Una piattaforma per l'elaborazione di precisione Microfluidic piccola Volume del campione e il suo uso per Dimensione particelle biologiche separate con un Microdevice Acoustic

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire separazioni automatizzate di particelle di piccolo volume utilizzando un dispositivo fotico microfluidico. Questo metodo può abilitare procedure chiave nel campo dell'ingegneria biomedica, tra cui l'elaborazione e la separazione robuste di campioni per applicazioni di biorilevazione e ricerca clinica. I principali vantaggi di questa tecnica sono la modularità, la precisione, la robustezza e l'automazione, che la rendono adattabile e flessibile non solo per la separazione retica, ma anche per un'ampia varietà di dispositivi di separazione microfluidica a flusso continuo.

Per prima cosa abbiamo riconosciuto la necessità di questa capacità di eseguire separazioni di routine e in modo affidabile su volumi di campioni biologici submillimetrici senza diluizione o perdita significativa di analita. L'integrazione del dosaggio dei campioni e l'instradamento automatizzato dalla sorgente ai file di raccolta, insieme alle operazioni standard della pompa a siringa, sono fondamentali per lavorare con successo su questa scala. Per iniziare, progettare il dispositivo acustico reticolo e il layout per le due fotomaschere, come descritto nella prima sezione del protocollo di testo allegato.

Quindi modellare le porte del fluido sul retro su un wafer di silicio 1 0 0 lucidato su entrambi i lati. Utilizzando la fotolitografia standard a resistenza positiva, incidere questa geometria utilizzando l'incisione ionica reattiva profonda a una profondità compresa tra 350 e 400 micrometri. Quindi, capovolgere il wafer e modellare la geometria del canale del fluido sul lato anteriore.

Ancora una volta, utilizzando la fotolitografia a resistenza positiva standard, quindi montare il wafer modellato su un secondo wafer portante in silicio vuoto. Utilizzando il fotoresist, ora incidete i canali esposti a una profondità di 200 micrometri. Utilizzando l'incisione ionica a reazione profonda, immergere il wafer del dispositivo in una soluzione di stripping resist per rimuoverlo dal wafer di silicio vuoto.

Quindi, pulire il wafer del dispositivo e un wafer di vetro silicato di boro di 0,5 millimetri di spessore utilizzando una soluzione piranha. Una volta puliti, sigillare i canali del fluido legando ionicamente il vetro e il wafer di silicio utilizzando le condizioni mostrate qui. Infine, tagliare i singoli trucioli con una lama diamantata su una sega per cubetti da un kit epossidico bicomponente a bassa viscosità.

Pesare il rapporto consigliato di entrambi i componenti e mescolarli accuratamente. Quindi posizionare il piombo Zirkin eight titanato o la ceramica piezoelettrica PCT in una maschera adatta e utilizzare una pipetta per distribuire uniformemente circa 10 microlitri di miscela epossidica su di essa per creare uno strato sottile e uniforme. Quindi, posiziona il chip nella maschera e allinea il lato epossidico della ceramica pizo con il chip microfluidico.

Potrebbe essere necessario fissare il chip con del nastro adesivo per tenerlo in posizione durante l'allineamento. Bloccare il gruppo in una morsa facendo attenzione a non rompere nessuno dei componenti e polimerizzare la temperatura e la durata consigliate dal produttore della resina epossidica. Dopo che la resina epossidica si è indurita, utilizzare un saldatore a punta fine per fissare i cavi di calibro fine su ciascun lato della ceramica pizo.

Se necessario, utilizzare l'apposito disossidante per preparare la superficie del pizo. Fare attenzione a stabilire il contatto più breve possibile con il pizo per evitare di depolarizzarlo termicamente. Fissare il chip a una breadboard fluidica utilizzando dispositivi di serraggio.

Inoltre, collega una ventola di raffreddamento alla breadboard per regolare la temperatura durante gli esperimenti acustici. Quindi, avvitare il chip ai connettori globali. Monta la breadboard sul tavolino del microscopio e unisci i connettori del mondo per chippare i tubi aggiuntivi agli ingressi e alle uscite.

Utilizzo di raccordi filettati standard quarter 28. Per un tubo da 16 pollici, collegare il chip microfluidico alla pompa a siringa, alle valvole di selezione multiporta controllate da computer, ai misuratori di portata interfacciati con PC e ai tubi come mostrato qui e descritto nella figura quattro del protocollo di testo allegato. Prima di eseguire la separazione, riempire i serbatoi dei reagenti di pulizia e adescare le linee del fluido corrispondenti.

Impostare anche le valvole tre e quattro alle uscite dei trucioli per fluire inizialmente verso i serbatoi di scarico. Quindi, accendi la ventola di raffreddamento. Collegare i cavi in ceramica pizo all'amplificatore di potenza e impostare il generatore di funzioni sulla frequenza di risonanza per il chip acustico in uso.

Regolare il set point di tensione sul generatore di funzioni in modo che l'amplificatore RF emetta tra 12 e 25 volt da picco a picco in base alla separazione desiderata. Quindi collegare al sistema le fiale di raccolta appropriate e la fiala di ingresso del tampone. Utilizzare il tampone del campione adatto alle cellule o alle particelle da separare o come richiesto dal saggio di analisi da utilizzare dopo la separazione.

Successivamente, caricare il software di controllo e utilizzarlo per controllare le valvole, i sensori di flusso e la pompa per eseguire la routine di adescamento e separazione completamente automatica. Immediatamente prima di iniziare la procedura di separazione, agitare brevemente la fiala del campione per risospendere eventuali particelle che potrebbero essersi depositate. In alternativa, pipettare il campione su e giù 10 volte per mescolare i campioni biologici più suscettibili ai danni o all'aggregazione dovuta al vortice.

Quindi collegare la fiala del campione alla linea di ingresso e avviare immediatamente la routine di adescamento e separazione. Inizia utilizzando il software per adescare l'ingresso dell'aria delle valvole uno e due per assicurarti che il tubo non contenga fluido. Contemporaneamente adescare il tubo che collega la fiala di ingresso del tampone alla valvola due e la fiala di ingresso del campione alla valvola uno.

Far prelevare dalla pompa a siringa circa 15 microlitri da entrambe le fiale per riempire completamente il tubo, collegandole alle valvole. Infine, commutare le valvole uno e due su waste per espellere il fluido o l'aria in eccesso che è entrata nella bobina di caricamento. Successivamente, impostare il programma per caricare la bobina di campionamento prelevando prima 25 microlitri di aria a 50 microlitri al minuto.

Quindi caricando 250 microlitri di campione a 200 microlitri al minuto, seguiti da 35 microlitri di tampone principale a 200 microlitri al minuto e, infine, altri 25 microlitri di aria a 50 microlitri al minuto. Quindi impostare le pompe a siringa in modo che infondano i tappi del fluido caricato a 100 microlitri al minuto e monitorare le portate alle uscite di particelle piccole e grandi utilizzando sensori di flusso. Il rapporto di flusso appropriato può essere determinato come descritto nel protocollo di testo allegato.

Quando i sensori di flusso rilevano un picco di portata che indica il passaggio del primo traferro, commutare la valvola di uscita corrispondente dalla fiala di scarto a una fiala di raccolta campioni. Assicurarsi che il flusso sia stabile mentre il campione transita sul chip e viene separato osservando le letture del sensore di flusso. Quando il campione passa attraverso il chip, le frazioni separate vengono raccolte nelle valvole di uscita.

All'estremità del tappo del campione, osservare il sensore di flusso, rilevare il secondo traferro. A questo punto, riportare le valvole di uscita in scarico. Dopo che l'intero volume è stato erogato, interrompere l'infusione con pompa a siringa e terminare la routine di automazione.

Al termine dell'esperimento di separazione, scollegare le fiale di raccolta del campione di particelle piccole e grandi e conservarle in modo appropriato per l'analisi successiva. Fissare il tubo di prelievo del campione in fiale vuote per raccogliere le soluzioni detergenti in eccesso che verranno espulse attraverso i tubi. Quindi avviare la routine di pulizia automatizzata del sistema come descritto nel protocollo di testo allegato.

Durante questo processo, il programma controllerà le valvole e la pompa a siringa per caricare in sequenza la bobina di tenuta con i reagenti di pulizia e farli scorrere attraverso il sistema. Una volta completato il processo automatizzato di pulizia e decontaminazione, eliminare le soluzioni di lavaggio in eccesso e le flaconi in cui sono state raccolte seguendo procedure appropriate per la gestione dei rifiuti biologici o chimici. Qui è mostrata una scansione di frequenza rappresentativa da un dispositivo pizo e microfluidico ben accoppiato.

Quando l'accoppiamento tra il pizo e il dispositivo microfluidico è buono, le particelle si concentrano strettamente alla frequenza di risonanza, determinando un chiaro picco nell'intensità della fluorescenza e la migrazione verso la posizione di messa a fuoco prevista. Al contrario, in caso di scarso accoppiamento, le particelle non si concentreranno bene e il dispositivo non è adatto quando la messa a fuoco di alta qualità o il flusso veloce sono fondamentali per l'applicazione richiesta. Ogni linea di questo grafico rappresenta i risultati della separazione utilizzando varie dimensioni delle particelle di polistirene e tensioni di pilotaggio del pizo.

In generale, sono necessarie tensioni più elevate per estrarre particelle più piccole. Tuttavia, le tensioni a secco non possono essere aumentate all'infinito, a causa della maggiore dissipazione del calore e dell'aumento degli effetti dello streaming acustico. Per dimostrare l'utilità di questa piattaforma per la separazione biologica delle particelle, le cellule di raji umano con un diametro medio da 8 a 10 micrometri sono state addizionate con il virus della dengue con un diametro approssimativo di 50 nanometri e poi separate utilizzando il dispositivo microfluidico acustico.

Una volta che un sistema di questo tipo è stato assemblato e programmato, le separazioni possono essere eseguite di routine in circa cinque minuti. È possibile elaborare circa tre campioni all'ora con pulizia e decontaminazione complete tra i campioni. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come il conteggio cellulare, il western blotting o il sequenziamento di nuova generazione al fine di confermare la purezza della separazione e chiarire il significato biologico.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come fabbricare un tipico dispositivo di separazione microfluidica. Utilizza le connessioni dal mondo al chip per interfacciarti con l'hardware ed eseguire una procedura di separazione automatizzata in modo preciso e robusto. Non dimenticare che lavorare con materiali infettivi può essere estremamente pericoloso e deve essere eseguito solo da personale adeguatamente addestrato utilizzando le attrezzature e le procedure appropriate prescritte dall'istituzione per la sicurezza biologica.