TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification da popolazioni di cellule rare Drosophila Embrioni

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare l'RNA coinvolto nella traduzione in un modo specifico tipizzato in cellule in embrioni di drosofila. Ciò si ottiene raccogliendo prima gli embrioni da una linea di mosche transgenica, consentendo l'espressione specifica della subunità ribosomiale marcata con A GFP nel tipo di cellula bersaglio, in questo caso, le cellule muscolari cadenti. Il secondo passo consiste nel generare un lisato per ottenere una preparazione di polisomi contenente una miscela di ribosomi marcati e non marcati.

Successivamente, viene stimata la concentrazione proteica nel lisato e viene eseguita la purificazione per affinità con perline accoppiate ad anticorpi GFP per catturare i complessi di RNA ribosomiale dal tipo di cellula di interesse. La fase finale è dedicata al triolo, all'RNA, all'estrazione e alla purificazione. In definitiva, le valutazioni della qualità e della specificità vengono eseguite rispettivamente con un bioanalizzatore e R-T-Q-P-C-R.

L'RNA può quindi essere utilizzato per l'analisi quantitativa globale mediante sequenziamento dell'RNA o microarray. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto al nostro metodo esistente, come la selezione VX, è che non richiede una fase di dissociazione cellulare in laboratorio. Può essere eseguito su banco.

È veloce e consente l'identificazione diretta dell'RNA tradotto in una popolazione molto piccola di cellule, il che è un vantaggio per la comprensione dell'acquisizione delle proprietà cellulari. Anche se questo metodo può fornire informazioni sulla miogenesi nell'embrione di Josephine, può essere applicato anche ad altri tessuti o organismi moderni, come piante, zebre, pesci o topi, e potrebbe anche aiutare a seguire l'impatto del trattamento sulla sintesi proteica in caso di patologia. A dimostrare la procedura sarà Benjamin Berta, uno studente di dottorato del mio laboratorio Dopo l'ingegneria, entrambe le linee transgeniche secondo le istruzioni nella parte scritta del protocollo e l'incrocio per creare la trappola a doppia linea transgenica incrociata, amplificare la linea preparando prima otto grandi gabbie cilindriche di popolazione contenenti circa 40 grammi di giovani mosche per gabbia, che corrisponde a circa 180.000 mosche per gabbia.

Preparare piastre di Petri di 11 centimetri di diametro contenenti una miscela di agar agar solidificato e succo d'uva con un terzo della superficie coperta con pasta di lievito appena fatta, e lasciare che le mosche depongano le uova su queste piastre per un'ora. Ripetere questo processo su altri due set di piatti di succo d'uva fresco per consentire alle mosche di svuotare completamente i loro prodotti. I doppi embrioni transgenici desiderati dalla croce saranno deposti sulla quarta piastra.

Rimuovere le piastre contenenti gli embrioni desiderati dalle gabbie e lasciarli incubare fino allo stadio di sviluppo desiderato a temperatura ambiente. Qui viene utilizzata un'incubazione di 13 ore. Quindi risospendere il contenuto della lastra con circa 50 millilitri di acqua utilizzando un pennello.

Separare gli embrioni dalle mosche morte facendo passare il liquido attraverso tre setacci di diametro 700, 355 e 112 micron. Sciacquare gli embrioni raccolti nel setaccio di diametro più piccolo con l'acqua ionizzata. Immergere gli embrioni in candeggina al 4,5% in acqua ionizzata per due minuti, quindi risciacquare abbondantemente con acqua ionizzata per 30-60 secondi.

Incubare gli embrioni in PBS 0,01%T tra 20 e 100 microgrammi per millilitro. Cicloterapia per cinque-10 minuti a temperatura ambiente con agitazione. Dopo aver asciugato gli embrioni su fogli assorbenti di cellulosa, trasferirli in provette da microcentrifuga, quindi pesare le provette e cuocere al flash, congelare gli embrioni per immersione in azoto liquido.

In questa fase, gli embrioni essiccati possono essere conservati per diversi mesi a meno 80 gradi Celsius. Trend trasferisce 1,5 grammi di embrioni essiccati in provette pre-refrigerate da 15 millilitri, contenenti quattro millilitri di estrazione di polisomi, tampone e omogeneizzato. Utilizzando una pipetta sierologica sterile da 10 millilitri.

Quindi distribuire gli embrioni omogeneizzati in due provette da due millilitri e macinare gli embrioni in un macinatore multidirezionale ad alta velocità. Impostato per funzionare due volte per 10 secondi a 5.000 giri/min con una pausa di 15 secondi tra ogni ciclo. Dopo 10 minuti di centrifugazione a 2000 G, trasferire il lisato in una provetta da microcentrifuga fresca pre raffreddata su ghiaccio.

Aggiungere il 10% di non P 40 al surnatante S fino a una concentrazione finale dello 0,1% e mescolare delicatamente capovolgendo il tubo. Aggiungere 300 micromolari di DHPC a una concentrazione finale di 30 millimolari e mescolare delicatamente capovolgendo il tubo. Incubare la miscela con ghiaccio per cinque minuti, mescolando per inversione più volte durante l'incubazione.

A seguito dell'incubazione nel ghiaccio. Preparare il supinato post mitocondriale mediante centrifugazione a quattro gradi Celsius per 10 minuti a 20.000 G.Dopo aver misurato la concentrazione proteica con il metodo Bradford e aver ottenuto una concentrazione proteica compresa tra 60 e 80 milligrammi per millilitro, trasferire lo SNAT in una provetta da microcentrifuga fresca pre raffreddata e procedere immediatamente alla fase di preassorbimento. Risospendere le microsfere magnetiche con una leggera agitazione e poi trasferire 30 microlitri di perle per ogni millilitro di lisato in una provetta da microcentrifuga.

Raccogliere le perle sul magnete, pipettare la stecca e risospendere le perle e 500 microlitri di tampone per l'estrazione dei polisomi. Quindi, raccogli le perline sul magnete. Anche in questo caso, aggiungere l'embrione, il lisato e incubare per un'ora a quattro gradi Celsius su un rotatore.

Rimuovere le perle e mettere l'agente supino sul ghiaccio fino alla fase di immunopurificazione. Riservando 100 microlitri di supinato come campione globale di RNA per il confronto con il campione raccolto dopo l'immunopurificazione per immunopurificare il campione, aggiungere un millilitro di lisato preassorbito a una provetta priva di RNA contenente 90 microlitri di perle bloccate accoppiate all'anticorpo GFP. Incubare il campione a quattro gradi Celsius per due ore o durante la notte mescolando delicatamente un capo sopra l'altro in un rotatore di provette dopo l'incubazione.

Lavare le perline facendo girare prima le perline rimanenti in una mini centrifuga. Quindi raccogliere su un magnete risospendere in 500 microlitri di lavaggio, tamponare e incubare di volta in volta. Terminare la miscelazione per 10 minuti nella cella frigorifera e di nuovo, raccogliere le perline sul magnete.

Trasferire le perle in una nuova provetta priva di RNA R pre shield e lavare altre due volte. Infine, dopo aver raccolto le perle sul magnete, procedere all'estrazione dell'RNA aggiungendo un millilitro di TRIOL alle perle ed eseguendo l'estrazione secondo le istruzioni del produttore. Seguire questo con la pulizia dell'RNA, utilizzando un micro kit RNEZ secondo le istruzioni del produttore.

Per testare la specificità dell'RNA intrappolato, eseguire la trascrizione inversa su tre nanogrammi di RNA immunopurificato e in ingresso secondo le procedure standard. Quindi utilizzare il CDNA ottenuto per la QPCR con set di primer specifici per gene. Questa immagine confocale di un embrione allo stadio 16 mostra l'espressione di RPL 10 A-E-G-F-P, in particolare nelle sei cellule muscolari cadenti in ciascun segmento HEMI, si osserva la colocalizzazione di RPL 10 A-E-G-F-P con il marcatore muscolare generale beta tre tubulina.

L'RNA intrappolato è stato eseguito su un bioanalizzatore per scopi di controllo della qualità. Si noti la perfetta integrità di un RNA ribosomiale di otto s e due di otto s . Questa figura mostra i risultati di un'analisi RT QPCR su tre repliche biologiche di embrioni allo stadio 16 e dimostra l'elevata specificità dell'mRNA isolato con trappola.

La variazione di FO è stata calcolata rispetto all'input e normalizzata rispetto al gene RPL 32 metanfetamina. Due trascritti presenti in tutte le linee muscolari sono arricchiti di 2,3 volte rispetto all'input, mentre i trascritti slouch più ristretti sono le cellule neurali arricchite di 5,6 volte che esprimono prospero e i calzini e i geni sono impoveriti rispettivamente di 2,2 volte e 5,5 volte dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori, in particolare nel campo della biologia dello sviluppo, per esplorare l'impegno di auto-aiuto e l'acquisizione delle proprietà cellulari durante la differenziazione degli embrioni doof.