Name: Analisi di architetture di proteine e complessi proteina-ligando mediante spettrometria di massa strutturale integrativa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Scopri l'analisi di complessi proteici e interazioni con ligandi mediante spettrometria di massa nativa. Questa tecnica rapida e sensibile permette di studiare macromolecole biologiche nei loro stati nativi.

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Vorremmo ringraziare Peter Karl Hopfner e Robert Thomas Byrne per campioni di proteine fornendo gentilmente di HerA e HerA-NurA e per il loro aiuto con disegno sperimentale. Ringraziamo anche Dr. Eamonn Reading per la sua revisione del manoscritto. Noi riconosciamo con gratitudine i nostri organismi di finanziamento: Wellcome Trust [109854/Z/15/Z] e Royal Society [RG150216 a A.P.].

Conflitti di interesse non dichiarati.

MS sta giocando un ruolo sempre più importante nel caratterizzare la stechiometria, interazioni e l'architettura di subunità dei complessi della proteina. IM-MS dati possono essere utilizzati a definire modalità topologica di unità secondarie all'interno di complessi multicomponente. Rispetto ad altri metodi di biologia strutturale esistente, MS ha diversi vantaggi. Nativa MS è una tecnica rapida e altamente sensibile e può essere utilizzata per campioni eterogenei della proteina della sonda. Quando accoppiato con esperimenti di rottura in soluzione, vie di dissociazione delle assemblee della proteina possono essere monitorate. Insieme ai modelli di omologia o strutture di cristallo, le informazioni offerte da MS strutturali offre uno strumento per lo studio di interazioni proteina-ligando e fornire modelli quasi nativa e assemblaggio vie11.
Qui, descriviamo le procedure sperimentali necessarie per analizzare la stechiometria e la composizione delle interazioni proteina-ligando, con uno o più ligandi, usando MS integrativa. Questo include la preparazione del campione di MS, acquisizione dati, analisi dei dati e l'integrazione dei dati di MS utilizzando strumenti computazionali. Per fare questo, abbiamo usato il DNA-resezione HerA-NurA etero-oligomeri proteina complessa, legata a tre ligandi (DNA, ATP e ADP), come il nostro sistema di modello. Il protocollo viene illustrato l'utilizzo del software attualmente disponibile per facilitare la presentazione e l'analisi dei dati.
L'acquisizione di spettri di alta qualità è importante per l'analisi di associazione del ligando, quindi, la procedura di preparazione del campione attento è critica, purificazione della proteina, titolazione del ligando e del cambio di buffer. Una limitazione di nESI nativa MS quando si studia il grippaggio del ligand è legame non specifico. Legame non specifico si verifica durante la gocciolina desolvatazione durante tutto il processo di electrospray. Questo aumenta la concentrazione del ligando e quindi altera il rapporto proteina/ligando29. L'associazione di nucleotidi si traduce in una relativamente piccola differenza di massa tra apo e proteina del nucleotide-che non altera l'ionizzazione efficienza50,51.
Abbiamo usato il sistema MS G2-Si Synapt per il nostro lavoro, ma i protocolli sono applicabili per le indagini differenti di altri complessi proteina-ligando utilizzando altri spettrometri di massa di nano-electrospray commercialmente disponibili. Integrativa MS strutturali sempre più sta giocando un ruolo importante nell'affrontare problemi biologici di maggiore complessità. Il flusso di lavoro e le tecniche qui descritte sono particolarmente adatti per capire le conseguenze strutturali e la costruzione di meccanismi di complesso di proteine e formazione di proteina-ligando che altrimenti sono difficili da studiare tecniche strutturali convenzionali .

Analisi di spettrometria nativo di proteine intatte e loro complessi viene effettuata utilizzando electrospray e nano-electrospray ionizzazione (nESI), che conservano il protein folding e interazioni non-covalenti durante il processo di ionizzazione1, 2. In nativa MS, la struttura delle proteine e dei loro complessi vengono mantenute in uno stato quasi nativa in fase gas3,4. MS nativa rileva più ioni di carica della proteina, che sono separati secondo la loro massa per caricare il rapporto (m/z) permettendo la massa della proteina o proteina-ligando complesso da calcolare. Questa informazione consente la determinazione della stechiometria di una proteina intatta, composizione in subunità, grippaggio del ligand e interazione reti3,4,5,6. MS nativa ha diversi vantaggi rispetto ad altre tecniche di questo tipo di spettroscopia cristallografia a raggi x e risonanza magnetica nucleare5. In primo luogo, nativa MS è una tecnica rapida e altamente sensibile, che richiedono solo pochi microlitri (2-3 µ l) di campione a concentrazioni relativamente basse di complesse finale nell'alto nM a µM bassa gamma6. In secondo luogo, MS nativa consente di interrogare i campioni proteici eterogenei che permette di analizzare simultaneamente più proteine e Stati oligomerici. In terzo luogo, nativa MS non richiede campioni proteici da modificare prima dell'analisi di reticolazione chimica o proteina etichettatura. Questi vantaggi hanno reso strutturale MS un potente strumento per l'indagine strutturale dei complessi della proteina.
MS nativa combinabile con mobilità dello ione (IM), una tecnica che misura il tempo di che un ione di proteine porta a viaggiare attraverso un campo elettrico, consentendo la sezione trasversale collisionale (CCS) deve essere determinato. Il CCS fornisce informazioni strutturali a bassa risoluzione, che consente di topologia e informazioni di eterogeneità conformazionale di proteine per essere ottenuti. Inoltre, permette l'esame dei modelli strutturali della proteina generata da approcci computazionali.
Stabilità proteica fase gassosa può essere indagata mediante collisione indotta dispiegarsi (CIU) misurata da IM-MS. Durante il processo di CIU, proteina ioni sono accelerati e attivati attraverso una maggiore accelerazione collisioni con un gas inerte buffer all'interno di una spettrometro di massa7,8,9. Questo processo di attivazione collisionale fa sì che la proteina parzialmente spiegare, che si traduce in un aumento in CCS. Questo cambiamento di CCS e l'energia necessaria per spiegare la proteina può essere misurata IM-MS. utilizzando questo approccio, l'effetto del ligando sulla stabilità della proteina può essere misurato10. Subcomplexes può essere generato in soluzione mediante metodi di perturbazione in soluzione come l'aggiunta di solventi organici per monitorare nativo-come topologie dei complessi della proteina. Rottura dei complessi proteici è pricipalmente dovuto la rottura di interazioni non-covalenti intra. I sub-complessi mantengono nativo-come topologie e, al momento del rilevamento di MS, rivelano informazioni sulla connettività di inter-unità secondaria.
Approcci integranti in biologia strutturale combinano diversi metodi per studiare la struttura e la dinamica delle proteine e loro complessi3,4,5,6. Nativo di MS e IM-MS sono stati utilizzati per scoprire i dettagli molecolari di sistemi biologici impegnativi. Ci sono stati diversi esempi di applicazioni compreso lo studio di proteine Assemblea vie11,12,13,14, studiando l'interazione proteina-proteina reti15 , 16 , 17, membrana proteine6,18,19,20,21e delle interazioni proteina-ligando quali acidi nucleici22,23 ,24.
Tuttavia, MS nativa ha anche i suoi limiti. Nativo MS misure sono spesso eseguite nei buffer di volatili quali l'acetato di ammonio acquoso in cui alcune proteine non manterranno il loro stato nativo piegato3,25. Tuttavia, il lavoro recente ha indicato che questa limitazione può essere superata da ottimizzazione di spruzzatura diametro della punta dell'ago (punte di 0,5 mm) tale che proteine e ioni complessi della proteina possono essere formati direttamente da buffer non volatile con alta forza ionica che meglio imitare l' ambiente fisiologico26. Inoltre, MS nativa utilizza electrospray per ionizzare e trasferimento non-covalente assembly da soluzione a fase gassosa; Pertanto, la relativa abbondanza dei complessi rilevati non può interamente rappresentare che in soluzione5,27. Inoltre, in confronto alla soluzione, le interazioni idrofobiche di fase gas diventano più deboli e interazioni elettrostatiche diventano più forti e quindi favorito3,28.
In questo articolo, forniamo protocolli, analisi dei dati e interpretazione per identificazione delle proteine e ligand binding utilizzando MS nativa, IM-MS, CIU, rottura in soluzione e modellazione. Il complesso di riparazione del DNA, HerA-NurA, viene utilizzato come sistema modello. Rotture del doppio filamento del DNA (DSBs) sono una delle forme più citotossiche e deleteri di danno del DNA, con conseguente instabilità genetica e lo sviluppo finale del cancro in esseri umani. Ricombinazione omologa è il meccanismo di riparazione che sradica DSBs, un processo che è orchestrata da ATP dipendente helicase-nucleasi complessa, HerA-NurA22.
Combinando nativa MS e IM-MS con saggi funzionali e modellazione ha permesso l'indagine: i) il ruolo della Nurra nell'Assemblea, la conformazione e la stabilità del complesso, ii) l'interazione tra dsDNA e il complesso e la sua influenza sul globale stabilità del complesso e iii) la stechiometria e l'impatto di ATP binding sul Assemblea22. Nel complesso, questo lavoro ha portato a una migliore comprensione della base molecolare del complesso HerA-NurA collegando complessi cambiamenti conformazionali della proteina e la stabilità con l'associazione del nucleotide. Questo protocollo è generico per qualsiasi complex(es) di proteina che interagisce con uno o più tipi di ligandi.

<table><tbody><tr><td>Adenosina 5&prime;-(3-tiotrifosfato) sale di tetralitio</td><td>Merck Millipore</td><td>119120-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&prime;-difosfato&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20398-34-9</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di acetato di ammonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2706</td><td></td></tr><tr><td>Colonne per cromatografia Micro Bio-Spin</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204</td><td></td></tr><tr><td>Concentratore Vivaspin</td><td>Sartorius</td><td>Z614041-25EA</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246964</td><td></td></tr><tr><td>Water TraceSelect</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95305</td><td></td></tr><tr><td>Capillari borosilicati</td><td>Harvard Apparatus</td><td>300060</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi di architetture di proteine e complessi proteina-ligando mediante spettrometria di massa strutturale integrativa

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Le proteine sono un'importante classe di macromolecole biologiche che svolgono molti ruoli chiave nelle funzioni cellulari tra cui espressione genica, catalizzando reazioni metaboliche, la riparazione del DNA e la replica. Di conseguenza, una conoscenza dettagliata di questi processi fornisce informazioni critiche su come le cellule di funzione. Integrativa strutturale MS metodi offrono informazioni strutturali e dinamiche su assiemi complessi proteina, connettività complessi, stechiometria di subunità, oligomerizzazione di proteina e grippaggio del ligand. Gli avanzamenti recenti nella integrativa MS strutturali hanno consentito la caratterizzazione dei sistemi biologici impegnativi tra cui grandi proteine di legame del DNA e proteine di membrana. Questo protocollo descrive come integrare i diversi dati di MS come nativa MS e spettrometria di massa di mobilità dello ione (IM-MS) con simulazioni di dinamica molecolare per acquisire conoscenze in un DNA elicasi-nucleasi riparazione complesso proteico. L'approccio risultante fornisce un quadro per studi dettagliati del grippaggio del ligand di altri complessi proteici coinvolti in importanti processi biologici.

Nativo MS risultati hanno rivelato lo stato oligomerico, la composizione e la topologia del complesso HerA-NurA (Figura 1). Come interazioni non-covalenti sono conservati in fase gassosa, MS nativa di esperimenti di titolazioni di ADP e ATP-γ-S determinata l'associazione del nucleotide pairwise da HerA-NurA (Figura 2) e che l'aumento della concentrazione di ATP-γ-S aumenta la relativa intensità di esamerica HerA (Figura 3). Informazioni strutturali per quanto riguarda subunità interazioni sono state ottenute dalle interruzioni nella soluzione seguita da MS nativa e furono d'accordo con e masse teoriche (Figura 4 e tabella 1).
I valori sperimentali di CCS di proteine e loro complessi è stato derivato dagli esperimenti IM-MS (Figura 5). Questi valori sono gassoso rotazionale media calcoli della sezione trasversale della forma molecolare e descrivono lo stato dimensionale della proteina. Valori di CCS sono confrontati alle misure teoriche dalla cristallografia a raggi x e un buon accordo ne deduce che la forma nativa in conservati in fase gassosa (tabella 1). Questa convalida utilizzando i valori di CCS per la costruzione di modelli a bassa risoluzione delle proteine Assemblea48.
CCSs sperimentale può essere calcolato per ogni ione di stato di carica. Un modellatore di nativo-come proteina può dar luogo a dichiarano gli ioni di carica con valori simili di CCS. Tuttavia, gli ioni dello stato di carica superiori aumentato coulombiane repulsioni che possono portare a proteina fase gassosa dispiegarsi più grandi CCS valori e rispetto il CCSS teorica. Il valore di CCS del più basso stato di carica degli ioni sono quindi solitamente utilizzato49. Per HerA-NurA, esperimenti di rottura in soluzione su HerA e HerA-NurA con e senza DNA richiesto la generazione di un percorso di assembly a partire da monomeri poi formando l'intero esamerica HerA (HerA6)-dimerica NurA (NurA2) complesso con il DNA (Figura 6).
Differenze nelle trame dispiegarsi CIU la apo (senza legante) e ligando associato definiscono il cambiamento nella stabilità del complesso al grippaggio del ligand. Una maggiore CV50 o valore KECOM implica un più stabilizzato agli ioni in fase gassosa. Analisi diCOM di CIU e KE ha rivelato che DNA associato HerA-NurA è più stabile del complesso DNA-free (Figura 7Aii). Da analisi di CIU-MS nei rispettivi Stati di trifosfato di adenosina-legante, stato legato quattro-ATP-γ-S ridotta stabilità del complesso in fase gassosa e sei stato legato -ATP-γ-S dove sono tutti i siti è occupati era il più stabile (Figura 7Bii). MS nativa può rivelare il nucleotide discreto vincolano Stati di HerA; Tuttavia, non può distinguere quali subunità di HerA sono vincolanti ATP e dove si svolge questa associazione. Queste informazioni possono essere derivate da simulazioni MD solvente espliciti su esamerica HerA e il HerA-NurA seguendo il flusso di lavoro di sintesi (Figura 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig1.jpg"> Figura 1. Interrogando lo stato oligomerico, la composizione e la topologia del complesso non covalente HerA-NurA. (A) spettri di massa di HerA, HerA-NurA e HerA-NurA in presenza di DNA (DNA double-stranded di 15,4 kDa 25 bp). Il sub-complesso di HerA esiste come un hexamer sia un heptamer. NurA dimero si lega e a un hexamer HerA imponente oligomerici conversione. Il DNA lega il complesso formato di HerA - NurA (risultati adattati da Z. Ahdash et al., 201722). (B) relative intensità delle specie identificate sono calcolati utilizzando UniDec32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig2.jpg"> Nella figura 2. Nativo di ESI-MS rivela il meccanismo di associazione del nucleotide di HerA-NurA. Spettri di massa (A) HerA-NurA e (B) HerA-NurA-DNA con aumento delle concentrazioni di (i) ATP-γ-S e (ii) ADP. Masse misurate sono rispetto alle masse teoriche e la quantità di ATP-γ-S o ADP associato sono determinati. Masse misurate e numero di nucleotidi associati vengono visualizzati sugli spettri. Esperimenti di titolazioni ATP-γ-S e ADP determinato l'associazione pairwise del nucleotide di HerA-NurA da solo e quando nel complesso con il DNA che indica un meccanismo di reazione ciclica (risultati adattati da Z. Ahdash et al., 201722). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig3.jpg"> Nella figura 3. Misurare l'effetto di aumento delle concentrazioni di ATP-γ-S sullo stato oligomerico HerA. (A) spettri di massa di HerA all'aumento delle concentrazioni di ATP-γ-S. (B) grafico che mostra le intensità relative di specie diverse da nativa MS calcolata utilizzando UniDec deconvoluzione software32. La concentrazione di ATP-γ-S aumenta, aumenta anche l'intensità relativa di esamerica HerA. Numero di molecole di ATP-γ-S associato viene visualizzato sugli spettri (risultati adattati da Z. Ahdash et al., 201722). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig4.jpg"> Nella figura 4. Massa spettri e prodotti di dissociazione sub-complesso di HerA (A) e (B) HerA-NurA (i) da solo e in presenza di sequela (ii) del DNA di rottura nella soluzione. Sono stati eseguiti esperimenti di rottura nella soluzione utilizzando 10-40% di Acetonitrile, metanolo (MeOH) o solfossido dimetilico (DMSO) e ha provocato la formazione di vari subcomplexes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig5.jpg"> Nella figura 5. Distribuzioni di ioni mobilità arrivo tempo mostrate su un asse di CCS per complessi e sub-complessi generati. Icona per ogni sub-complessi in correlazione con quelli annotati su spettri nella Figura 4. Masse sperimentale e calcolate e valori di CCS di Sub-complessi sono elencati in tabella 1 che ha mostrato un accordo tra i valori sperimentali e calcolati (dopo aver considerato l'incertezza tipica nella risoluzione di viaggio dello ione dell'onda spettrometria totale mobilità di ± 5 - 8%37). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig6.jpg"> Nella figura 6. Via di assemblaggio del complesso HerA-NurA generato dalle interruzioni nella soluzione native cerchi MS e IM-signora colorate indicano condizioni dove è stata osservata ogni sub-complesso: nativo (verde, prima della rottura), metanolo (giallo), DMSO (viola) o Acetonitrile (rosso). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig7.jpg"> Nella figura 7. Studiando l'effetto stabilizzante di (A) DNA su HerA-NurA e (B) ATP binding a HerA-NurA-DNA. (i) gassoso CIU-MS trame e calcolo di energie (KEcom) (ii) centro-di-massa collisione mostrano che che la presenza di dsDNA stabilizza il complesso di HerA-NurA e che l'ATP-γ-S sei associato dello stato è il più stabile. Viene visualizzata la finestra di stabilizzazione per stati di carica differenti. Appezzamenti sono stati generati utilizzando PULSAR 33. Risultati da (A) adattati da Z. Ahdash et al., 201722. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig8.jpg"> Figura 8. Flusso di lavoro per le procedure di modellazione per simulazioni di dinamica molecolare differenziale. (A) generando il complesso sotto indagine dalla creazione della topologia da esistenti subunità e ricostruzione mancante residui. (B) flusso di lavoro per l'esecuzione di simulazioni di dinamica molecolare sulla proteina complessa con e senza legante. Sono simulazioni di dinamica molecolare correva per la proteina solo che agisce come un riferimento e che viene sottratto dalla simulazione della proteina più ligando. Questa è seguita da calcolare la fluttuazione differenziale medio quadrato della radice (RMSF) tra le simulazioni e determinare l'effetto del grippaggio del ligand. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Complessi / Sub-complessi</td>
			<td>Massa teorica (kDa)</td>
			<td>Massa sperimentale (kDa)</td>
			<td>CCS teorica (Å2)</td>
			<td>CCS sperimentale (Å2) [carica]</td>
			<td>Condizione HN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6- NurA2
</td>
			<td>416.22</td>
			<td>417.85</td>
			<td>14531</td>
			<td>14577 [42 +] 14599 [43 +] 14608 [44 +] 14637 [45 +]</td>
			<td>10-20% ACN, DMSO 10-40%, 10% MeOH</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6- NurA2- dsDNA</td>
			<td>431.72</td>
			<td>432.27</td>
			<td>-</td>
			<td>14661 [39 +] 14728 [40 +] 14781 [41 +] 14837 [42 +]</td>
			<td>ACN 10%, 10% MeOH</td>
		</tr>
<tr>
<td>NurA1
</td>
			<td>39.12</td>
			<td>38,18</td>
			<td>3254</td>
			<td>2618 [10 +] 2746 [11 +] 2878 [12 +]</td>
			<td>10-40% ACN, 10% MeOH, 20-40% DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>NurA2
</td>
			<td>78,24</td>
			<td>78.36</td>
			<td>4890</td>
			<td>4903 [16 +] 4614 [17 +] 4537 [18 +] 4666 [19 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, 20-40% DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA1
</td>
			<td>56,33</td>
			<td>56.32</td>
			<td>4131</td>
			<td>3647 [14 +] 3792 [15 +] 3950 [16 +]</td>
			<td>ACN DI 10-40%, 40% DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA2
</td>
			<td>112.66</td>
			<td>112.95</td>
			<td>6475</td>
			<td>5648 [20 +] 5747 [21 +] 5842 [22 +] 5996 [23 +]</td>
			<td>40% meth, ACN 10-40%</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA3
</td>
			<td>168.99</td>
			<td>169.39</td>
			<td>8607</td>
			<td>7501 [25 +] 7616 [26 +] 7717 [27 +] 7867 [28 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, CAN 10-40%, 40% DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA3 + DNA</td>
			<td>183.99</td>
			<td>184.976</td>
			<td>-</td>
			<td>7655 [26 +] 7990 [27 +] 8107 [28 +]</td>
			<td>10-30% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA4
</td>
			<td>225.32</td>
			<td>226.2</td>
			<td>10477</td>
			<td>9205 [30 +] 9287 [31] 9493 [32 +] 9961 [33 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, ACN 10-40%</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA4 + DNA</td>
			<td>240.82</td>
			<td>241.33</td>
			<td>-</td>
			<td>9637 [31 +] 9756 [32 +] 9830 [33 +]</td>
			<td>10-30% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA5
</td>
			<td>281.65</td>
			<td>282.75</td>
			<td>11853</td>
			<td>10847 [36 +] 10958 [37 +] 11161 [38 +]</td>
			<td>30-40% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6
</td>
			<td>337.98</td>
			<td>339.3</td>
			<td>12517</td>
			<td>12335 [38 +] 12386 [39 +] 12498 [40 +] 12590 [41 +] 12676 [42 +] 13019 [43 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, ACN 10-40%</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6 + DNA</td>
			<td>353,48</td>
			<td>354.626</td>
			<td>-</td>
			<td>12890 [40 +] 13081 [41 +] 13184 [42 +] 13273 [43 +] 13463 [44 +] 13576 [45 +]</td>
			<td>30% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA7
</td>
			<td>394,3</td>
			<td>395.85</td>
			<td>13901</td>
			<td>14154 [42 +] 14219 [43 +] 14261 [44 +] 14285 [45 +] 14335 [46 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, ACN 10-40%, 10-40% DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA7 + DNA</td>
			<td>409,8</td>
			<td>410.62</td>
			<td>-</td>
			<td>14414 [41 +] 14510 [42 +] 14558 [43 +] 14598 [44 +] 14630 [45 +] 14641 [46 +]</td>
			<td>10% ACN</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1. Masse sperimentale e calcolate e valori di CCS di HerA-NurA e suoi sub-complessi generato studi di rottura in soluzione forma.

Spettrometria di massa (MS) è emersa come un importante strumento per lo studio della struttura e dinamica di assembly macromolecolari. Qui, possiamo integrare approcci basati su MS per interrogare la formazione dei complessi della proteina e grippaggio del ligand.

Analisi di architetture di proteine e complessi proteina-ligando mediante spettrometria di massa strutturale integrativa

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Al giorno d'oggi la spettrometria di massa gioca un ruolo importante nella biologia strutturale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave su importanti macromolecole biologiche nel loro stato nativo, in particolare proteine e complessi proteici. La spettrometria di massa nativa è ampiamente applicabile a una varietà di gruppi biomolecolari tra cui sistemi multiproteina e acido nucleico.Il vantaggio principale di questa tecnica è che è rapida e altamente sensibile. Può essere utilizzato per interrogare campioni di proteine eterogenee, rendere possibile l'analisi simultanea di più proteine allo stato oligomerico. A dimostrare la procedura sarà Andy Lau, dottorando del mio gruppo.Per iniziare questa procedura, preparare i capillari internamente per la nanoelettrospray come delineato nel protocollo di testo. Preparare un campione privo di ligandi come controllo per ogni corsa come scambio di buffer in acetato di ammonio. Selezionare quindi la sensibilità, l'acquisizione di ioni positivi e le modalità TOF di mobilità.Attivare quindi i gas trap, API e IMS. Per la separazione istantanea utilizzare i punti di partenza dell'azoto e dell'argon mostrati qui e regolare se necessario. Impostare un intervallo di acquisizione m/z appropriato.Per una proteina sconosciuta i passaggi di ottimizzazione iniziali dovrebbero utilizzare un'ampia gamma. Inserire il capillare rivestito in oro in un supporto capillare. Quindi caricare tra due e tre microlitri della soluzione complessa proteica di interesse nel capillare.Stringere delicatamente il capillare e posizionarlo sullo stadio della sorgente elettrospray. Far scorrere il palco in posizione per iniziare ad acquisire dati. Applicare una bassa pressione del gas a flusso nanometrico fino a quando non si forma una goccia sulla punta del capillare.Spostare il capillare rispetto al cono e monitorare la corrente ionia per ottenere una corrente ionia stabile. Applicare una tensione capillare nell'intervallo compreso tra 0,9 e 1,6 kilovolt. Quindi impostare il cono di campionamento, l'offset della sorgente, la temperatura della sorgente e il flusso di gas del cono come delineato nel protocollo di testo.Per acquisire uno spettro di massa ben risolto e massimizzare la trasmissione degli ioni, regolare i parametri MS e monitorare il cambiamento risultante negli spettri. Impostare l'energia di collisione trappola su un punto iniziale di partenza compreso tra 10 e 50 volt. Se gli offset di tensione sono insufficienti, regolare le energie di collisione della trappola.Impostare la trappola attraverso la sua tensione su un punto di partenza iniziale compreso tra 20 e 45 volt. Migliorare la desolvazione ottimizzando questa tensione. Successivamente, ottimizza la velocità d'onda e l'altezza dell'onda come delineato nel testo per ottenere la migliore separazione della mobilità.Per gli studi che coinvolgono HerA e NurA utilizzare una velocità d'onda di 40 metri al secondo e un'altezza dell'onda compresa tra 550 e 650 volt. Per l'analisi del legame con il DNA, mescolare la proteina e il DNA con un rapporto molare che consente la formazione complessa di DNA proteico. Aggiungere quantità crescenti di uno dei seguenti, 5'O-3-tio-trifosfato, sale di tetralitio o ADP.Utilizzando un software appropriato misurare le masse delle specie generate e identificare il legame del ligando, come il legame ATP e ADP e gli stati oligomerici. Quindi utilizzare le intensità ionici osservate negli spettri ESI MS grezzi per quantificare la corrispondente abbondanza relativa di specie. Dopo aver ottimizzato le condizioni dello strumento per una trasmissione stabile, ridurre l'energia collisionale e il cono di campionamento il più basso possibile, pur mantenendo una buona qualità degli spettri.Utilizzare la velocità dell'onda ottimizzata e l'altezza dell'onda determinate in precedenza per acquisire la messaggistica istantanea. Misurare il tempo di deriva ionia a tre diverse velocità d'onda mantenendo la stessa altezza d'onda. Per determinare lo ione proteico CCS misurare quattro calibranti proteici, due con la massa al di sopra della proteina in esame e due con la massa sottostante, utilizzando le stesse condizioni di strumentazione. In primo luogo, preparare i campioni proteici e tampone scambiarli in acetato di ammonio come delineato nel protocollo di testo.Aggiungere solvente con incrementi del 10% fino a raggiungere la quantità desiderata. Incubare sul ghiaccio per un'ora. Successivamente, acquisire uno spettro IM-MS per ogni campione.Utilizzando il software SUMMIT, assegnare sottocomplessi proteici e generare reti di interazione proteica. In alternativa, generare manualmente un elenco di masse teoriche per le specie previste. Per iniziare a studiare la stabilità complessa delle proteine, registrare i dati IM-MS aumentando la tensione di accelerazione della trappola da 10 volt a 200 volt, che si svilupperà progressivamente verso la proteina e la fase gassosa.Analizza i dati utilizzando un software appropriato e genera grafici di dispiegamento bidimensionali impilando l'intensità delle distribuzioni CCS normalizzate ad ogni tensione di accelerazione per ogni stato di carica. I risultati nativi della SM rivelano lo stato oligomerico, la composizione e la topologia del complesso HerA e NurA. Poiché le interazioni non covalenti sono conservate nella fase gassosa, gli MS nativi degli esperimenti di titolazione ATP gamma S e ADP, sono usati per determinare il legame nucleotidico a coppie nell'HerA e nel NurA.Gli spettri di massa degli stati oligomerici di HerA rivelano che l'aumento della concentrazione di ATP gamma S aumenta l'intensità relativa dell'HerA esamerica. I valori sperimentali ccs per le proteine e i loro complessi sono quindi derivati dagli esperimenti IM-MS. Si vede che questi valori hanno un buon accordo con le misurazioni teoriche della cristallografia a raggi X, che convalida l'utilizzo di valori CCS per la costruzione di modelli a bassa risoluzione di assemblaggio proteico.L'analisi del CIU e del KEcom rivela che l'HerA-NurA legato al DNA è più stabile del complesso privo di DNA. L'analisi CIU MS e i rispettivi stati di legame ATP mostrano che i quattro stati legati atp gamma S riducono la stabilità complessa nella fase gassosa. Tuttavia, lo stato legato a sei ATP gamma S in cui tutti i siti sono occupati, è visto come il più stabile.Misurazioni accurate della massa molecolare di un complesso intatto forniscono preziose informazioni sulla caratterizzazione biomolecolare. Possiamo ottenere informazioni su percorsi di assemblaggio complessi, oligomerizzazione proteica e legame del ligando. La combinazione di tutte queste informazioni consente di generare modelli dettagliati di assemblaggi biologici funzionali.

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