Una piattaforma per l'elaborazione di precisione Microfluidic piccola Volume del campione e il suo uso per Dimensione particelle biologiche separate con un Microdevice Acoustic

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire separazioni automatizzate di particelle in piccoli volumi utilizzando un dispositivo microfluidico fotico. Questo metodo può consentire procedure fondamentali nel campo dell'ingegneria biomedica, inclusi il trattamento accurato e la separazione di campioni per applicazioni di biosensori e ricerca clinica. I principali vantaggi di questa tecnica sono modularità, precisione, robustezza e automazione, rendendola adattabile e flessibile non solo per la separazione di reticoli, ma anche per una vasta gamma di dispositivi microfluidici per separazioni in flusso.

Abbiamo innanzitutto riconosciuto la necessità di questa capacità per eseguire in modo routinario e affidabile separazioni su volumi di campioni biologici sub-millimetrici senza un'eccessiva diluizione o perdita dell'analita. L'integrazione della misurazione del campione e del convogliamento automatizzato dai file sorgente a quelli di raccolta, insieme alle operazioni standard della pompa a siringa, è fondamentale per lavorare con successo a questa scala. Per iniziare la progettazione, si utilizzi il dispositivo acustico reticolato e il layout delle due maschere fotolitografiche come descritto nella sezione uno del protocollo testuale allegato.

Quindi, definire i porti fluidici sul retro su una wafer di silicio 1 0 0 lucidata su entrambi i lati. Mediante litografia fotolitografica con resist positivo standard, incidere questa geometria mediante etching reattivo a ioni profondo (deep reactive ion etching) fino a una profondità compresa tra 350 e 400 micrometri. Successivamente, capovolgere la wafer e definire la geometria dei canali fluidici sul lato anteriore.

Anche in questo caso, utilizzando una litografia fotolitografica con resist positivo standard, montare la wafer strutturata su una seconda wafer portante di silicio non strutturata. Utilizzando il resist fotografico, incidi ora i canali esposti fino a una profondità di 200 micrometri. Mediante incisione reattiva profonda, immergere quindi la wafer del dispositivo in una soluzione rimuovi-resist per staccarla dalla wafer di silicio non strutturata.

Successivamente, pulire la wafer del dispositivo e una wafer di vetro borosilicato priva di strutture, spessa 0,5 millimetri, utilizzando la soluzione di piranha. Una volta pulite, sigillare i canali fluidi mediante legame ionico tra la wafer di vetro e quella di silicio utilizzando le condizioni mostrate qui. Infine, separare i singoli chip con una lama di diamante su un tagliasemie, utilizzando un kit di colla epossidica bicomponente a bassa viscosità.

Pesare il rapporto raccomandato di entrambi i componenti e mescolarli accuratamente. Successivamente, posizionare il ceramico piezoelettrico al titanato di zirconio a otto piombi o PCT in un'apposita guida e utilizzare una pipetta per distribuire uniformemente circa 10 microlitri della miscela di resina epossidica su di esso, creando uno strato sottile e omogeneo. Quindi, inserire il chip nella guida e allineare il lato con l'epossidica del ceramico piezoelettrico con il chip microfluidico.

Potrebbe essere necessario fissare il chip con del nastro per mantenerlo in posizione durante l'allineamento. Fissare l'insieme in una morsa avendo cura di non rompere alcuna delle componenti e procedere alla polimerizzazione alla temperatura e per la durata raccomandate dal produttore dell'epossidico. Dopo la polimerizzazione dell'epossidico, utilizzare un saldatore con punta fine per collegare dei fili sottili a ciascun lato della ceramica piezoelettrica.

Se necessario, utilizzare il flusso appropriato per preparare la superficie del pizo. Prestare attenzione a stabilire il contatto più breve possibile con il pizo per evitare la sua depolarizzazione termica. Fissare il chip a una basetta fluidica utilizzando dispositivi di serraggio.

Inoltre, collegare un ventilatore di raffreddamento alla basetta per regolare la temperatura durante gli esperimenti acustici. Successivamente, avvitare i connettori dal chip al mondo. Fissare la basetta sulla piastra del microscopio e collegare i connettori dal mondo al chip a tubi aggiuntivi agli ingressi e alle uscite.

Utilizzando raccordi filettati standard da un quarto da 28. Per un tubo da un sedicesimo di pollice, collegare il chip microfluidico alla pompa per siringa, alle valvole di selezione multiporta controllate dal computer, ai flussimetri collegati al PC e ai tubi come mostrato qui e descritto nella figura quattro del protocollo illustrato nel testo. Prima di eseguire la separazione, riempire le riserve dei reagenti per la pulizia e preparare le relative linee fluide.

Impostare anche le valvole tre e quattro alle uscite del chip in modo che inizialmente il flusso sia diretto ai serbatoi di scarto. Successivamente, accendere il ventilatore di raffreddamento. Collegare i cavi del ceramico pizo all'amplificatore di potenza e impostare il generatore di funzione alla frequenza di risonanza del chip acustico in uso.

Regolare il punto di settaggio della tensione sul generatore di funzioni in modo che l'amplificatore RF emetta una tensione compresa tra 12 e 25 volt picco-picco, a seconda della separazione desiderata. Successivamente, collegare le provette di raccolta appropriate e la provetta di ingresso del tampone al sistema. Utilizzare il tampone campione adatto alle cellule o alle particelle da separare o richiesto dal saggio analitico che verrà effettuato dopo la separazione.

Successivamente, caricare il software di controllo e utilizzarlo per gestire le valvole, i sensori di flusso e la pompa al fine di eseguire automaticamente la procedura di spurgo e separazione. Immediatamente prima di avviare la procedura di separazione, agitare brevemente il flacone del campione con un vortex per risospendere eventuali particelle che potrebbero essersi depositate. In alternativa, prelevare e rilasciare il campione 10 volte con una pipetta per mescolare campioni biologici particolarmente sensibili a danni o aggregazione causati dal vortex.

Quindi collegare la provetta del campione alla linea di ingresso e avviare immediatamente la procedura di preriscaldamento e separazione. Iniziare utilizzando il software per preriscaldare l'ingresso d'aria delle valvole uno e due, assicurandosi che i tubicini siano privi di fluido. Contemporaneamente, preriscaldare i tubicini che collegano la provetta di ingresso del tampone alla valvola due e la provetta di ingresso del campione alla valvola uno.

Far aspirare alla pompa per siringa circa 15 microlitri da entrambe le provette per riempire completamente i tubi, collegandoli alle valvole. Infine, commutare le valvole uno e due verso lo scarico per espellere qualsiasi eccesso di liquido o aria entrato nella bobina di carico. Successivamente, impostare il programma per caricare la bobina del campione aspirando prima 25 microlitri di aria a una velocità di 50 microlitri al minuto.

Quindi caricare 250 microlitri di campione a 200 microlitri al minuto, seguiti da 35 microlitri di tampone guida a 200 microlitri al minuto e, infine, altri 25 microlitri di aria a 50 microlitri al minuto. Impostare quindi le pompe a siringa per infondere i tratti di fluido caricati a 100 microlitri al minuto e monitorare le portate in uscita alle particelle piccole e grandi mediante sensori di flusso. Il rapporto di flusso appropriato può essere determinato come descritto nel protocollo testuale allegato.

Quando i sensori di flusso rilevano un picco nel tasso di flusso che indica il passaggio del primo interstizio d'aria, commutare la valvola di uscita corrispondente dal flacone di scarto a un flacone di raccolta del campione. Assicurarsi che il flusso sia stabile mentre il campione transita attraverso il chip e viene separato, osservando le letture dei sensori di flusso. Mentre il campione passa attraverso il chip, le frazioni separate vengono raccolte alle valvole di uscita.

Alla fine del campione, osservare il sensore di flusso e rilevare il secondo intervallo d'aria. A questo punto, riportare le valvole di uscita allo scarico. Dopo che il volume completo è stato erogato, arrestare l'infusione della pompa a siringa e terminare la procedura automatizzata.

Al termine dell'esperimento di separazione, scollegare le provette di raccolta del campione per particelle piccole e grandi e conservarle adeguatamente per analisi successive. Fissare il tubo di prelievo del campione in provette vuote per raccogliere le soluzioni di pulizia in eccesso che verranno fatte passare attraverso i tubi. Quindi avviare la procedura automatica di pulizia del sistema come descritto nel protocollo testuale allegato.

Durante questo processo, il programma controlla le valvole e la pompa a siringa per caricare in sequenza la bobina di ritenzione con reagenti di pulizia e per farli scorrere attraverso il sistema. Al termine del processo automatico di pulizia e decontaminazione, smaltire le soluzioni di lavaggio in eccesso e i flaconi in cui sono state raccolte, seguendo le procedure appropriate per lo smaltimento di rifiuti biologici o chimici. Qui viene mostrata una scansione di frequenza rappresentativa proveniente da un dispositivo piezoelettrico e microfluidico correttamente accoppiato.

Quando l'accoppiamento tra il dispositivo piezoelettrico e il dispositivo microfluidico è efficace, le particelle si focalizzano strettamente alla frequenza di risonanza, determinando un picco evidente nell'intensità fluorescente e una migrazione nella posizione di focalizzazione prevista. Al contrario, quando l'accoppiamento è scarso, le particelle non si focalizzano correttamente e il dispositivo risulta inadatto qualora una focalizzazione di alta qualità o flussi rapidi siano fondamentali per l'applicazione richiesta. Ogni linea su questo grafico rappresenta i risultati di separazione ottenuti utilizzando diverse dimensioni di particelle di polistirene e diverse tensioni di alimentazione del dispositivo piezoelettrico.

In generale, sono necessarie tensioni più elevate per estrarre particelle più piccole. Tuttavia, le tensioni in condizioni asciutte non possono essere aumentate indefinitamente a causa di una maggiore dissipazione del calore e degli effetti crescenti del flusso acustico. Per dimostrare l'utilità di questa piattaforma nella separazione di particelle biologiche, cellule umane Raji con un diametro medio compreso tra otto e dieci micrometri sono state mescolate con il virus della dengue, avente un diametro approssimativo di 50 nanometri, e successivamente separate mediante il dispositivo microfluidico acustico.

Una volta assemblato e programmato un sistema di questo tipo, le separazioni possono essere eseguite regolarmente in circa cinque minuti. È possibile processare circa tre campioni all'ora con pulizia e decontaminazione complete tra un campione e l'altro. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come il conteggio cellulare, il western blotting o il sequenziamento di nuova generazione, al fine di confermare la purezza della separazione e chiarire il significato biologico.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come realizzare un tipico dispositivo microfluidico per separazioni. Utilizzare collegamenti dal mondo esterno al chip per interfacciarsi con l'apparecchiatura ed eseguire una procedura di separazione automatizzata in modo preciso e robusto. Non dimenticare che lavorare con materiali infettivi può essere estremamente pericoloso e deve essere effettuato esclusivamente da personale adeguatamente formato, utilizzando le attrezzature e le procedure prescritte dall'istituto per la sicurezza biologica.