Piattaforma microfluidica con multiplex di rilevamento elettronico per spaziale monitoraggio di particelle

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare una piattaforma microfluidica che combina il rilevamento di impulsi resistivi con l'accesso multiplo a divisione di codice per multiplexare il rilevamento e il dimensionamento di particelle in più canali microfluidici. Questa tecnologia, denominata microfluidic CODES, può aiutare a realizzare dispositivi chip da laboratorio completamente integrati e veramente portatili che sono adatti per l'analisi point of care di campioni biologici in ambienti con risorse limitate. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può tracciare elettronicamente la manipolazione spaziale e temporale delle particelle sul chip microfluidico, eliminando la necessità di uno strumento esterno come un microscopio.

La nostra tecnologia è compatibile con la litografia morbida e può essere facilmente integrata in un dispositivo microfotico in cui le particelle vengono frazionate per fornire una lettura elettronica diretta simile al contatore di Coulter. Per iniziare la costruzione del dispositivo microfluidico, generare una serie di codici d'oro a quattro e sette bit. Quindi progetta quattro layout di elettrodi unici basati sui codici d'oro utilizzando una progettazione assistita da computer o un software CAD come AutoCAD.

Infine, fai in modo che il fotomascherato con il layout degli elettrodi progettato e prodotto da un fornitore di fotomaschere. Quindi, immergi un wafer di vetro borosilicato da quattro pollici in una soluzione di piranha cinque a uno a 120 gradi Celsius per 20 minuti. Dopo la pulizia, scaldare il wafer su una piastra calda a 200 gradi Celsius per 20 minuti per far evaporare l'acqua residua.

Metti il wafer pulito e asciutto in una centrifuga. Applicare 2 millilitri di soluzione di fotoresist negativo sul wafer e centrifugare il rivestimento a 3000 giri al minuto per 40 secondi. Asciugare il wafer rivestito di centrifuga su una piastra calda a 150 gradi Celsius per un minuto.

Coprire il wafer con una maschera cromata nel modello di elettrodo desiderato. Esporre la superficie del fotoresist mascherato alla luce UV a 365 nanometri per raggiungere 225 millijoule per centimetro quadrato. Cuocere il fotoresist esposto su una piastra calda a 100 gradi Celsius per un minuto.

Immergere il wafer nello sviluppatore di fotoresist per 15 secondi, quindi lavare il wafer del modello in uno spruzzo delicato di acqua deionizzata e asciugare il wafer sotto un flusso di azoto gassoso. Quindi, posizionare il wafer modellato in un evaporatore metallico a fascio di elettroni. Deposita uno strato di cromo spesso 20 nanometri e uno strato d'oro spesso 80 nanometri sul wafer a una velocità di un Angstrom al secondo.

Quindi incidere il fotoresist sottostante riscaldando a ultrasuoni il wafer rivestito di metallo in acetone per 30 minuti a 40 kilohertz e 100% di ampiezza. Usa una sega per tagliare a cubetti il wafer in pezzi più piccoli secondo necessità. Per iniziare a fabbricare lo stampo del canale microfluidico, pulire e asciugare un wafer di silicio da quattro pollici allo stesso modo del wafer di borosilicato descritto in precedenza.

Metti il wafer di silicio in una centrifuga e applica quattro millilitri di soluzione di fotoresist negativo. Centrifugare il wafer a 500 giri/min per 15 secondi, quindi a 1.000 giri/min per 15 secondi e infine a 3.000 giri/min per 60 secondi. Posiziona il wafer a faccia in su su una salvietta per camera bianca imbevuta di acetone per rimuovere il fotoresist residuo dalla parte posteriore e dai bordi del wafer.

Infornate la cialda a 65 gradi per un minuto e poi a 95 gradi per due minuti. Posizionare un modello di maschera cromata per i canali microfluidici sul wafer asciutto. Esporre il fotoresist a una luce UV a 365 nanometri a 180 millijoule per centimetro quadrato e poi cuocere nuovamente il wafer a 65 e 95 gradi Celsius rispettivamente per uno e due minuti.

Posizionare il wafer modellato in un contenitore di rivelatore fotoresist e agitare delicatamente il contenitore per tre minuti. Sciacquare il wafer sviluppato in isopropanolo e asciugare il wafer sotto una corrente di azoto gassoso. Cuocere il wafer a 200 gradi Celsius per 30 minuti, quindi utilizzare un profilometro per verificare che il fotoresist del modello sia uniformemente spesso su tutto il wafer.

Mettere il wafer in un essiccatore sottovuoto insieme a 200 microlitri di triclorosilano in una capsula di Petri scoperta. Lasciare riposare il wafer nell'essiccatore con il triclorosilano per otto ore per silanizzare la superficie del wafer. Per iniziare l'assemblaggio del dispositivo, utilizzare del nastro adesivo per camera bianca per uso generico per fissare lo stampo per wafer di silicone in una piastra di Petri di 150 millimetri di diametro.

Aggiungere 50 grammi di una miscela 10 a uno di prepolimero di polidimetilsilossano alla piastra di Petri e degassare la miscela in un essiccatore sottovuoto per un'ora. Polimerizzare la miscela degassata a 65 gradi Celsius per almeno quattro ore. Usa un bisturi per ritagliare lo strato PDMS polimerizzato e poi stacca lo strato polimerizzato dallo stampo con una pinzetta.

Tagliare il PDMS a pezzetti. Perforare i fori del canale microfluidico di ingresso e uscita con un perforatore per biopsia. Posizionare il modello di strato PDMS a faccia in giù sul nastro trasparente per pulire la superficie microlavorata.

Sciacquare il substrato di vetro del cuscinetto dell'elettrodo precedentemente preparato con acetone, isopropanolo e acqua deionizzata. Asciugare il substrato sotto un getto di azoto gassoso. Posizionare lo strato PDMS e il substrato in un generatore al plasma RF impostato a 100 milliwatt con i lati della micromacchina rivolti verso l'alto.

Attiva le superfici della micromacchina nel plasma di ossigeno per 30 secondi. Quindi, utilizzare un microscopio ottico per allineare lo strato PDMS del modello con gli elettrodi di superficie. Una volta allineato, lasciare che le superfici entrino in contatto fisico per sigillare lo strato PDMS sul substrato di vetro.

È fondamentale che il modello dell'elettrodo di rivestimento sul substrato di vetro sia correttamente allineato con i canali microfluidici PDMS. Una volta allineata correttamente, l'interazione delle particelle con l'elettrodo di superficie genererà la forma d'onda del codice desiderata per il multiplexing. Cuocere il dispositivo assemblato a 70 gradi Celsius per cinque minuti, con il vetro rivolto verso il basso.

Infine, saldare i fili alle piazzole di contatto dell'elettrodo per completare l'assemblaggio del dispositivo. Per iniziare l'esperimento, posizionare il dispositivo microfluidico su un tavolino per microscopio ottico. Collegare l'elettrodo di riferimento del dispositivo alla porta di uscita del segnale di un amplificatore di blocco e applicare un'onda sinusoidale da 400 kilohertz.

Collegare gli elettrodi del sensore positivo e negativo a due amplificatori di transimpedenza indipendenti. Collegare entrambi gli amplificatori a transimpedenza agli ingressi di tensione differenziale dell'amplificatore lock-in con il segnale positivo del sensore da sottrarre dal segnale negativo del sensore. Collegare l'uscita del demodulatore dell'amplificatore lock-in a un'unità di acquisizione dati.

Nel software di acquisizione dati, impostare una frequenza di campionamento per l'uscita dell'amplificatore lock-in di 1 Megahertz. Imposta una telecamera ad alta velocità per registrare otticamente il funzionamento del dispositivo visto al microscopio. Aspirare una sospensione cellulare preparata in una siringa.

Fissare la siringa del campione in una pompa a siringa e collegare la siringa al canale di ingresso. Dirigere il canale di uscita verso un contenitore per rifiuti. Utilizzare la pompa a siringa per guidare la sospensione cellulare attraverso il dispositivo a una portata costante, registrando al contempo il segnale di modulazione dell'impedenza.

Dopo il completamento dell'esperimento, elaborare i dati elettrici con un software di analisi. Confronta il segnale elettrico elaborato con le immagini della telecamera ad alta velocità per creare una curva di calibrazione per le dimensioni delle celle. Una sospensione cellulare è stata fatta fluire attraverso un dispositivo sensore microfluidico con quattro modelli di elettrodi unici derivati da codici di sensori ortogonali.

Tutti e quattro i segnali dei sensori sono stati registrati da un'unica uscita elettrica. Il singolo sensore associato a ciascun segnale registrato è stato identificato dalla correlazione dei segnali del sensore registrati con tutti i codici possibili, che ha prodotto picchi di autocorrelazione chiaramente distinguibili. Le forme d'onda prodotte dai segnali interferenti provenienti dal rilevamento simultaneo di cellule in tutti e quattro i canali sono state risolte con un algoritmo iterativo.

Una forma d'onda registrata è stata correlata con tutti i codici possibili ed è stato identificato il picco di autocorrelazione più grande. Il segnale del singolo sensore corrispondente è stato ricostruito e sottratto dalla forma d'onda in ingresso. Il segnale residuo è stato passato all'iterazione successiva come input e il processo è continuato fino a quando il segnale residuo non ha prodotto picchi di autocorrelazione.

I segnali stimati sono stati perfezionati sulla base di un algoritmo di ottimizzazione che cerca il miglior adattamento tra le forme d'onda ricostruite e quelle originali registrate utilizzando l'approssimazione dei minimi quadrati. La posizione, le dimensioni e il tempo di attraversamento della cella sono stati quindi determinati dal numero di canale, dall'ampiezza, dalla durata e dalla tempistica relativa dei segnali stimati del sensore. La procedura è stata convalidata confrontando i segnali elettrici con le misurazioni ottiche della telecamera ad alta velocità.

Una volta padroneggiata, questa tecnica è molto facile da implementare, perché è molto semplice dal punto di vista dell'hardware. Non ha alcun componente attivo su chip. È direttamente compatibile con la litografia morbida e l'elaborazione del segnale si basa su un semplice algoritmo computazionale.

Seguendo questo protocollo, è possibile fabbricare chip microfluidici con sensori elettrici multiplex basati su codice e decodificare i segnali elettrici per la misura bioanalitica. Questa tecnologia di rilevamento elettronico versatile e scalabile può essere facilmente integrata in vari dispositivi microfluidici per realizzare saggi quantitativi tracciando temporalmente spaziale le particelle mentre vengono elaborate sul chip. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come progettare, fabbricare e implementare una tecnologia CODES microfluidica.