esprimendo una proteina di interesse in e coli, incorporando l'amminoacido analogo benzoyl fenil alanina nella proteina in una posizione specifica ed eseguendo un marcaggio radioattivo di tipo pulse-chase per etichettare una piccola popolazione di molecole proteiche sintetizzate in modo sincrono. Come secondo passaggio.Aliquote di cellule raccolte in diversi punti temporali durante il chase vengono irradiate per indurre la formazione di legami covalenti tra la proteina di interesse e qualsiasi fattore con cui interagisce. Successivamente, le proteine vengono immunoprecipitate con anticorpi specifici e separate mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide in presenza di SDS al fine di identificare i fattori interagenti. I risultati ottenuti mostrano variazioni nelle interazioni tra la proteina di interesse e altri fattori intracellulari nel tempo, basate sui cambiamenti nella mobilità elettroforetica dei prodotti di cross-linking. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'immunoprecipitazione congiunta o il cross-linking chimico, è la capacità di generare informazioni temporali sulle interazioni che avvengono tra un residuo specifico di una proteina di interesse e altre molecole.Tali dati sono particolarmente preziosi quando si studia il progresso di una proteina attraverso un percorso di assemblaggio multiplo e per identificare gli intermedi di assemblaggio. Sebbene questo metodo sia stato ottimizzato per l'uso in e coli, può essere utilizzato anche in altri sistemi, inclusi altri batteri, lieviti e cellule di mammifero. I dettagli sulla preparazione delle colture sono disponibili nel protocollo testuale.Preparare brevemente cinque millilitri di mezzo M nine contenente lo 0,2% di glicerolo, tutti gli amminoacidi el eccetto metionina e cistina, e antibiotici. Avviare colture notturne aggiungendo *E. coli* trasformati con un plasmide che codifica per la proteina di interesse con una mutazione ambra e il plasmide che codifica per il sistema di soppressione ambra. Incubare a 37 gradi Celsius. Il giorno dell'esperimento, aggiungere una quantità appropriata di cellule dalla coltura notturna in un matraccio Erlenmeyer da 250 millilitri contenente 50 millilitri di mezzo M nine e antibiotici per ottenere una densità ottica a 550 nanometri di 0,03. Incubare le colture a 37 gradi Celsius in un bagno d'acqua agitato.Quando le colture raggiungono la fase logaritmica iniziale o intermedia, aggiungere 50 microlitri di benzil fenilalanina uno molare o BPA a ciascuna coltura. Aggiungere la BPA una goccia alla volta mescolando delicatamente il matraccio per evitare la precipitazione. Successivamente, aggiungere qualsiasi induttore necessario per attivare l'espressione del mutante amber.Continuare a incubare le colture a 37 gradi Celsius per ulteriori 30 minuti durante il periodo di induzione di 30 minuti. Etichettare sei provette monouso da 15 millilitri con il punto temporale e con "più UV" o "meno UV". Posizionare le provette etichettate sul ghiaccio.Posizionare una piastra per colture cellulari a sei pozzetti sopra un secondo contenitore riempito di ghiaccio. Accendere la lampada a raggi UV cinque minuti prima dell'etichettatura radioattiva. Quindi aggiungere circa due millilitri di ghiaccio a ciascun tubo etichettato come meno UV e a due dei pozzetti della piastra multipozzetto.È fondamentale soffiare ghiaccio direttamente nei tubi e nelle pozzette per arrestare immediatamente le reazioni intracellulari in ogni punto temporale, ottenendo così un'istantanea accurata del percorso biochimico al termine del periodo di induzione di 30 minuti. Trasferire 25 millilitri della coltura in un becher Erlenmeyer monouso da 125 millilitri preriscaldato. Posizionare il becher nel bagnomaria agitato a 37 gradi Celsius.I passaggi dell'etichettatura con impulso e caccia e dell'irradiazione UV devono essere eseguiti tempestivamente e richiedono un'organizzazione accurata e una preparazione avanzata. Aggiungere 30 microcurie per millilitro di metionina e cisteina marcate con S 35 alla coltura e agitare rapidamente per mescolare al tempo di un minuto zero secondi.Aggiungere 250 microlitri di una soluzione non radioattiva di metionina-cisteina 100 millimolare e mescolare rapidamente. Per eseguire immediatamente il prelievo, trasferire con pipetta quattro millilitri della coltura in una delle pozzette della piastra multi-pozzetta refrigerata contenente ghiaccio; pipettare un secondo aliquota di quattro millilitri nel tubo da 15 millilitri etichettato zero minuti senza UV al tempo. Due minuti zero secondi.Trasferire con pipetta quattro millilitri della coltura in un secondo pozzetto della piastra multi-pozzetto refrigerata contenente ghiaccio. Successivamente, pipettare un altro aliquota di quattro millilitri nel tubo da 15 millilitri etichettato un minuto meno UV immediatamente prima del punto temporale di cinque minuti, aggiungendo circa due millilitri di ghiaccio a un terzo pozzetto della piastra multi-pozzetto ai tempi di sei minuti zero secondi. Pipettare quattro millilitri della coltura nel terzo pozzetto della piastra multi-pozzetto refrigerata contenente ghiaccio.Aggiungere un altro aliquote di quattro millilitri nel tubo da 15 millilitri etichettato cinque minuti meno uv. Posizionare il portaghiaccio con la piastra a multi-pozzetti sotto la lampada UV preriscaldata ed esporre ogni campione individualmente per quattro minuti. Trasferire le cellule nei tubi da 15 millilitri raffreddati etichettati zero minuti più uv, un minuto più UV e così via.Quindi centrifugare le cellule a 2.500 × g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Ripesare ogni campione in 300 microlitri di mezzo M nine o PBS e 33 microlitri di acido tricloroacetico (TCA) al 100% freddo per precipitare le proteine. Centrifugare i precipitati di TCA in una microcentrifuga alla velocità massima per 10 minuti. Prima di rimuovere il soprannatante, aggiungere 50 microlitri di buffer di solubilizzazione a ciascun campione e riscaldare con agitazione a 95 gradi Celsius per cinque minuti per solubilizzare la proteina precipitata.Dopo aver aggiunto un millilitro di buffer per saggio di immunoprecipitazione radioattiva, eseguire immunoprecipitazioni standard utilizzando da un quinto alla metà di ciascun campione. Risolvere le proteine immunoprecipitate mediante elettroforesi in gel di poliacrilammide contenente dodecilsolfato di sodio o SDS-PAGE. Infine, esporre i gel colorati e essiccati a una pellicola fosforescente per tutta la notte e rilevare le proteine radioattive, inclusi i prodotti di cross-linking, mediante un lettore fosforescente. Il cross-linking fotoinducibile sito-specifico è stato utilizzato per identificare le proteine che interagiscono con ESPP durante il suo tragitto verso la membrana esterna.Per questo esperimento, i codoni di alanina in corrispondenza dei residui 1113 e 1214 del dominio beta di ESPP sono stati sostituiti con codoni Amber. La struttura cristallina del dominio beta di ESPP mostra che entrambi i residui si trovano sul lato periplasmatico del beta barile, distanti circa 120 gradi. Due diversi polipeptidi sono stati immunoprecipitati sia da cellule irradiate che da cellule di controllo utilizzando siero anti-ESPP C-terminale.Inizialmente, una forma precursoria del protein di circa 135 kilodalton che contiene i domini passeggero e beta legati covalentemente predominava in fasi temporali successive. Il livello di PRO ESPP diminuì e il dominio beta libero iniziò a predominare man mano che il dominio passeggero veniva traslocato attraverso la membrana esterna e separato dal dominio beta mediante un taglio proteolitico. I campioni irradiati con UV I, tuttavia, presentavano chiaramente bande di peso molecolare più elevato che non erano presenti nei campioni di controllo.Queste bande derivano dalla formazione di legami incrociati tra PRO ESPP e proteine interagenti; in base alla mobilità di questi polipeptidi, sono state stimate le dimensioni delle proteine interagenti per verificare se potessero corrispondere a fattori noti di assemblaggio delle proteine della membrana esterna. Sono state eseguite ulteriori immunoprecipitazioni utilizzando anticorpi anti-cera prodotti contro i presunti partner interagenti. Un polipeptide di circa 150 chilodalton, osservato quando il BPA era incorporato sia al residuo 1113 che al 1214, è stato immunoprecipitato con un antisiero diretto contro la chaperonina periplasmatica di 17 chilodalton skip.Inoltre, abbiamo riscontrato che polipeptidi più grandi, osservati quando il BPA era incorporato in una sola delle due posizioni, potevano essere immunoprecipitati con anticorpi anti-cera contro le subunità del complesso BAM, rispettivamente BAM B e BAM D. Dopo aver eseguito questa procedura, i prodotti di cross-linking possono essere purificati e possono essere applicati altri metodi, inclusa la spettrometria di massa, per aiutare a identificare i fattori che interagiscono con una proteina di interesse. Dopo aver visionato il video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come combinare con successo la marcatura pulse-chase con il photo-cross-linking sito-specifico per studiare la dinamica delle interazioni della propria proteina di interesse con altre molecole all'interno della cellula vivente.

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