بروتوكول لعزل خلايا الكبد الإنسان الابتدائية والموافق السكان الرئيسية للخلايا الكبد غير متني

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال أمراض الكبد وعلم السموم، كما تتيح لنا الفرصة لتطوير نماذج جديدة من المزارع المشتركة في المختبر ونماذج الكبد المهندسة نسيجياً. وتكمن ميزة هذه التقنية الجديدة في القدرة على عزل جميع مجموعات خلايا الكبد من نفس المتبرع ومن نفس القطعة الصغيرة من نسيج الكبد. لبدء هذا الإجراء، قم بوزن نسيج الكبد المستأصل حديثاً تحت ظروف معقمة، ثم ضع عينة نسيج الكبد داخل غطاء التدفق الهوائي الصفائحي.

بعد ذلك، قم بتنظيف الدم عن سطح عينة النسيج. ثم، اغسل القنيات باستخدام محلول التروية واحد بتركيز 1X. استخدم غراء الأنسجة لتثبيت زيتونات القنيات في الأوعية الدموية الكبيرة.

ثم، اختبر التروية وتحقق من وجود أي تسريبات في القنيات. بعد ذلك، أغلق جميع الأوعية الدموية التي تسرب محلول التروية 1X الشفاف باستخدام صمغ الأنسجة. بعد ذلك، ضع عينة نسيج الكبد المكننة في قمع بوخنر.

بعد ذلك، اضبط معدل تدفق المضخة 연동ية (peristaltic pump) بين 7.5 و 14.6 milliters per minute، وذلك اعتماداً على عدد القنيات المستخدمة ومقاومة نسيج الكبد. قم بتروية النسيج حتى يتم غسل الدم بالكامل لمدة لا تقل عن 20 دقيقة وبحد أقصى 30 دقيقة. في بعض الحالات، قد يكون من الضروري إغلاق إحدى القنيات باستخدام مشابك بلاستيكية، أو زيادة الضغط الداخلي لمنطقة معينة عن طريق الضغط برفق على كبسولة الكبد باستخدام ملعقة مسطحة (spatula) لتحسين عملية التروية.

يشير التغير الكامل في اللون من الأحمر البني إلى البني الفاتح أو الأصفر الفاتح إلى حدوث تروية جيدة. بعد ذلك، استبدل سائل التروية بمحلول هضم يحتوي على collagenase P. ثم، أعد ترتيب التجهيزات لخطوة الهضم. تلى ذلك إجراء تدفق دائري لمحلول الهضم لمدة تصل إلى 15 دقيقة.

أوقف عملية التروية دورياً للتحقق من درجة الهضم. ومن الضروري إيقاف التروية بمحلول الهضم فوراً بمجرد هضم عينة نسيج الكبد بشكل كافٍ. أخرج الكبد من الجهاز عند جاهزيته وضعه في طبق زجاجي.

اشطف الجزء الخارجي من عينة النسيج باستخدام محلول الإيقاف (Stop Solution) المبرد بالثلج. قم بإزالة القنيات من عينة نسيج الكبد. بعد ذلك، استخدم مشرطاً لفتح عينة نسيج الكبد عن طريق إجراء شق في منتصف المنطقة التي كانت القنيات متصلة بها، مع التأكد من بقاء محفظة جليسون (Glisson's capsule) سليمة.

اشطف الجزء الداخلي من عينة النسيج، ثم غطِّ عينة النسيج بالكامل بمحلول الإيقاف (Stop Solution). بعد ذلك، رجّ النسيج برفق لتحرير الخلايا منه. ثم اجمع معلق الخلايا وقم بترشيحه عبر قمع شاش في 10 أنابيب بلاستيكية سعة 50-milliliter.

أضف المزيد من محلول الإيقاف (Stop Solution) إلى عينة نسيج الكبد حتى استهلاك حجم نهائي قدره 500 milliliters. بعد ذلك، قم بطرد خلية تعليق الخلايا مركزياً، واجمع السائل الطافي لعزل الخلايا غير الكبدية (NPC) لاحقاً، واجمع كرات الخلايا المترسبة في أنابيب بلاستيكية سعة 250 milliliters. ومن ثم، اغسل كرات الخلايا المترسبة باستخدام PBS.

للقيام بذلك، قم بطرد خلية معلق الخلايا مركزياً. اجمع السائل الطافي، وادمج الرواسب، ثم أعد تعليق الراسب في وسط تحضين الخلايا الكبدية. بعد ذلك، حدد عدد الخلايا وحيويتها في معلق الخلايا الناتج باستخدام صبغ Trypan blue.

لعزل خلايا الكبد غير المتنية، قم بطرد supernatant المجموع مركزياً للتخلص من كريات الدم الحمراء والخلايا الكبدية المتبقية. اجمع السوائل الطافية وقم بطردها مركزياً مرتين للحصول على كتل خلوية لترسيب HCS و LEC وجزء من KC و KC المتبقية. بعد ذلك، أعد تعليق الكتل في HBSS. ثم قم بتحضير تدرج كثافة بنسبة 25% و50% عن طريق خلط محلول تدرج الكثافة مع PBS من أجل عملية الطرد المركزي بتدرج الكثافة.

ضع محلول تدرج الكثافة بتركيز 25% بعناية فوق طبقة محلول تدرج الكثافة بتركيز 50%. بعد ذلك، ضع معلق NPC بعناية وببطء فوق طبقة محلول تدرج الكثافة بتركيز 25% لتحقيق فصل واضح بين الطبقتين. قم بطرد معلق الخلايا مركزياً باستخدام تدرج الكثافة دون توقف.

تقع خلايا NPC في المرحلة البينية بين طبقات تدرج الكثافة 25% و 50%. قم بشفط الخلايا الميتة وبقايا الخلايا من الطبقة العليا واجمع المرحلة البينية بعناية. بعد إجراء الطرد المركزي المزدوج، قم بإجراء عد للخلايا لـ KC وكُسر MPC.

بعد ذلك، يتم إجراء عملية طرد مركزي لجزء الخلايا النوكليوية والبروتوبلازمية (NPC) باستخدام خطوة الطرد المركزي المزدوج الموصوفة سابقاً، ثم يُعاد تعليق الـ NPC في وسط استزراع خلايا كبفر. يتم استزراع الجزء الذي يحتوي على خلايا كبفر (KC) في أوعية زراعة الخلايا البلاستيكية بكثافة 5 × 10⁵ من خلايا KC لكل سنتيمتر مربع. تُحضن مستنبتات خلايا KC لمدة 20 دقيقة في حاضنة رطبة عند 37 °C و5% carbon dioxide.

يجب أن تلتصق خلايا KC الأولية بالبلاستيك المستخدم في زراعة الخلايا خلال فترة زمنية قصيرة. بعد ذلك، يتم جمع السائل الطافي الذي يحتوي على خلايا NPC غير الملتصقة، والتي تتكون أساساً من خلايا LEC و HSC. ولفصل خلايا LEC عن خلايا HSC، ابدأ بعملية طرد مركزي للسائل الطافي.

بعد ذلك، اغسل الراسب باستخدام PBS. وبعد عملية الطرد المركزي الثانية، أعد تعليق الخلايا في وسط فصل الخلايا البطانية النجمية وقم بإجراء عد للخلايا لجميع الخلايا المتبقية. بعد ذلك، أعد تعليق 10 مليون خلية في واحد مليلتر من وسط فصل الخلايا البطانية النجمية.

بعد ذلك، أضف 20 µL من محلول الحجب من مجموعة MAX و 20 µL من حبيبات CD31 الدقيقة للوسم المناعي، ثم حضّن المعلق الناتج لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. لاحقاً، افصل LEC عن HSC وفقاً لما هو موضح في بروتوكول الشركة المصنعة لنظام max لفرز الخلايا المنشط مغناطيسياً وجمّع جزء HSC. استخلص خلايا LEC الموجبة لـ CD31 المحتجزة مغناطيسياً وعلقها في وسط زراعة الخلايا البطانية النجمية.

تظهر هذه الصور هنا مجموعات خلايا الكبد المعزولة المختلفة مباشرة بعد عملية العزل عبر رؤية مجهر تباين الأطوار. وتعرض هذه المجموعة من الصور الخلايا المعزولة والمستزرعة بعد 24 ساعة من الاستزراع. كما يظهر هنا التوصيف القائم على التألق المناعي لمختلف أجزاء الخلايا.

أظهرت خلايا PHH إشارات إيجابية للمؤشر الكبدي CK18 بعد 24 ساعة من العزل، وكانت خلايا KC إيجابية للمؤشر CD68 بعد 24 ساعة من العزل، بينما أظهرت خلايا LEC إشارات إيجابية لبروتين vimentin بعد 72 ساعة من العزل، وكانت خلايا HSC إيجابية لبروتين GFAP بعد 72 ساعة من العزل. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن نجاح عملية العزل يعتمد على الهضم الأمثل لعينة نسيج الكبد. وبعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يتكون لديك فهم جيد لكيفية التحكم في عملية الهضم وكيفية إجراء الفصل بالتدرج الكثافي، واللتين تمثلان الخطوات الحرجة في هذا الإجراء.

بعد تطوير هذه التقنية، مهدت الطريق للباحثين في مجال البحوث الطبية لاستكشاف الوظائف والأمراض الكبدية في المزارع الخلوية المستحدثة خارج الجسم ونماذج الكبد المهندسة نسيجياً.