Name: Una piattaforma per lelaborazione di precisione Microfluidic piccola Volume del campione e il suo uso per Dimensione particelle biologiche separate con un Microdevice Acoustic (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Scopri la separazione automatizzata di particelle in piccoli volumi con un microdispositivo acustico per applicazioni di ingegneria biomedica. Questo metodo modulare garantisce precisione e robustezza nel processamento dei campioni.

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Questo lavoro è stato eseguito sotto gli auspici del Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti dal Lawrence Livermore National Laboratory sotto il contratto DE-AC52-07NA27344, e parzialmente supportato dal programma di ricerca e sviluppo diretto dal laboratorio (LDRD) di LLNL, 14-LW-077. Gli autori ringraziano Michael Wilson, Mark Stenglein e Joe DeRisi dell'Università della California, San Francisco, per aver generosamente fornito campioni di cellule GGV e Boa. EJF riconosce il sostegno del LLNL Lawrence Scholar Graduate Program. MS riconosce il supporto dell'UC Office of the President Lab Fees Research Program. LLNL-JRNL-665235

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo presenta l&#39;integrazione a livello di sistema di dispositivi microfluidici per attrezzature macroscala per eseguire l&#39;elaborazione automatizzata campione biologico. La modularità di questa piattaforma permette di essere adattabile a qualsiasi dispositivo flusso continuo, e, come esempio, il protocollo presentato concentra sulla caratterizzazione e ottimizzare le prestazioni di un dispositivo di separazione delle particelle acoustofluidic. Tre grandi vantaggi di questo protocollo sono evidenziati: (i) la modularità e chip-to-mondo interfacciamento, (ii) caratterizzazione affidabile di prestazioni del dispositivo, e (iii) il trattamento automatizzato dei volumi di campione precisamente misurate per la separazione di particelle. io. Modularità e chip-to-mondo interfacciamento Come mostrato in Figura 2, il chip microfluidico è montato su una basetta per misura facilmente su un palco microscopio per l&#39;osservazione diretta. Il tagliere contiene # 6-40 fori filettati UNF su una griglia di 5 mm a passo, enabling il chip da fissare, e le connessioni del fluido da effettuare. Le connessioni del fluido sono PEEK tubi con estremità lavorate, che tenuta contro il chip fluidico con una gomma faccia guarnizione di tenuta e un collare di acciaio inossidabile. Questo schema interfaccia rende per una facile sostituzione di chip e rapida riprogettazione dispositivo, che richiedono poche o nessuna modifica al altri componenti del sistema, impronte di chip forniti conformi al formato griglia. Ad esempio, abbiamo utilizzato questa piattaforma con chip microfluidici per elettroforesi a flusso continuo, lisi cellulare termico, 29 rapida miscelazione di reagenti per la sintesi chimica, e la cattura cella singola e interrogatori. ii. Caratterizzazione robusta di prestazioni del dispositivo Per ottimizzare le prestazioni di qualsiasi dispositivo di separazione microfluidi, il suo funzionamento deve prima essere accuratamente caratterizzata. Il sistema qui descritto supporta lo sviluppo di protocolli rapidi e automatici per farlo. Per il examp specificale di dispositivi acustici di messa a fuoco, la qualità di messa a fuoco, la frequenza di funzionamento, e la posizione delle particelle focalizzate nel canale microfluidica deve essere misurato per ogni singolo dispositivo. Queste misure richiedono spazzare attraverso una gamma di frequenze di trasmissione piezoceramico, tensioni e portate, per identificare le combinazioni ottimali dei parametri per la separazione di alta qualità. Il protocollo presentato varia automaticamente questi parametri sintonizzabili e cattura pertinente Data-ie, immagini fluorescenti di particelle che scorre nel canale che sono post-elaborati per generare le misure delle particelle richiesti focalizzazione qualità, frequenza, e la posizione (figura 3). Caratterizzazione completa delle prestazioni del dispositivo acustico richiede passaggi ripetuti 4.4 e 4.5, se necessario in diverse condizioni sperimentali. Ad esempio, la posizione di messa a fuoco assoluta di un chip è trovato eseguendo la scansione di frequenza a portate relativamente bassa e alta tensiones per garantire una completa migrazione alla posizione di nodo. Inoltre, tali scansioni frequenza possono valutare la qualità del montaggio del dispositivo (quando eseguito con perle di polistirene di dimensioni note), o per determinare come un tipo di particelle precedentemente sconosciuta si comporterà nel sistema (dopo un chip è stato caratterizzato con perline). Un chip con buon trasferimento di energia dal piezoceramico al canale microfluidico comporterà stretto focalizzazione a portate elevate (&gt; 1 ml / min) e bassa tensione (12-15 V pp), mentre quelli con scarso trasferimento di energia non si concentrerà anche a basse portate (&lt;100 l / min) e tensioni elevate (&gt; 20 V pp). Abbiamo scoperto che il contatto intimo tra il chip microfluidica e piezoceramico è fondamentale per un efficiente trasferimento di energia nel fluido. Ulteriori analisi del metodo ottimale incollaggio del chip microfluidico e piezoceramico consentirà produzione affidabile di dispositivi ad alte prestazioni. Infine, un completoimmagine di funzionamento di un dispositivo acoustophoretic può essere ottenuto combinando le misurazioni di scansione di frequenza basati su immagini di Fase 4 (e figura 3) con numeri di particelle raccolte dalla SPO e LPO come funzioni dei parametri operativi relativi, da esperimenti di separazione effettuate con microsfere , come descritto nel passaggio 5. Come mostrato in figura 6, una tale serie di esperimenti automatizzate può rapidamente caratterizzare le prestazioni di un singolo dispositivo e sintonizzabilità, informare l&#39;utente dello spazio ottimale parametro per azionare il dispositivo per la separazione di particelle. iii. Di trattamento automatizzato di piccolo-campione per la separazione di particelle Per l&#39;elaborazione del campione di successo e preciso basato su chip microfluidica, è fondamentale in modo affidabile e preciso metro, carico, consegnare, e raccogliere le quantità di liquidi che passano attraverso. Questa precisione è particolarmente importante quando il volume del campione è piccola(~ 0,1-1 ml), che è comune in laboratorio clinico o di ricerca. 30 precisa manipolazione del campione è impegnativo in esperimenti tradizionali microfluidici che impiegano ritiro manuale del campione in una siringa e l&#39;infusione in un dispositivo senza valutazioni di quando il campione è stata separata e quando devono essere raccolti. Il protocollo presentato impiega automatizzato campione bobina di carico e erogazione accoppiato con feedback in tempo reale da sensori di flusso per consentire separazioni riproducibili di piccoli volumi di campione. La Figura 5 mostra i profili di flusso misurata in SPO e LPO da un tipico esperimento separazione. Innanzitutto, portando tampone di almeno 35 microlitri viene caricato per garantire un flusso stabile prima che il campione raggiunge il chip acustica. Volumi di campione inferiori 100 pl non sono raccomandati per questa configurazione del sistema, perché diluizione del campione dovuta al buffer principale diventa eccessiva. Una spina di aria viene utilizzata all&#39;inizio del the iniezione prima che il buffer porta per separare la spina campione dal fluido che segue, impedendo la miscelazione e la diluizione del campione e servire come indicatore per i sensori di flusso. Dopo un transitorio iniziale come fluido comincia a muoversi attraverso il sistema, segnali spike taglienti in entrambe le uscite indicano il passaggio del primo bolla d&#39;aria. Questi transitori sono seguiti da un lungo periodo di flusso stabile come il campione scorre attraverso il sistema, poi un&#39;altra punta quando la seconda bolla d&#39;aria passa, e infine un eventuale calo di portata a zero dopo la pompa si ferma siringa. Il passaggio delle spine aria attraverso i sensori di flusso viene utilizzato come punti di innesco per commutare le valvole per avviare e arrestare la raccolta del campione, riducendo così al minimo campione perduta e diluizione con volumi di fluido non-campione. Ciclo chiuso misurazione di volumi di campione trasformati elimina la necessità di riprogrammare questi valori prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento ogni campione in ingresso viene cambiato. Questa caratteristica èparticolarmente importante quando il volume del campione è limitato, per esempio nel caso di molti campioni clinici. Monitoraggio del flusso in tempo reale aiuta anche nella risoluzione dei problemi; una cattiva esecuzione (ad esempio, uno zoccolo formando in uno dei punti vendita) è immediatamente evidente dai profili di flusso risultanti, come nella figura 5b. Per dimostrare la flessibilità e l&#39;efficacia della separazione acoustofluidic utilizzando l&#39;architettura del sistema presentato, DENV purificato e le riserve di virus GGV sono stati aggiunti in azioni di celle e separate da lavorazione attraverso il chip microfluidico. Figura 7a mostra che le cellule Raji erano ben separati-da virus, come 97 % di cellule Raji escono chip sono risultati essere in LPO, lasciando così un campione altamente arricchito di DENV nel SPO. In confronto, l&#39;efficienza della separazione DENV era inferiore, con il 70% di DENV uscita del chip trovato nel SPO. Ciò può essere attribuito alla leggera miscelazione convettiva indotto dalle spire della Separatisul canale, ma più probabile che alcune particelle DENV migrano insieme con le cellule Raji nel LPO. Cellule che migrano lateralmente attraverso linee di corrente trascinano un fluido con loro, anche a basso numero di Reynolds. Con questo meccanismo, così come aspecifico adsorbimento superficie, particelle virali trasferire nella LPO. Tuttavia, il campione altamente arricchito di DENV nel SPO è un vantaggio significativo, per esempio quando de novo sequencing è utilizzato per rilevare e identificare i virus. Figura 7b mostra che in una prova sperimentale, solo circa il 70% delle cellule Boa escono chip sono stati trovati nella LPO, rispetto a quasi il 100% di efficienza di separazione per cellule Raji. La differenza di prestazioni di separazione tra i due tipi di cellule può essere attribuibile a una dimensione più piccola o media densità inferiore di cellule Boa rispetto alle cellule Raji, quindi con conseguente forze acustiche più piccole. Per confermare o smentire queste ipotesi, le dimensioni, la densità e la morfologia di Boale cellule in sospensione (che normalmente crescere aderenti) di cellule Boa devono essere misurati con precisione, uno sforzo per ulteriori indagini. Negli stessi esperimenti, analogamente agli esperimenti con DENV, il grosso del GGV recuperato uscita dal SPO, indicando un arricchimento della frazione virale. I dati presentati evidenziano le sfide inerenti di ingegneria piattaforme di ampia applicazione per l&#39;elaborazione di una serie di campioni biologici. È importante sottolineare che le interazioni biologiche può cominciare a giocare come un grande ruolo gli effetti fisici e meccanici. Tuttavia, questi esperimenti preliminari dimostrano anche la potenza e la promessa di utilizzare questo sistema per la trasformazione dell&#39;architettura campione applicazioni cliniche e di ricerca. Come un robusto sistema progettato, ben caratterizzato, questa piattaforma offre la possibilità di cercare le risposte alle nuove questioni scientifiche.

Separazione del campione e frazionamento è una delle aree di applicazione più promettenti per le tecnologie microfluidici. Tali fasi di manipolazione del campione sono parte integrante per la diagnostica clinica, lo sviluppo efficaci terapie, gli sforzi Biosurveillance e progressi nella ricerca delle scienze della vita e della tecnologia. Una miriade di strategie di separazione microfluidica sono state dimostrate per il particolato e colloidi fluide in sospensione, così come per le specie chimiche e biologiche; diverse recensioni forniscono una panoramica delle recenti progressi e gli sviluppi in questi settori 1 - 9. Anche se molte di queste tecnologie di separazione microfluidica (di seguito denominati &quot;Core Devices&quot;) sono stati ampiamente caratterizzato, pochi studi hanno preso in considerazione il problema di separazione del campione a livello di sistema. I dispositivi core sono in genere singoli chip centimetri scala, interfacciati a tubi fluoropolimero, con fluido erogato da una pompa o pressione.Tuttavia, se la promessa di microfluidica - tra cui una maggiore automazione, affidabilità e riduzione dei volumi di campione - è di diventare realtà, almeno uno sforzo equivalente deve essere dedicata alla progettazione di un sistema di separazione completa in cui è integrato il dispositivo del centro . Inoltre, una grande sfida per gli approcci alla microfluidica biorilevazione è il macro al micro interfaccia. Questo si riferisce non solo alle connessioni fisiche &quot;mondo-truciolo&quot; di un dispositivo a microfluidi ai componenti macroscala, e per la mancata corrispondenza tra tipici volumi di campione clinico o analitico (~ 0,1-10 ml) e il volume interno di chip microfluidica (~ 0,01-10 microlitri), ma anche le limitazioni di campionamento statistico derivanti da colmare queste scale dimensionali. Questi problemi contribuiscono alla percezione che la pre-elaborazione e preparazione del campione sono il &quot;anello debole&quot; della biorilevazione. 10 La piattaforma descritta in questo lavoro taKES grandi passi verso affrontare queste sfide. In una prospettiva a livello di sistema, i dettagli di questo protocollo il trattamento affidabile di precisione-misurate volumi analitico scala (che variano da 0,15 a 1,5 ml) su scale temporali ~ 10 min. Si tratta di una operazione &quot;un solo pulsante&quot;: una volta che la fiala sorgente contenente le fiale di campione e di destinazione per la raccolta delle frazioni vengono inseriti nel sistema, il comando &quot;Esegui&quot; avvia la procedura, e tutte le fasi sono controllati dal computer. Alla fine di una corsa, le fiale di raccolta possono essere rimossi dal sistema di analisi valle delle frazioni separate. Il Device Core in questo sistema è un chip acoustophoresis che estrae (5-20 micron) particelle di cellule di mammifero dimensioni dal campione. Separazione Acoustophoretic è scelto qui soprattutto perché è high-throughput (fino a 100s di microlitri / min), senza etichetta e senza contatto, offrendo così vantaggi nel separare viru praticabileses dalle cellule che poche altre tecniche microfluidici possono eguagliare. La fisica della particelle acustico messa a fuoco sono stati ampiamente descritti, 11 - 13 e non sono il focus di questo protocollo, ma un breve riassunto dei concetti di base segue per aiutare a comprendere l&#39;applicazione alla separazione microfluidica. Ultrasuoni onde stazionarie risonanti in microcanali piene di liquido producono campi di pressione, che danno origine a forze che guidano le particelle verso i nodi di bassa pressione. La grandezza forza dipende dal volume della particella, e su un fattore di contrasto acustico derivante dai relativi densità e compressibilities della particella e il fluido di sospensione. 14 In quanto tale, concentrandosi acustico è ideale per la separazione delle cellule di dimensioni (~ 7-15 micron) da (~ 50-200 nm) particelle virus-dimensioni. Le particelle più grandi migrano verso un nodo di pressione; tuttavia, poiché l&#39;intensità della forza è molto piccolo perparticelle di dimensioni inferiori a 2-3 micron, queste piccole particelle o specie disciolte difficilmente muoversi. La nostra implementazione specifica di separazione acustica, come precedentemente descritto, 15 incorpora una parete sottile per suddividere il canale del fluido e permette sintonizzabile, posizionamento asimmetrico della posizione di messa a fuoco. Questo aggiunge flessibilità nella progettazione di dispositivi, e dei benefici, tra cui una maggiore qualità delle prestazioni di separazione e la velocità sono perfettamente descritte altrove. 16,17 Tuttavia, uno dei principali vantaggi del metodo di progettazione a livello di sistema descritto in questo lavoro è che è adattabile ad una grande varietà di dispositivi microfluidici core. Ad esempio, la maggior parte delle altre modalità di separazione a flusso continuo, tra cui inerziale, flow-campo di frazionamento, spostamento laterale deterministico (DLD), e vari tipi di dispositivi elettrocinetiche possono essere facilmente incorporati, con opportuni aggiustamenti fatti per tener conto delle variazioni nella configurazione di ingresso / uscita , portate,e volumi di campione. I dispositivi con vari tipi di campi on-chip (elettrico, magnetico) o gradienti (termici, chimici) possono richiedere ulteriori collegamenti al chip, o l&#39;integrazione di hardware aggiuntivo, che questa piattaforma può ospitare. Questo protocollo definisce i passaggi indispensabili per la progettazione di un dispositivo di separazione microfluidica, e per fabbricare chip di silicio di vetro da una profonda ion etching reattiva (DRIE, un processo al plasma etch disponibili in molte strutture di microfabbricazione, che utilizza cicli di incisione e passivazione alternati per raggiungere in profondità caratteristiche con pareti laterali verticali 18). Successivamente, descriviamo la caratterizzazione del dispositivo acoustofluidic per determinare i parametri di funzionamento ottimali per la separazione, e infine dettaglio il sistema di separazione completamente integrato e la procedura per il trattamento di campioni biologici. Risultati caratterizzazione dispositivo tipici e l&#39;elaborazione dei dati del campione vengono poi presentati e discussi, ed i vantaggi di questo approach sono evidenziati, tra cui la modularità, robustezza, precisione e automazione.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materiali necessari per le Fasi 1-3: Progettazione, Fabbricazione e Assemblaggio</td></tr><tr><td>del Dispositivo Wafer di Silicio Lucido su Doppia</td><td>Faccia Silicon Quest International, Inc. San Jose, CA, USA</td><td>100 mm < 100>&nbsp; wafer di prima qualità</td><td>1-20 ohm-cm, 495 &#177; 25&#160; &micro; m Wafer di vetro lucidato su entrambi i lati</td></tr><tr><td></td><td>Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, USA</td><td>100 mmx0,5 mm Boro</td><td></td></tr><tr><td>Photoresist, AZ 1518</td><td>MicroChemicals GmbH, Ulm, Germania</td><td>AZ 1518</td><td>Photoresist utilizzato per far aderire il wafer al wafer bianco per l'incisione DRIE</td></tr><tr><td>Photoresist, AZ 4620</td><td>MicroChemicals GmbH, Ulm, Germania</td><td>AZ 4620</td><td>Photoresist per definire modelli fluidici e tramite maschera</td></tr><tr><td>DRIE incisore al plasma</td><td>STPS, Newport, NP, Regno Unito</td><td>Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) ICP system</td><td></td></tr><tr><td>Wafer Bonder</td><td>Electronic Visions Group,&nbsp; St.Florian am Inn, Austria</td><td>EVG 501</td><td></td></tr><tr><td>Sega a cubetti</td><td>Kulicke & Soffa Industries, Singapore</td><td>K& S 982</td><td></td></tr><tr><td>Kit epossidico</td><td>Tecnologia epossidica, Billerica, MA, USA</td><td>EPO-TEK 301</td><td>Epossidica utilizzata per accoppiare piezoceramica e chip microfluidico</td></tr><tr><td>PZT</td><td>Piezo Systems, Woburn, MA, USA</td><td>PSI-5A4E</td><td>37.5 & volte; 10 & volte; 0.5 mm</td></tr><tr><td>28 AWG Kynar-isolato filo pieno</td><td>Squires Electronics, Cornelius, OR, USA</td><td>UL1422</td><td></td></tr><tr><td>2 parti argento epossidico&nbsp;</td><td>MG Chemicals, Surrey, BC, Canada</td><td>8331</td><td>Adesivo conduttivo per il fissaggio di cavi a PZT</td></tr><tr><td>L-edit</td><td>Tanner EDA, Monrovia, CA, USA</td><td>Software CAD a 64 bit Ledit v15.1</td><td>per il layout</td></tr><tr> della maschera<td colspan="4">Materiali necessari per il passaggio 4: Caratterizzazione delle prestazioni di messa a fuoco acustica</td></tr><tr>Apparecchio Harvard a<td>doppia pompa</td><td>, Holliston, MA, USA</td><td>PHD Ultra Series, 703007</td><td></td></tr><tr><td>5&#160; siringhe ml</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Luer a adattatore porta filettata</td><td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td><td>P-659</td><td>Collega la siringa al tubo</td></tr><tr><td>Union</td><td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td><td>P-623</td><td>Collega il mondo alle connessioni del chip al tubo in fluoropolimero. Può anche utilizzare palmato&nbsp;</td></tr><tr><td>Ghiera 1/4-28 fondo piatto</td><td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td><td>P-200</td><td>Utilizzato con dado per effettuare collegamenti tra tubo e siringa, sensori di flusso e hardware da mondo a chip</td></tr><tr><td>Dado&nbsp; 1/4-28 a fondo piatto</td><td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td><td>P-202</td><td>Utilizzato con ghiera per realizzare collegamenti tra tubo e siringa, sesnsors di flusso e hardware da mondo a chip</td></tr><tr><td>1/16" OD tubo in fluoropolimero</td><td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td><td>Tubo 1912L</td><td>per collegare le pompe a siringa alle connessioni mondo-chip. Le dimensioni del tubo non sono critiche durante le fasi di classificazione (ID .01-.03" tipicamente utilizzato, altri codici adatti: 1907L, 1902L).</td></tr><tr><td>Tubo in fluoropolimero con diametro interno ridotto</td><td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td><td>1476-20</td><td>Utilizzato per limitatori di flusso: 0,006" ID, 1/16" OD FEP&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo in</td><td></td><td></td> PEEK <td>Si collega dal chip al tubo in fluoropolimero.</td></tr><tr><td>Ventola di raffreddamento</td><td>Multicomp, Leeds, Inghilterra</td><td>MC19663</td><td></td></tr><tr><td>Generatore di funzioni</td><td>Agilent, Santa Clara, CA, USA</td><td>33220A</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore RF</td><td>ENI, Rochester, NY</td><td>325 LA</td><td>Deve essere in grado di amplificare i segnali da < 1&#160; V nell'intervallo 1-2&#160; MHz a 25&#160; Vpp al piezo.</td></tr><tr>Fotometria della <td>fotocamera CCD</td><td>, Tucscon, AZ, USA</td><td>Microscopio invertito CoolSnap HQ</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss, Oberkochen, Germania</td> Set di filtri <td>FITC Axiovert S100</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Chroma Tech, VT, USA</td><td>Obiettivo SP101</td><td></td></tr><tr><td>, 10X</td><td>Zeiss, Oberkochen, Germania</td><td>Oscilloscopio ACHROPLAN</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tektronix, Beaverton, OR, USA</td><td>TDS3014B</td><td>Per monitorare l'uscita di tensione dall'amplificatore RF</td></tr><tr><td>MatLab</td><td>Mathworks, Natick, MA, USA</td><td>R2014a</td><td></td></tr><tr><td>Software di interfaccia driver per integrare la fotocamera Photometrics con LabVIEW</td><td>R Cubed Software, Lawrenceville, NJ, USA</td><td>SITK</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, USA</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Dragon Green Fluorescent 5.76 o 7.32&#160; &micro; m Beads</td><td>Bangs Laboratory, IN, USA</td><td>FS06F</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materiali aggiuntivi necessari per la fase 5: Valvole multiporta di separazione automatizzata</td></tr><tr><td></td><td>VICI, Houston, TX, USA</td><td>C25Z-3180EUHA</td><td>Nella configurazione attuale sono necessarie 4 valvole</td></tr><tr><td>Sensori di flusso</td><td>Sensirion, Westlake Village, CA, USA</td><td>SLI-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tubi in fluoropolimero, .01 e .03" ID</td><td>IDEX, Quercia Harbor, WA, USA</td><td>1902L e 1912L</td> Dado <td>preferito in PFA ad alta purezza</td></tr><tr><td></td><td>VICI, Houston, TX, USA</td><td>ZN1PK-10</td><td>Utilizzato con ghiera per realizzare collegamenti tra tubi e valvole. Codici articolo alternativi: MZN1PK-10, LZN1PK-10</td></tr><tr><td>Ghiera</td><td>VICI, Houston, TX, USA</td><td>ZGF1PK-10</td><td>Utilizzato con dado per effettuare collegamenti tra tubi e valvole. &nbsp;</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments, Austin, TX, USA</td><td>LabVIEW Professional Development system</td><td>Software di automazione di laboratorio</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Teknova, Hollister, CA, USA</td><td>P0200</td><td></td></tr><tr><td>Raji Cells</td><td>ATTC, Manassas, VA, USA</td><td>CCL86</td><td></td></tr><tr><td>Boa Cells</td><td></td><td></td><td>Gentilmente fornito dal DeRisi Laboratory presso UCSF</td></tr><tr><td>GGV</td><td></td><td></td><td>Gentilmente fornito dal Laboratorio DeRisi presso UCSF</td></tr><tr><td>DENV</td><td></td><td></td><td>Gentilmente fornito da Jose Pena presso LLNL</td></tr><tr><td>Coulter Counter Z2</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA, USA</td> Ematocitometro <td>Z2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific, Waltman, MA, USA</td><td>0267151B</td><td></td></tr></tbody></table>

una piattaforma per l&#39;elaborazione di precisione microfluidic piccola volume del campione e il suo uso per dimensione particelle biologiche separate con un microdevice acoustic

A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice

Un vantaggio importante di dispositivi microfluidici è la capacità di manipolare piccoli volumi, riducendo così sprechi di reagente e conservazione del campione prezioso. Tuttavia, per raggiungere robusta manipolazione campionatura è necessario affrontare l&#39;integrazione dei dispositivi con l&#39;ambiente macroscala. Per realizzare ripetibili, la separazione di particelle sensibili con dispositivi microfluidici, questo protocollo presenta una completa piattaforma microfluidica automatizzata e integrata che consente l&#39;elaborazione precisa dei 0.15-1.5 ml campioni utilizzando dispositivi microfluidici. Aspetti importanti di questo sistema comprendono struttura modulare dispositivo e infissi robusti conseguente mondo affidabile e flessibile di chip connessioni, e la gestione dei fluidi completamente automatizzata che compie campionario circuito chiuso, sistema di pulizia e adescamento misure per garantire il funzionamento ripetibile. Diversi dispositivi microfluidici possono essere usati in modo intercambiabile con questa architettura. Qui incorporiamo un dispositivo acoustofluidic, particolare la sua characterizzione, ottimizzazione delle prestazioni, e dimostrare il suo uso per dimensioni-separazione dei campioni biologici. Utilizzando feedback in tempo reale durante gli esperimenti di separazione, la raccolta dei campioni è ottimizzato per conservare e concentrare campione. Sebbene richiede l&#39;integrazione di più apparecchiature, i vantaggi di questa architettura includono la capacità di trattare i campioni sconosciuti senza ulteriore ottimizzazione del sistema, facilità di sostituzione del dispositivo, e preciso, campione di trasformazione robusto.

Le caratteristiche principali del disegno dispositivo acustico-microfluidica sono evidenziati in Figura 1, e descritte dettagliatamente altrove. 15 In breve, side-by-side due correnti di fluido flusso in un canale di separazione, separato da un canale di bypass in parallelo da una parete sottile di silicio. Poiché il primario forza di radiazione ampiezza scale con volume di particelle, le particelle più grandi migrano dal flusso di input mista campione verso il nodo di pressione acustica situata nella corrente fluida recupero adiacenti, mentre le piccole particelle rimangono nel flusso originale (Figura 1B, C). Il suddivisa architettura a due canali migliora separazione delle particelle 17 e permette la regolazione della posizione nodo utilizzando diversi fluidi canale di by-pass. 16 Il tagliere fluidica e infissi fornisce una solida piattaforma per mondo a scheggiare le connessioni, e il design modulare consente un rapido cambio tra i chip fluidici (Figura 2). Questo cONFIGURAZIONE permette altresì collegamenti del fluido reversibili, che sigillano fino a 1000 psi, da effettuare in modo rapido e affidabile (Figura 2B, E). I risonanti res frequenza f di un chip può essere stimata utilizzando semplici calcoli analitici 1D (fare riferimento al punto 1.1.1). Da un modello più completo 2D agli elementi finiti del nostro dispositivo sezione 16, la posizione del fuoco previsto per 2 nodi risonanza è 225 micron dalla parete e la frequenza attesa è 1.68 MHz. Tuttavia, res f di dispositivi reali può variare di ± 100 kHz, a seconda della temperatura di funzionamento e l&#39;accoppiamento di risonanze longitudinali e laterali. Pertanto, dopo il montaggio del dispositivo, res f devono essere verificate empiricamente a portate rilevanti e le tensioni di unità piezoelettrica, come descritto al punto 4 del protocollo. La figura 3 mostra le scansioni di frequenza rappresentante prese a 200 ml / min,<html> con acqua in principali e bypass canali, e 20 V pp fornita al piezo. Quando l&#39;accoppiamento tra il dispositivo e piezo microfluidi è buona, particelle si concentrano strettamente alla frequenza di risonanza, causando un picco dell&#39;intensità fluorescente e migrazione verso la posizione di messa a fuoco atteso (Figura 3A). Al contrario, quando vi è scarsa accoppiamento, particelle si concentrano bene ei risultati di scansione di frequenza saranno simili alla Figura 3B. In tali dispositivi, il trasduttore piezoelettrico può essere necessario ri-montato, se è stato usato un adesivo reversibile; altrimenti il ​​dispositivo non è adatto quando l&#39;alta qualità di messa a fuoco o flusso veloce sono fondamentali per l&#39;applicazione richiesta. I dati della figura 3 informano la scelta della frequenza di funzionamento per esperimenti successivi, e la tensione e campo di portata disponibili per la separazione di particelle efficiente. file / ftp_upload / 53051 / 53051fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. di trattamento automatizzato di Campione. (A) Schema di campione caricato nella bobina campione. (B) profilo del flusso Rappresentante di un esperimento di successo di separazione. (C) Portata profilo da una separazione eseguire durante il quale l&#39;uscita SPO intasato a circa 220 secondi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53051/53051fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Dopo aver identificato chip che sono separatori efficaci, sono incorporati nel sistema illustrato nella figura 4. Totale sistema cilindrata viene minimizzato usando tubi con 0.01 &quot;diametro interno lungo il percorso di flusso principale (linee blu). Figura 5A illustra il make-up una spina di campione tipico infuso attraverso il sistema. Una piccola quantità di &quot;leader cuscinetto&quot; (~ 35 ml) è necessario per precede il campione nel flusso per eliminare fluttuazioni di flusso mentre il campione si muove attraverso il chip di separazione. La figura 5B mostra i dati di flusso risultanti da un esperimento separazione acustica automatizzato successo. Caratteristiche principali di una corsa di successo includono: (1) un aumento transitorio della portata sia nel LPO e SPO come pressione aumenta e fluido inizia a fluire attraverso il sistema, (2) un picco tagliente che indica il passaggio di una bolla d&#39;aria (il inserto mostra un profilo esteso di una singola bolla), che dovrebbe raggiungere la SPO prima della LPO dovuta al flusso disuguale dalle due uscite, (3) stabile flusso attraverso entrambe le uscite tra le due bolle di aria mentre il campione si muove attraverso il sistema, e (4) una graduale diminuzione della portata in entrambe le uscite dopo che il volume totale del campione viene consegnato al sistema. Piste problematici sono immediatamente evidenti dai profili di flusso simile alla Figura 5C, qualora risulti che la SPO diventato intasato dopo circa 220 secondi. In thi<html> s caso, una procedura di pulizia simile a quello descritto nella Fase 5.3 deve essere eseguito per sbloccare il canale. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53051/53051fig6.jpg" /> Figura tunability 6. Dispositivo: dimensione delle particelle ed effetti di tensione. Percentuale di microsfere di polistirene estratti nel LPO dipende dalla dimensione delle particelle e la tensione fornita al piezoceramico. Ogni riga corrisponde ad una tensione di esercizio diverso alla frequenza di risonanza, determinato come descritto al punto 4. portata totale attraverso il dispositivo è di 200 ml / min, con frequenze di trasmissione applicata tra 1,62 e 1,64 MHz. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard di almeno tre esperimenti separati. Riprodotto e modificato con il permesso di The Royal Society of Chemistry da http://pubs.rsc.org / it / Contenuti / ArticleLanding / 2014 / AN / c4an00034j.target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. La figura 6 mostra compilati separazione è il risultato utilizzando varie granulometrie polistirolo e piezo guida tensioni che dimostrano i parametri di funzionamento necessari per la separazione efficiente. In generale, tensioni superiori (cioè maggiori forze acustici) sono necessari per estrarre le particelle più piccole, come previsto. Tensioni unità non può essere a tempo indeterminato aumentati, però, a causa di una maggiore dissipazione del calore e crescenti effetti di streaming acustico. 13 La trama serve come guida generale per particelle dimensioni separazione delle particelle che mostrano il recupero significativamente diversa ad una tensione un&#39;unità specifica (ad esempio, 10- e le particelle a 2 micron a 8.8 V pp) si separeranno bene. In generale, le popolazioni di particelle con una grande differenza di dimensioni, come ad esempio i virus (~ 100 nm) e le cellule (~ 10 micron) possono essere separati rapido ed efficiente, così come le cellule di diffdimensioni erenti (ad esempio, 6-8 micron eritrociti discoidali e 8-15 micron leucociti). Le condizioni specifiche necessarie per lavorare con altri tipi di cellule devono essere determinato empiricamente, come forma delle cellule, densità e compressibilità influenzare il contrasto acustica, oltre alla dimensione della cella. A tal fine, le procedure nel passaggio 4 sono utili per determinare condizioni di separazione utilizzabili per qualsiasi nuovo tipo cellulare o particelle, e non solo per valutare la qualità di un particolare dispositivo acoustophoresis. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53051/53051fig7.jpg" /> Figura 7. La separazione efficienza di Cell-Virus campioni addizionati. Separazione è il risultato di (A) Raji cellule addizionati con il virus Dengue (DENV) e (B), le cellule Raji e cellule renali Boa a spillo con il Golden Gate Virus (GGV). Percentuali raccolti sono definiti come la frazione di virus o cellule in uscita da una specificaoutlet rispetto alla quantità totale in uscita dal chip. Le barre di errore per (A) sono la deviazione standard di 3 studi, mentre i campioni in (B) sono stati trattati solo una volta a causa delle basse quantità disponibili. 1x PBS è stato usato come fluido tampone campione e recupero, con acqua nel canale di bypass per tutti gli esperimenti. Frequenze di funzionamento di chip erano compresi tra 1,60 e 1,64 MHz, con tensioni di unità tra i 16 ei 20 V pp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53051/53051fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Per dimostrare l&#39;utilità di questa piattaforma per la separazione di particelle biologiche, in primo luogo abbiamo usato per processare campioni biologici ben caratterizzati: cellule Raji umane (10 5 cellule / ml, diametro medio 8-10 micron 25) narcotizzati dai virus della dengue (DENV, 10 5 pfu / ml, diametro approssimativo di 50 nm 26). Figura 7A mostra la percentuale di cellule Raji e DENV raccolti sia nel SPO e LPO (definito come la frazione di ciascun tipo di particella raccolti da ogni uscita rispetto alla quantità totale di ciascuna particella raccolti dal chip). L&#39;esperimento è stato ripetuto in triplicato, e cellule Raji sono stati quantificati usando un contatore Coulter, mentre DENV stata quantificata utilizzando una trascrizione inversa polymerase chain reaction quantitativa (RT-qPCR). Successivamente, le prestazioni del sistema è stato testato in uno scenario che è più realistico per la lavorazione di campioni clinici, in cui le caratteristiche fisiche delle particelle esatte possono essere sconosciuti, e le quantità di campione disponibili sono inferiori. Qui, abbiamo valutato la separazione del virus golden gate recentemente identificati (GGV), un serpente patogeno di infettare cellule renali boa constrictor. 27 La dimensione della particella virale GGV non è ancora stata misurata, ma dal momento che GGV appartiene alla famiglia Arenaviridae, esso è probabile di undimensioni simili, tra 100 e 150 nm. 28 Abbiamo elaborato campioni GGV spillo (10 4 pfu / ml) in cellule Raji umane (e non un obiettivo di infezione per il virus), e le cellule boa renali (bersaglio dell&#39;infezione per GGV, dimensione approssimativa 10 27 micron), con entrambi i tipi di cellule a 10 4 cellule / ml. Poiché questi campioni erano disponibili in piccole quantità, separazione è il risultato di un solo periodo sperimentale sono riportati in questo lavoro. La figura 7B mostra la percentuale di cellule Raji, cellule Boa, e GGV raccolti da SPO e LPO. Le cellule sono state quantificate in questi esperimenti contando su un emocitometro e virus sono stati quantificati mediante RT-qPCR.

Questo protocollo descrive un'architettura di sistema per l'esecuzione di separazioni automatizzate di particelle di piccolo volume (0,15-1,5 ml) utilizzando un dispositivo microfluidico e discute i metodi per ottimizzare le prestazioni e il funzionamento del dispositivo acustofluidico.

Una piattaforma per l&#39;elaborazione di precisione Microfluidic piccola Volume del campione e il suo uso per Dimensione particelle biologiche separate con un Microdevice Acoustic

A major advantage of microfluidic devices is the ability to manipulate small sample volumes, thus reducing reagent waste and preserving precious sample. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire separazioni automatizzate di particelle in piccoli volumi utilizzando un dispositivo microfluidico fotico. Questo metodo può consentire procedure fondamentali nel campo dell'ingegneria biomedica, inclusi il trattamento accurato e la separazione di campioni per applicazioni di biosensori e ricerca clinica. I principali vantaggi di questa tecnica sono modularità, precisione, robustezza e automazione, rendendola adattabile e flessibile non solo per la separazione di reticoli, ma anche per una vasta gamma di dispositivi microfluidici per separazioni in flusso.Abbiamo innanzitutto riconosciuto la necessità di questa capacità per eseguire in modo routinario e affidabile separazioni su volumi di campioni biologici sub-millimetrici senza un'eccessiva diluizione o perdita dell'analita. L'integrazione della misurazione del campione e del convogliamento automatizzato dai file sorgente a quelli di raccolta, insieme alle operazioni standard della pompa a siringa, è fondamentale per lavorare con successo a questa scala. Per iniziare la progettazione, si utilizzi il dispositivo acustico reticolato e il layout delle due maschere fotolitografiche come descritto nella sezione uno del protocollo testuale allegato.Quindi, definire i porti fluidici sul retro su una wafer di silicio 1 0 0 lucidata su entrambi i lati. Mediante litografia fotolitografica con resist positivo standard, incidere questa geometria mediante etching reattivo a ioni profondo (deep reactive ion etching) fino a una profondità compresa tra 350 e 400 micrometri. Successivamente, capovolgere la wafer e definire la geometria dei canali fluidici sul lato anteriore.Anche in questo caso, utilizzando una litografia fotolitografica con resist positivo standard, montare la wafer strutturata su una seconda wafer portante di silicio non strutturata. Utilizzando il resist fotografico, incidi ora i canali esposti fino a una profondità di 200 micrometri. Mediante incisione reattiva profonda, immergere quindi la wafer del dispositivo in una soluzione rimuovi-resist per staccarla dalla wafer di silicio non strutturata.Successivamente, pulire la wafer del dispositivo e una wafer di vetro borosilicato priva di strutture, spessa 0,5 millimetri, utilizzando la soluzione di piranha. Una volta pulite, sigillare i canali fluidi mediante legame ionico tra la wafer di vetro e quella di silicio utilizzando le condizioni mostrate qui. Infine, separare i singoli chip con una lama di diamante su un tagliasemie, utilizzando un kit di colla epossidica bicomponente a bassa viscosità.Pesare il rapporto raccomandato di entrambi i componenti e mescolarli accuratamente. Successivamente, posizionare il ceramico piezoelettrico al titanato di zirconio a otto piombi o PCT in un'apposita guida e utilizzare una pipetta per distribuire uniformemente circa 10 microlitri della miscela di resina epossidica su di esso, creando uno strato sottile e omogeneo. Quindi, inserire il chip nella guida e allineare il lato con l'epossidica del ceramico piezoelettrico con il chip microfluidico.Potrebbe essere necessario fissare il chip con del nastro per mantenerlo in posizione durante l'allineamento. Fissare l'insieme in una morsa avendo cura di non rompere alcuna delle componenti e procedere alla polimerizzazione alla temperatura e per la durata raccomandate dal produttore dell'epossidico. Dopo la polimerizzazione dell'epossidico, utilizzare un saldatore con punta fine per collegare dei fili sottili a ciascun lato della ceramica piezoelettrica.Se necessario, utilizzare il flusso appropriato per preparare la superficie del pizo. Prestare attenzione a stabilire il contatto più breve possibile con il pizo per evitare la sua depolarizzazione termica. Fissare il chip a una basetta fluidica utilizzando dispositivi di serraggio.Inoltre, collegare un ventilatore di raffreddamento alla basetta per regolare la temperatura durante gli esperimenti acustici. Successivamente, avvitare i connettori dal chip al mondo. Fissare la basetta sulla piastra del microscopio e collegare i connettori dal mondo al chip a tubi aggiuntivi agli ingressi e alle uscite.Utilizzando raccordi filettati standard da un quarto da 28. Per un tubo da un sedicesimo di pollice, collegare il chip microfluidico alla pompa per siringa, alle valvole di selezione multiporta controllate dal computer, ai flussimetri collegati al PC e ai tubi come mostrato qui e descritto nella figura quattro del protocollo illustrato nel testo. Prima di eseguire la separazione, riempire le riserve dei reagenti per la pulizia e preparare le relative linee fluide.Impostare anche le valvole tre e quattro alle uscite del chip in modo che inizialmente il flusso sia diretto ai serbatoi di scarto. Successivamente, accendere il ventilatore di raffreddamento. Collegare i cavi del ceramico pizo all'amplificatore di potenza e impostare il generatore di funzione alla frequenza di risonanza del chip acustico in uso.Regolare il punto di settaggio della tensione sul generatore di funzioni in modo che l'amplificatore RF emetta una tensione compresa tra 12 e 25 volt picco-picco, a seconda della separazione desiderata. Successivamente, collegare le provette di raccolta appropriate e la provetta di ingresso del tampone al sistema. Utilizzare il tampone campione adatto alle cellule o alle particelle da separare o richiesto dal saggio analitico che verrà effettuato dopo la separazione.Successivamente, caricare il software di controllo e utilizzarlo per gestire le valvole, i sensori di flusso e la pompa al fine di eseguire automaticamente la procedura di spurgo e separazione. Immediatamente prima di avviare la procedura di separazione, agitare brevemente il flacone del campione con un vortex per risospendere eventuali particelle che potrebbero essersi depositate. In alternativa, prelevare e rilasciare il campione 10 volte con una pipetta per mescolare campioni biologici particolarmente sensibili a danni o aggregazione causati dal vortex.Quindi collegare la provetta del campione alla linea di ingresso e avviare immediatamente la procedura di preriscaldamento e separazione. Iniziare utilizzando il software per preriscaldare l'ingresso d'aria delle valvole uno e due, assicurandosi che i tubicini siano privi di fluido. Contemporaneamente, preriscaldare i tubicini che collegano la provetta di ingresso del tampone alla valvola due e la provetta di ingresso del campione alla valvola uno.Far aspirare alla pompa per siringa circa 15 microlitri da entrambe le provette per riempire completamente i tubi, collegandoli alle valvole. Infine, commutare le valvole uno e due verso lo scarico per espellere qualsiasi eccesso di liquido o aria entrato nella bobina di carico. Successivamente, impostare il programma per caricare la bobina del campione aspirando prima 25 microlitri di aria a una velocità di 50 microlitri al minuto.Quindi caricare 250 microlitri di campione a 200 microlitri al minuto, seguiti da 35 microlitri di tampone guida a 200 microlitri al minuto e, infine, altri 25 microlitri di aria a 50 microlitri al minuto. Impostare quindi le pompe a siringa per infondere i tratti di fluido caricati a 100 microlitri al minuto e monitorare le portate in uscita alle particelle piccole e grandi mediante sensori di flusso. Il rapporto di flusso appropriato può essere determinato come descritto nel protocollo testuale allegato.Quando i sensori di flusso rilevano un picco nel tasso di flusso che indica il passaggio del primo interstizio d'aria, commutare la valvola di uscita corrispondente dal flacone di scarto a un flacone di raccolta del campione. Assicurarsi che il flusso sia stabile mentre il campione transita attraverso il chip e viene separato, osservando le letture dei sensori di flusso. Mentre il campione passa attraverso il chip, le frazioni separate vengono raccolte alle valvole di uscita.Alla fine del campione, osservare il sensore di flusso e rilevare il secondo intervallo d'aria. A questo punto, riportare le valvole di uscita allo scarico. Dopo che il volume completo è stato erogato, arrestare l'infusione della pompa a siringa e terminare la procedura automatizzata.Al termine dell'esperimento di separazione, scollegare le provette di raccolta del campione per particelle piccole e grandi e conservarle adeguatamente per analisi successive. Fissare il tubo di prelievo del campione in provette vuote per raccogliere le soluzioni di pulizia in eccesso che verranno fatte passare attraverso i tubi. Quindi avviare la procedura automatica di pulizia del sistema come descritto nel protocollo testuale allegato.Durante questo processo, il programma controlla le valvole e la pompa a siringa per caricare in sequenza la bobina di ritenzione con reagenti di pulizia e per farli scorrere attraverso il sistema. Al termine del processo automatico di pulizia e decontaminazione, smaltire le soluzioni di lavaggio in eccesso e i flaconi in cui sono state raccolte, seguendo le procedure appropriate per lo smaltimento di rifiuti biologici o chimici. Qui viene mostrata una scansione di frequenza rappresentativa proveniente da un dispositivo piezoelettrico e microfluidico correttamente accoppiato.Quando l'accoppiamento tra il dispositivo piezoelettrico e il dispositivo microfluidico è efficace, le particelle si focalizzano strettamente alla frequenza di risonanza, determinando un picco evidente nell'intensità fluorescente e una migrazione nella posizione di focalizzazione prevista. Al contrario, quando l'accoppiamento è scarso, le particelle non si focalizzano correttamente e il dispositivo risulta inadatto qualora una focalizzazione di alta qualità o flussi rapidi siano fondamentali per l'applicazione richiesta. Ogni linea su questo grafico rappresenta i risultati di separazione ottenuti utilizzando diverse dimensioni di particelle di polistirene e diverse tensioni di alimentazione del dispositivo piezoelettrico.In generale, sono necessarie tensioni più elevate per estrarre particelle più piccole. Tuttavia, le tensioni in condizioni asciutte non possono essere aumentate indefinitamente a causa di una maggiore dissipazione del calore e degli effetti crescenti del flusso acustico. Per dimostrare l'utilità di questa piattaforma nella separazione di particelle biologiche, cellule umane Raji con un diametro medio compreso tra otto e dieci micrometri sono state mescolate con il virus della dengue, avente un diametro approssimativo di 50 nanometri, e successivamente separate mediante il dispositivo microfluidico acustico.Una volta assemblato e programmato un sistema di questo tipo, le separazioni possono essere eseguite regolarmente in circa cinque minuti. È possibile processare circa tre campioni all'ora con pulizia e decontaminazione complete tra un campione e l'altro. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come il conteggio cellulare, il western blotting o il sequenziamento di nuova generazione, al fine di confermare la purezza della separazione e chiarire il significato biologico.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come realizzare un tipico dispositivo microfluidico per separazioni. Utilizzare collegamenti dal mondo esterno al chip per interfacciarsi con l'apparecchiatura ed eseguire una procedura di separazione automatizzata in modo preciso e robusto. Non dimenticare che lavorare con materiali infettivi può essere estremamente pericoloso e deve essere effettuato esclusivamente da personale adeguatamente formato, utilizzando le attrezzature e le procedure prescritte dall'istituto per la sicurezza biologica.

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Acoustoporesi assistita da aptamero per la separazione microfluidica di batteri Gram-negativi

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