Piattaforma microfluidica con multiplex di rilevamento elettronico per spaziale monitoraggio di particelle

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare una piattaforma microfluidica che combina il rilevamento resistivo mediante impulsi con l'accesso multiplo a divisione di codice per effettuare il multiplexing del rilevamento e della misurazione di particelle in più canali microfluidici. Questa tecnologia, denominata microfluidic CODES, può contribuire a realizzare dispositivi a chip per laboratorio completamente integrati e veramente portatili, particolarmente adatti per analisi diagnostiche al punto di cura di campioni biologici in contesti con risorse limitate. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nella capacità di tracciare elettronicamente la manipolazione spaziale e temporale delle particelle sul chip microfluidico, eliminando la necessità di strumenti esterni come il microscopio.

La nostra tecnologia è compatibile con la litografia morbida e può essere facilmente integrata in un dispositivo microfotico in cui le particelle vengono frazionate per fornire una lettura elettronica diretta simile a quella di un contatore di Coulter. Per iniziare la costruzione del dispositivo microfluidico, generare un insieme di quattro codici aurei a sette bit. Quindi progettare quattro disposizioni uniche di elettrodi basate sui codici aurei, utilizzando un software di progettazione assistita da computer, o CAD, come AutoCAD.

Infine, far realizzare la fotomaschera con il layout degli elettrodi progettato da un fornitore di fotomaschere. Successivamente, immergere una wafer di vetro borosilicato da quattro pollici in una soluzione piranha al cinque a uno a 120 gradi Celsius per 20 minuti. Dopo la pulizia, riscaldare la wafer su una piastra riscaldante a 200 gradi Celsius per 20 minuti al fine di evaporare l'acqua residua.

Posizionare la wafer pulita e asciutta in un spin coater. Applicare 2 millilitri di soluzione di fotoresist negativa sulla wafer e rivestirla mediante spin coating a 3000 giri al minuto per 40 secondi. Asciugare la wafer rivestita su una piastra riscaldata a 150 gradi Celsius per un minuto.

Coprire la wafer con una maschera in cromo secondo il disegno degli elettrodi desiderato. Esporre la superficie del photoresist mascherata a luce UV di 365 nanometri per ottenere 225 millijoule per centimetro quadrato. Successivamente, cuocere il photoresist esposto su una piastra riscaldante a 100 gradi Celsius per un minuto.

Immergere la piastrina nel rivelatore di fotoresist per 15 secondi, quindi lavare la piastrina con un getto delicato di acqua deionizzata e asciugare la piastrina sotto un flusso di gas azoto. Successivamente, posizionare la piastrina strutturata in un evaporatore di metalli a fascio di elettroni. Depositare uno strato di cromo spesso 20 nanometri e uno strato d'oro spesso 80 nanometri sulla piastrina a una velocità di un angstrom al secondo.

Quindi incidi il photoresist sottostante riscaldando ad ultrasuoni la wafer rivestita di metallo in acetone per 30 minuti a 40 chilohertz e ampiezza al 100%. Utilizza una sega per dicing per tagliare la wafer in pezzi più piccoli secondo necessità. Per iniziare la fabbricazione dello stampo del canale microfluidico, pulisci e asciuga una wafer di silicio da quattro pollici nello stesso modo della wafer di borosilicato descritta in precedenza.

Posizionare la wafer di silicio in un spin coater e applicare quattro millilitri di soluzione di fotoresist negativa. Effettuare la deposizione mediante centrifugazione a 500 giri al minuto per 15 secondi, quindi a 1.000 giri al minuto per 15 secondi e infine a 3.000 giri al minuto per 60 secondi. Posizionare la wafer con la faccia rivolta verso l'alto su un panno per clean room imbevuto di acetone per rimuovere il fotoresist residuo dal retro e dai bordi della wafer.

Scaldare la piastrina a 65 gradi Celsius per un minuto, quindi a 95 gradi Celsius per due minuti. Posizionare un modello di maschera al cromo per i canali microfluidici sulla piastrina secca. Esporre il fotoresist a luce UV di 365 nanometri a 180 millijoule per centimetro quadrato, quindi scaldare nuovamente la piastrina a 65 e 95 gradi Celsius rispettivamente per un minuto e due minuti.

Posizionare la wafer strutturata in un contenitore con sviluppatore di fotoresist e agitare delicatamente il contenitore per tre minuti. Risciacquare la wafer sviluppata in isopropanolo e asciugare la wafer sotto un flusso di gas azoto. Cuocere la wafer a 200 gradi Celsius per 30 minuti, quindi utilizzare un profilometro per verificare che lo spessore del fotoresist strutturato sia uniforme su tutta la superficie della wafer.

Posizionare la wafer in un essiccatore sotto vuoto insieme a 200 microlitri di triclorosilano in una piastra di Petri scoperta. Lasciare la wafer nell'essiccatore con il triclorosilano per otto ore per silanizzare la superficie della wafer. Per iniziare l'assemblaggio del dispositivo, utilizzare nastro da clean room universale per fissare il getto in silicio in una piastra di Petri di diametro 150 millimetri.

Aggiungere 50 grammi di una miscela 10 a 1 di prepolymero di polidimetilsilossano nella piastra di Petri ed eliminare l'aria dalla miscela in un essiccatore sotto vuoto per un'ora. Polimerizzare la miscela disareata a 65 gradi Celsius per almeno quattro ore. Utilizzare un bisturi per ritagliare lo strato di PDMS polimerizzato, quindi staccare lo strato polimerizzato dallo stampo con pinzette.

Tagliare il PDMS in piccoli pezzi. Praticare i fori dei canali microfluidici di ingresso e uscita con un punch per biopsia. Posizionare il livello di PDMS con la faccia strutturata rivolta verso il basso su un nastro trasparente per pulire la superficie microlavorata.

Sciacquare il substrato di vetro con elettrodo precedentemente preparato con acetone, isopropanolo e acqua deionizzata. Asciugare il substrato sotto un flusso di gas azoto. Posizionare lo strato di PDMS e il substrato in un generatore al plasma RF impostato a 100 milliwatt, con i lati contenenti i micromacchinari rivolti verso l'alto.

Attivare le superfici della micromacchina in plasma di ossigeno per 30 secondi. Successivamente, utilizzare un microscopio ottico per allineare lo strato di PDMS con il modello agli elettrodi sulla superficie. Una volta allineati, lasciare che le superfici entrino in contatto fisico per sigillare lo strato di PDMS sul substrato di vetro.

È fondamentale che il disegno dell'elettrodo di rivestimento sul substrato di vetro sia correttamente allineato con i canali microfluidici in PDMS. Una volta correttamente allineato, l'interazione della particella con l'elettrodo superficiale genererà un'onda codificata desiderata per la multiplazione. Cuocere il dispositivo assemblato a 70 gradi Celsius per cinque minuti, con il lato in vetro rivolto verso il basso.

Infine, saldare i fili ai pad di contatto dell'elettrodo per completare l'assemblaggio del dispositivo. Per iniziare l'esperimento, posizionare il dispositivo microfluidico sul tavolo di un microscopio ottico. Collegare l'elettrodo di riferimento del dispositivo alla porta di uscita del segnale di un amplificatore a blocco di fase ed applicare un'onda sinusoidale di 400 chilohertz.

Collegare gli elettrodi sensori positivo e negativo a due amplificatori transimpedenza indipendenti. Collegare entrambi gli amplificatori transimpedenza agli ingressi di tensione differenziale dell'amplificatore lock-in, con il segnale del sensore positivo da sottrarre al segnale del sensore negativo. Collegare l'uscita del demodulatore dell'amplificatore lock-in a un'unità di acquisizione dati.

Nel software di acquisizione dati, impostare una frequenza di campionamento per l'uscita dell'amplificatore lock-in di 1 megahertz. Configurare una telecamera ad alta velocità per registrare otticamente il funzionamento del dispositivo come visto al microscopio. Aspirare una sospensione cellulare preparata in una siringa.

Fissare la siringa del campione in una pompa per siringhe e collegare la siringa al canale di ingresso. Indirizzare il canale di uscita verso un contenitore per rifiuti. Utilizzare la pompa per siringhe per far passare la sospensione cellulare attraverso il dispositivo a un flusso costante, registrando contemporaneamente il segnale di modulazione dell'impedenza.

Al termine dell'esperimento, elaborare i dati elettrici con un software di analisi. Confrontare il segnale elettrico elaborato con le immagini della telecamera ad alta velocità per creare una curva di calibrazione per la dimensione delle cellule. Una sospensione cellulare è stata fatta fluire attraverso un dispositivo sensore microfluidico con quattro pattern elettrodici unici derivati da codici sensoriali ortogonali.

Tutti e quattro i segnali dei sensori sono stati registrati da un'unica uscita elettrica. Il sensore individuale associato a ciascun segnale registrato è stato identificato mediante la correlazione dei segnali registrati con tutti i codici possibili, generando picchi di autocorrelazione chiaramente distinguibili. Le forme d'onda prodotte dai segnali interferenti derivanti dalla rilevazione simultanea delle cellule in tutti e quattro i canali sono state risolte mediante un algoritmo iterativo.

Un'onda registrata è stata correlata con tutti i codici possibili ed è stato identificato il picco di autocorrelazione più elevato. Il segnale corrispondente del sensore individuale è stato ricostruito e sottratto dall'onda in ingresso. Il segnale residuo è stato passato all'iterazione successiva come ingresso e il processo è proseguito finché il segnale residuo non ha prodotto picchi di autocorrelazione.

I segnali stimati sono stati affinati sulla base di un algoritmo di ottimizzazione volto a ottenere il miglior adattamento tra le forme d'onda ricostruite e quelle originali registrate, utilizzando l'approssimazione ai minimi quadrati. La posizione, le dimensioni della cellula e il tempo di attraversamento del sensore sono stati quindi determinati in base al numero del canale, all'ampiezza, alla durata e al tempo relativo dei segnali stimati dai sensori. La procedura è stata validata confrontando i segnali elettrici con le misurazioni ottiche ottenute mediante telecamera ad alta velocità.

Una volta padroneggiata, questa tecnica è molto semplice da implementare, poiché è estremamente semplice dal punto di vista hardware. Non presenta componenti attivi sul chip. È direttamente compatibile con la litografia morbida e l'elaborazione del segnale si basa su un semplice algoritmo computazionale.

Seguendo questo protocollo, è possibile realizzare chip microfluidici con sensori elettrici multiplex basati su codice e decodificare i segnali elettrici per misurazioni bioanalitiche. Questa tecnologia di rilevamento elettronico versatile e scalabile può essere facilmente integrata in diversi dispositivi microfluidici per realizzare saggi quantitativi tramite il tracciamento spaziotemporale delle particelle mentre vengono processate sul chip. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come progettare, realizzare e implementare la tecnologia microfluidica CODES.